טכניקות מעבדה אספטיים: העברות נפח עם טפטפות ו Micropipettors סרולוגיות

Summary

כאשר עובד במעבדה, חובה לצמצם מקורות זיהום. הטכניקה אספטי מתייחס נהלים המאפשרים העברה של תרבויות ריאגנטים תוך הימנעות ממגע עם משטחים לא סטריליים. בטפי להחדרת נוזלים סרולוגית ו micropipettors משמשים למדידת כמויות מדויקות מבלי להתפשר על עקרות של פתרונות המשמשים בניסויים.

Abstract

מיקרואורגניזמים נמצאים בכל מקום - באוויר, אדמה, גוף האדם, כמו גם על משטחים דוממים כמו ספסלים מעבדה ומקלדות מחשב. המצאות בכל מקום של חיידקים יוצר היצע רב של מזהמים פוטנציאליים במעבדה. כדי להבטיח את הצלחת הניסוי, מספר מזהמים על משטחים ציוד העבודה חייב להיות ממוזער. המשותף בין ניסויים רבים במיקרוביולוגיה טכניקות הקשורות מדידה והעברת תרבויות המכילים תאים חיידקיים או חלקיקים נגיפיים. כדי לעשות זאת בלי קשר לא סטריליים משטחים סטריליים או זיהום התקשורת דורש (1) הכנת סביבת עבודה סטרילית, (2) בדיוק ההגדרה ומדויק לקרוא מכשירים להעברת אספטי של נוזלים, ו (3) שצריך לתמרן מכשירים, תרבויות צלוחיות, בקבוקים צינורות בתוך שדה סטרילי. למידה הליכים אלה דורשת אימון ותרגול. בתחילה פעולות צריך להיות איטי ומחושב, ונשלט במטרה להיות עבור T אספטייםechnique להיות טבע שני כאשר עובדים על הספסל. כאן אנו מציגים את הפעולות למדידת נפח באמצעות בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות ו micropipettors בתוך שדה סטרילי נוצר על ידי מבער בונזן. הכרכים נע בין מיקרוליטר (μl) כדי מיליליטר (מ"ל), תלוי במכשיר שימוש. הנוזלים מועברים בדרך כלל כוללות מרק סטרילית או תמיסות כימיות, כמו גם תרבויות חיידקים ומניות הפאג. על ידי ביצוע הליכים אלה, התלמידים צריכים להיות מסוגלים:

• לעבוד בתוך השדה הסטרילי שנוצר על ידי להבה מבער בונזן.
• משתמשים בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות מבלי להתפשר על עקרות המכשיר.
• לשאוב נוזלים עם בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות, דווקא קריאת ספרים מכויל על ידי יישור המניסקוס שהוקמה על ידי נוזל על סימני סיום על פיפטה.
• לשמור על תרבות בקבוקים, צלוחיות, צינורות וכובעים שלהם סטריליים במהלך העברת נוזלי.
• זיהוי יישומים שונים עבור PIP סרולוגית פלסטיק לעומת זכוכיתettes.
• דיוק המדינה מגבלות micropipettors.
• להגדיר במדויק ובאופן מדויק כרכים על micropipettors.
• לדעת איך להשתמש נכון התחנה הראשונה והשנייה על micropipettor כדי לשאוב ולהעביר כמויות נכונות.

Protocol

1. להכין סביבת עבודה סטרילית

1. לפני התחלת כל הליכי עיקור בתחום העבודה שלך, לשטוף את הידיים היטב עם סבון חיטוי מים חמים.
   • הקפד מחדש לשטוף את הידיים כל פעם שאתה חושד שיש לך זיהום המניפולציה שלך.
2. נקה את כל החומרים שהצטברו אזור העבודה שלך על הספסל מעבדה. הסרת מראש לחלח חיטוי למחוק מן המכל ולנגב את האזור כולו. אפשר חיטוי להתאדות - לא למחוק יבש!
   • השתמש בחומרי חיטוי כמו אלכוהול (או אתנול isopropanol 70%) או תרכובות פנוליות (O-phenylphenol).
   • כדי למנוע aerosolization, או ייצור של ערפל עדין המכיל תאים חיידקיים, והתפשטות של חיידקים מזהמים, להימנע מחלק חומר חיטוי מבקבוק לחיץ.
   • התייבשות של מיקרואורגניזמים היא אחת הדרכים היעילות ביותר כדי לטהר משטחים.
   • גם אם מישהו עשה שימוש לאחרונה הספסל מעבדה העליון הספסל נמחקה למטה עם חומר חיטוי, תמיד מתחילים בזמן במעבדה על ידי מנגב את הספסל.
3. לאחר חיטוי התייבש לחלוטין, להשתמש מצת להדליק מבער בונזן. התאם את הלהבה כך חרוט כחול ניתן לראות במרכז הלהבה. הלהבה עכשיו לייצר זרם אוויר עולה, או זרם האוויר זרמים בה אוויר חם עולה למעלה מן האש (איור 1). ככל שעולים חום, מיקרואורגניזמים חלקיקי אבק נאלצים כלפי מעלה מאזור העבודה מיידית. לעבוד לאט, בזהירות, בכוונה בכל עת בתוך אזור זה נוצר על ידי מבער בונזן, המכונה שדה סטרילי. שמור על מבער בונזן במהלך ההליך כולו.
   • קצה הקונוס הכחול הוא החלק החם ביותר של הלהבה.
   • להיזהר לא להפריע אוויר עולה על ידי תנועות מהירות באופן דרמטי לשנות את AIR-זרמים סביב שולחן המעבדה. יצירת זרם אוויר עולה עם מבער בונזן מצמצם את האפשרות של מיקרואורגניזמים ואבק נופלים על הספסל או לתוך בקבוקים, צינורות פתוחים או צלוחיות באזור העבודה.
4. מסדרים את כל ציוד נדרש הליך על ספסל במעבדה ליד שדה סטרילי. ודא שכל החומרים מסומנים כראוי.
   • חומרים מתכלים עשויים לכלול בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות ו micropipettors, צינורות תרבות סטריליות, צלוחיות סטריליים, בקבוקי מדיה המכילים מרק, צינורות microcentrifuge סטריליים, טיפים micropipettor, מתלים עבור צינורות, תרבויות תא החיידק, ומניות הפאג.
   • התקשורת נוזלי יש לעקר ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות לפחות על ההגדרה נוזלים. כמויות גדולות יותר של התקשורת (> 1 ליטר) דורשים פעמים החיטוי יותר. Labware יש לעקר ב החיטוי ב 121 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות לפחות על כוח המשיכה (יבש) ההגדרה.
   • באופן כללי, פתרונות סטריליים ניתן לאחסן ב 4° C עד 5 חודשים. שים לב כי זמן האחסון פוחתת משמעותית עבור פתרונות המכילים רכיבים יציבים כגון אנטיביוטיקה - תמיד לבדוק את המלצות היצרן.

2. העברת נוזלים באמצעות טפטפות סרולוגיות

1. בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות באים בגדלים ואפשרויות רבות: פלסטיק או זכוכית, חד פעמי או לשימוש חוזר, מחובר או מנותק. אלו מכוילים לספק כרכים החל מ"ל 0.1 מ"ל ל 25.
   • גדלים נפוצים בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות הן 5 מ"ל, 10 מ"ל ו -25 מ"ל ויש להשתמש בהם להעברת נוזלים נקייה, של 0.1 מ"ל או יותר (לוח של איור 2). יש גם בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות גדולים יותר שיכולים לספק נפח של עד 100 מ"ל, עם זאת, המיקוד של פרוטוקול זה הוא על, טפטפות נפוץ יותר בגודל קטן יותר.
   • מראש מעוקרות בטפי להחדרת נוזלים עם תקע צמר גפן יש צורך מיקרוביולוגיה ותרבות ניסויים ברקמות. התוספת לא צריך להסיר אתp של פיפטה, אלא נועד לתפקד כמחסום בפני מילוי יתר פיפטה.
   • יישומים שונים דורשים בטפי להחדרת נוזלים פלסטיק לעומת זכוכית סרולוגיות. זכוכית דרוש ממסים אורגניים. או ניתן להשתמש בעת ביצוע BSL-1 ניסויים על גבי ספסל במעבדה. רק פלסטיק ניתן להשתמש בעת עבודה בארון biosafety עם BSL-2 אורגניזמים שבהם צורב בונזן לא ניתן להשתמש בהם. כמו כן, מומלץ פלסטיק לשמש עבור יישומים הכוללים העברת אגר מותכת.
   • בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות הם משני סוגים: TC ("להכיל") או TD ("לספק"). בטפי להחדרת נוזלים TC לספק את כל נפח, כולל טיפ, והוא חייב להיות "מפוצץ" או שטף כדי לקבל את נפח מסוים. בטפי להחדרת נוזלים TD מכוילים לעזוב טיפה בקצה זה לא צריך להיות מועברת. הקפד לבדוק את התווית על הגוף של טפטפת ליד ראש לברר איזה סוג זה (איור 3). הנפוץ ביותר הם בטפי להחדרת נוזלים TD, שהם מרץked עם טבעות כפולות בראש.
2. קח פלסטיק פיפטה סטרילית סרולוגית (נקרא גם פיפטה העברת נפחי) ובזהירות להסיר את שרוול הנייר בסוף עם תקע צמר גפן על ידי קילוף אותו כמו עור של בננה - אין להסיר את השרוול כולו, הגנה על קצה פיפטה אשר באים במגע עם הנוזל לעבור. לגעת רק את החלק העליון של פיפטה (מעל סימני סיום) עם הידיים.
   • אף פעם לא נכנס פתרון סטרילי עם טפטפת שימוש, גם אם בזהירות רבה נלקח לשמור את זה סטרילי.
   • בטפי להחדרת נוזלים זכוכית סרולוגיות מאוחסנים בדרך כלל מיכלי מתכת (לוח ב 'איור 2). שחרר את החלק העליון של המכל ואז בזהירות להסיר את הכובע, ואת האש את הקצוות הפתוחים של הכובע ואת מיכל. מניחים את המכסה כלפי מטה, על הצד, על הספסל חיטוי. הסר 1 פיפטה של ​​מיכל ידי החזקת אותו אופקית בעדינות מטלטל אותו כדי ראשי pipet 1 או 2TES לבלוט על סנטימטר וניתן תפס בקלות. להניח את המכל על צידו ולהסיר 1 פיפטה, אבל להיזהר לא לגעת בטפי להחדרת נוזלים אחרים מיכל. אין לגעת בקצה התחתון של פיפטה עם הידיים, ולהימנע ממגע של קצה עם לא סטריליים משטחים אחרים.
3. להטביע סיוע פיפטה כגון הנורה, משאבה, או אקדח בקצה העליון של פיפטה סרולוגית. הסר את שרוול הנייר פיפטה פלסטיק. החזק את הסיוע פיפטה ביד ימין.
   • אם באמצעות פיפטה מזכוכית, להעביר את השליש התחתון של הצינורית דרך הקונוס הכחול באש מבער בונזן שניות 1-3. סיבוב 180 מעלות פיפטה כשהוא עובר דרך האש. בטפי להחדרת נוזלים פלסטיק וצינורות לא ניתן להטו.
   • אם שמאלי, להחזיק את הסיוע פיפטה ביד שמאל ולבצע מניפולציות הבאות של בקבוקי תרבות וצינורות עם יד ימין.
   • זיהום נוטה להתרחש עם בטפי להחדרת נוזלים פלסטיק, כאשר נסיגה Inc הסופיהס של פיפטה מהשרוול משום עצה סטרילי בא במגע עם החלק של השרוול נגע בידיים שלך.
4. להסיר את מכסה הבקבוק המכיל התקשורת סטריליים. אין להניח את הכובע על הספסל המעבדה אבל להחזיק אותו בין הקמיצה ואת כף יד ימין תוך מניפולציה של סיוע פיפטה עם האגודל, האצבע והאמה של יד זהה (איור 4). מחזיק את הבקבוק בזווית 45 מעלות, להעביר את שפת הבקבוק דרך הלהבה של מבער בונזן, יצירת שדה סטרילי סביב בקבוק פתוח.
   • למרות להימנע הטובה ביותר, אם אתה חייב לשים את הכובע למטה, להניח אותו עם הפנים כלפי מטה על משטח לחיטוי. עם כובע הפונה למעלה, יש סיכוי גדול יותר של זיהום תנועת עצמים או ידיים, יצירת זרמי אוויר שגורמים מיקרואורגניזמים חלקיקי אבק לרדת אל פני השטח הפנימי של הכובע.
   • מטרת בוערים לא לעקר אבל כדי לחמם את פתיחת oF בקבוק וליצור הסעה זרמי האוויר למעלה מן הפתיחה (כלומר, זרם אוויר עולה). אוויר חם, העולה מסייע במניעת חלקיקי אבק ומזהמים אחרים מלהיכנס את הבקבוק.
   • שמור את המיכל סטרילית פתוחה זמן מועט ככל האפשר. חשוב לשמור את נקודות הכניסה של מיקרואורגניזמים הנישאים באוויר למינימום במהלך ההליך.
   • למנוע שיעול, התעטשות, דיבור, תנועה מכוונת אחרת תוך מכולות סטריליים פתוחים.
   • אף פעם לא עוברים ידיים ואצבעות מעל שדה סטרילי (כלומר בקבוקים פתוחים או צלוחיות, בתוך צינורות של פקקי בקבוקים) פעם אחת הם כבר עברו הלהבה מבער בונזן.
   • תמיד לעבוד עם אש פתוחה בעת פתיחת צינורות או בקבוקים סטריליים. לא צריך יותר צינור, בקבוק או בקבוק פתוח על הספסל בכל פעם. בוער צריך להיעשות מיד עם הפתיחה ממש לפני הסגירה צינורות, בקבוקים, צלוחיות.
5. הנח את קצה serological פיפטה לבקבוק המכיל התקשורת סטריליים ואז לשאוב או לשאוב דגימה בסביבה נקייה מחיידקים, מהבקבוק. השתמש סיוע פיפטה כדי לשלוט על זרימת המדגם אל פיפטה. דווקא לקרוא את נפח להיגרר פיפטה על ידי יישור המניסקוס נוצר בראש עמוד הנוזל סימני סיום על פיפטה מכויל (איור 5).
   • אל הפה PIPET! השתמש תמיד סיוע pipet (, משאבת הנורה, או אקדח).
   • שימו לב לרצף של מספרים כאשר קובעים את נפח להישאף. המספרים עשויים להיות מודפסים כדי להטות להיפך העליון, או להיפך, או לעתים קרובות פעמים בשני הכיוונים.
   • כאשר קוראים את עוצמת הקול, תמיד להחזיק אנכית פיפטה, בניצב לקרקע, ולהציג את המניסקוס נוזלי מת על בגובה העיניים.
   • בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות רק מדויקים כמו תוספת ניכרת הקטן ביותר, שהוא בדרך כלל 0.1 מ"ל במשך 5 מ"ל ו -10 מ"ל בטפי להחדרת נוזלים ו 0.2 מ"ל ל -25 מ"ל בטפי להחדרת נוזלים. אניF דיוק רב יותר יש צורך, פיפטה סרולוגית ניתן להשתמש בשילוב עם micropipettor.
6. להעביר את שפת הבקבוק דרך הלהבה מבער בונזן שוב, ואז למקם את הכובע לאחור על הבקבוק. הגדר את הבקבוק התקשורת בצד.
   • אל תשרוף את עצמך עם מבער בונזן ממהר לסגור את הבקבוק.
7. החזק מבחנה או בקבוק ביד שמאל. הסר והחזק את שווי כמתואר בשלב מס '4 לעיל. יצירת שדה סטרילי ידי בוערים שפת צינור או בקבוק של מבער בונזן.
8. לוותר התקשורת פיפטה לתוך צינור או בקבוק. לשלוט על זרימת המדגם, כך שהוא לא להתיז מתוך צינור או בקבוק.
   • הכרכים ניתן למדוד כך את עוצמת הקול כולו מועבר ו פיפטה מרוקן לחלוטין, או נפח מסוים מושגת על ידי ביצוע המסירה נקודה לנקודה (1 נפח סימון אחר).
9. להעביר את השפה של הצינור או הבקבוק דרך לשרוף בונזןאה להבה שוב, ולאחר מכן להחליף את הכובע. הגדר את צינור או בקבוק בצד. הסר את הסיוע פיפטה, וזורקים פיפטה לתוך כלי קיבול אשפה ראויה.
   • בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות פלסטיק הן חד פעמיות, בעוד זכוכית בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות ניתן לעקר והשתמשו שוב. סילוק נאות מחייב בטפי להחדרת נוזלים פלסטיק להציב המיועד מכשירים חדים מיכל (תיבת נוקשה ובו שקית פלסטיק לרשות) תוך בטפי להחדרת נוזלים זכוכית בתחילה צריך להיות שקוע בתוך מכולה עם פתרון אקונומיקה 10% לחטא את משטחי פנים וחוץ. אז בטפי להחדרת נוזלים את הזכוכית יש לשטוף ביסודיות עם חומר ניקוי במעבדה, שטפה עם מים מזוקקים, מעוקרים ו ב החיטוי.
10. צעדים אלה אותם יש לפעול כאשר יחסנו התקשורת עם התרבות חיידקי או מניות הפאג או בעת ביצוע דילולים סדרתיים.

3. העברת נוזלים באמצעות Micropipettors

1. דווקא מדידה מחלק כרכים דקות יכול להיות accompliשופכים באמצעות micropipettors (המכונה גם Pipetman: פאנל של איור 6). מכשירים אלו מגיעים בגדלים שונים לכל עם מגוון נפח מסוים: P2 עבור μl 0.2-2, P10 עבור μl 1-10, P20 עבור μl 2-20, 20-200 μl עבור P200, P1000 ו עבור μl 200-1000.
   • לטיפול micropipettors בזהירות, כפי שהם מכשירי דיוק. אל תשאירו אותם שוכבים על ספסל במעבדה ללא השגחה, שם הם יכולים להיות יחוסל נפגע. אל תאפשר בטפי להחדרת נוזלים לבוא במגע עם כימיקלים קורוזיביים.
   • עבור אמצעי אחסון גדול מ μl 1000, השתמש פיפטה סרולוגית.
   • למרות לעבוד בתחום סטרילי נוצר על ידי מבער בונזן, אל micropipettors בעירה, צינורות וטיפים פלסטיק. הצינורות וטיפים יש לעקר מראש. Micropipettors עשויים להימחק למטה עם חומר חיטוי מראש לח לנגב לפני השימוש.
2. Volumeter מספרי מראה נפח לוותר יכול להיות מוגדר על ידי סיבוב ידית התאמה. Adjusלא את עוצמת הקול לפני שתמשיך לשלב מס '3.
   • אף פעם לא סובבו את כפתור התאמה מעל הטווח מיועד!
   • כדי להשיג דיוק מרבי כאשר הפחתת הגדרת עוצמת הקול micropipettor, לאט לחייג את הגלגל האגודל, כדי לוודא שלא להחטיא את המטרה סימן הסיום.
   • כדי להשיג דיוק מרבי כאשר מגדילים את הגדרת עוצמת הקול micropipettor, לחייג את הגלגל האגודל מעלה, עובר את קו הסיום הרצוי על ידי 1/3 של תורה. ואז לאט לאט לחייג את הגלגל האגודל להגיע בנפח המיועד, כדי לוודא שלא להחטיא את המטרה סימן הסיום.

   Volumeter מראה שלושה מספרים. בהתאם micropipettor, המספרים הם פירושים שונים. שים לב כי כל micropipettor רק מדויקת ככל סימן הסיום הקטן ביותר.

   P2: עבור אמצעי אחסון μl בין 0.2-2.0. המספר הגבוה מציין נפח מיקרוליטר. Indicat מספר 2הגזע עשיריות microliter (0.1 μl), ומספר 3 מייצגת מאיות microliter (0.01 μl). כל סימן הסיום שווה תוספת של 2 חד אלפיות (0.002 μl) של microliter.

   P10: עבור אמצעי אחסון μl בין 1.0-10.0. המספר הגבוה הוא עשרות מיקרוליטר, זה בדרך כלל מוגדר על "0" וצריך להיות מוגדר רק ב "1" עם שני מספרים אחרים שנקבעו על "0" כאשר מחלק 10.0 μl. המספר האמצעי מציין נפח מיקרוליטר. מספר 3 מציין עשיריות microliter (0.1 μl). כל סימן הסיום שווה תוספת של שתי מאיות אחד (0.02 μl) של microliter.

   P20: עבור אמצעי אחסון μl בין 2.0-20.0. המספר הגבוה הוא שחור לעשרות מיקרוליטר, זה צריך להיות מוגדר רק על "2" עם שני מספרים אחרים שנקבעו על "0" כאשר מחלק 20.0 μl. המספר השני מציין בשחור נפח מיקרוליטר. מספר 3 באדום עולה 10ths של microliter (0.1 μl). כל סימן הסיום שווה תוספת של שתי מאיות אחד (0.02 μl) של microliter.

   P200: עבור אמצעי אחסון בין μl 20.0-200. המספר הגבוה הוא מאות מיקרוליטר, זה צריך להיות מוגדר רק על "2" עם שני מספרים אחרים שנקבעו על "0" כאשר מחלק 200 μl. המספר האמצעי מציין את נפח לוותר בעשרות מיקרוליטר, ומספר 3 מציין נפח מיקרוליטר. כל סימן הסיום שווה תוספת של שתי עשיריות אחד (0.2 μl) של microliter.

   P1000: עבור אמצעי אחסון μl בין 200-1000. המספר הגבוה הוא במשך אלפי מיקרוליטר, זה בדרך כלל מוגדר על "0" וצריך להיות מוגדר רק ב "1" עם שני מספרים אחרים שנקבעו על "0" כאשר מחלק 1000 μl. המספר האמצעי הוא מאות מיקרוליטר. המספר הנמוך הוא של עשרות מיקרוליטר. כל סימן הסיום שווה תוספת של שתי (2 μl) מיקרוליטר.

   • הביצועים לבדוק: אלו מכשירים יש לכייל מדי שנה, על מנת להבטיח דיוק ודיוק נשמרים להישאר בתוך 5% ± של מפרטים. השתמש בקנה מידה אנליטי למדידת מים, כדי לוודא את הגדרות המינימום והמקסימום מתאימות נפח המיועד. לדוגמה, השתמש P1000, להעברת 200 μl מים לצלחת לשקול על המאזניים. מאחר שלמים יש צפיפות של 1, אז 1 מ"ל של מים שווה גרם 1 (ז). כך, 200 μl (0.2 מ"ל) של מים צריך להיות שווה 0.2 גרם. כמו כן, ודא עצה לא לדלוף יכול לשמור על נפח רצוי עד לוותר באמצעות מערכת הבוכנה.
3. Micropipettors יש להשתמש עם טיפים חד פעמיים מפלסטיק בכל עת. התאמה עצה בחוזקה על סוף החבית של micropipettor. לחץ כלפי מטה ולסובב מעט כדי להבטיח חותם אטום.
   • טיפים ארוזים בדרך כלל בקופסאות פלסטיק ניתן לעקר על ידי מעוקר. פתיחת תיבת עצה כדי לאחזר עצה, ולאחר מכן לסגור את תיבת עצה כדי לצמצם מגע עם חומרים מזהמים באוויר.
   • טיפים מסוימים יש מסננים בדומה צמר אטמי כותנה על בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות. טיפים אלו הם בדרך כלל יקרים יותר טיפים רגילים ובכך משמשים ביישומים מיוחדים. למשל, כאשר מודדים כימיקלים נדיפים כגון כלורופורם או נוזלים רדיואקטיביים כגון DNA ^P-32 שכותרתו, באמצעות עצות סינון עוזר למנוע את קנה micropipettor מלקבל מזוהמים.
4. החזק micropipettor במצב אנכי.
   • שמירה על micropipettor זקוף ימנע נוזלים זורמים בתוך לזהם את קנה micropipettor.
5. Micropipettor יש שלושה תפקידים: (1) מיקום נוח, (2) תחנה ראשונה, ו - (3) התחנה השנייה (איור 6, לוח ב '). מכשיר יש מערכת 2-stop הבוכנה. התחנה הראשונה יש שתי פונקציות. הראשונה היא למשוך בהיקף הרצוי של נוזל לתוך whe עצהn לשחרר את הבוכנה מתחנת 1 למצב מנוחה. הפונקציה השנייה היא לוותר על רוב הנוזל מקצה מדכא כאשר הבוכנה ממצב מנוחה עד לעצירה הראשונה. יתר על כן מדכא את הבוכנה dispenses התחנה השנייה מה נוזל נשאר בקצה.
   לדכא לחיץ על הבוכנה ממצב מנוחה עד לעצירה הראשונה. האוויר שווה לנפח של הגדרה ייעקרו ממקומם.
6. לטבול את קצה לתוך הנוזל תוך לחיצה רצופה על לחיץ לתחנת 1.
   • אל תיגע micropipettor עצמו לצדדים של בקבוקים, צינורות עגולים ושטוחים, אחרת את המשטח הפנימי של הכלים האלה יהיו מזוהמים. רק עצות הם סטריליים.
7. שחרר את לחיץ לאט כדי לשאוב את הנוזל אל קצה. עצור פעם לחיץ הוא בחזרה למצב מנוחה. חכה רגע כל כך נוזלי יכול להיגרר עצה.
   • נפח הנוזל בקצה יהיה שווה את נפח Oו הגדרה של micropipettor.
   • נוזלים צמיגה כמו גליצרול אלה המכילים דורשים זמן רב יותר להיכנס עצה.
8. הסר את הקצה של הנוזל, וכן לבדוק ראייה עצה כדי לאשר את הנוזל שנערך הגיע לרמה הצפויה עצה ואין בועות אוויר עצה.
   • במידת הצורך, לגרש את הנוזל באופן ידני להדק את העצות על גבי micropipettor. להכין את הנוזל ולבדוק שוב.
9. הנח את קצה בזווית (10 ° עד 45 °) על הקיר של הצינור לקבל את הנוזל. לגרש את הנוזל, לאט לדכא לחיץ על הבוכנה עד לעצירה הראשונה. חכה רגע ולאחר מכן לחץ על לחיץ לתחנת 2 לגרש כל נוזל שיורי בקצה.
   • מדכא הבוכנה מהר מדי עלול לגרום לנוזל שגורשו כדי להתיז או ייצרו בועות לא רצויות בצינור.
10. לפני שחרור הבוכנה למצב מנוחה, שובלהזיז את קצה מנוזל.
11. מחק טיפים מכשירים חדים לתוך מיכל המיועד פסולת על ידי לחיצה על לחצן פליטה על micropipettor.

4. לנקות את שטח העבודה

1. בסיום בניסוי הדורש שימוש בטכניקה מזוהם, כבה את מבער בונזן, ואז לשים את כל ציוד ו חומרים כימיים. נגבו את פני השטח החיצוניים של labware (בקבוקים, micropipettors, פיפטה תיבות TIP) עם חומר חיטוי מראש לח לנגב כדי להבטיח מזהמים לא יועברו למיקום אחסון.
2. המקום מזוהם זכוכית וחומרי פסולת מסוכנת לתוך כלי קיבול לסילוק נאות. פסולת מעבדה כולל כזה labware כמו כפפות, טפטפות, טיפים, וצינורות. הלא זיהומיות פסולת מסוכנת נוצרת בעת ביצוע ניסויים עם פתוגניים שאינם אורגניזמים (BSL-1) תוך פסולת מסוכנת מדבקת נוצר בעת שימוש אורגניזמים פתוגניים (BSL-2 ומעלה). פסולת זיהומית חייב להיות befor autoclaved או חיטוידואר שהיא נמחקת. עקוב בטיחות מעבדה ההנחיות המתוארות בסעיף BMBL (5 ^th ed.), כמו גם אלו המתפרסמים בריאות הסביבה OSHA ומוסדיים מחלקות בטיחות.
3. נגב את אזור העבודה כולו על הספסל עם המעבדה מראש לחלח חיטוי למחוק מן המכל, שוב המאפשר חיטוי להתאדות.
4. לשטוף ידיים ביסודיות עם סבון חיטוי מים חמים לפני שעזב את המעבדה.

5. נציג תוצאות

יישום לדוגמה עבור משתמש בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות להעביר נוזלים מוצג באיור 7. בטפי להחדרת נוזלים אלה לעתים קרובות משמשים המעבדה למיקרוביולוגיה להכין את המדיה עבור חיסון עם תרבויות חיידקים. לדוגמה, צלוחיות סטריליים 1 מלאים נפח המצוין של מרק תרבות, במקרה זה מרק לוריא (LB), אז מספר קטן של תאים (כגון E. coli) מתווספים לתקשורת. שימוש עמ 'סרולוגיתipette, 1 מרק יש להעביר בסביבה נקייה מחיידקים, מהבקבוק מדיה הבקבוק. במקרה זה, 25 מ"ל של LB נוסף בבקבוק סטרילי 125 מ"ל בעזרת פיפטה 25 מ"ל סרולוגית. לאחר מכן, מרק חייב להיות מחוסן עם א ' קולי תאים. כאן, 10 μl של תאים הועברו בסביבה נקייה מחיידקים, באמצעות micropipettor P20 מתוך בקבוק התרבות גדל בעבר 25 מ"ל של LB טרי. הבקבוק הוא מודגרות בתא הגידול בסכום מסוים של זמן, מה שמאפשר לתאים לשכפל (בדוגמה זו, התאים החיידק היו מודגרות לילה על פלטפורמה רועדת על 37 מעלות צלזיוס). התוצאה היא תרבות עכור תא החיידק, שניתן להשתמש בהם לניסויים הבאים.

בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות גם יכול לשמש כדי להעביר את התקשורת שסופקו במקור בבקבוק כדי מבחנות, או בין מבחנות, כפי שנעשה בעת ביצוע דילולים של התרבות חיידקים. אם הטכניקה aseptic לא נשמר לאורך כל סוגי מניפולציות התקשורת אז התרבויות יהפוך מזוהמים, וניסויים הבאים באמצעות אלה תרבויות יעוכב בשל טריים, תרבויות שלא נוגעו צריך להיות מוכנים. טעויות מתרחשות בגלל שדה סטרילי לא נשמר לאורך כל ההליך. למשל, אתה יכול לשכוח לחטא את הספסל מעבדה או להבה ושפה של בקבוק תרבות או צינור. אתה יכול לגעת בקצה הצינורית או להגדיר את שווי בקבוק או מבחנה על הספסל במקום להחזיק אותו ביד. ההליך הנכון הוא קריטי לשמירה על זיהום התקשורת ותרבויות למינימום. איור 8 א דוגמה של התרבות טהור לעומת מזוהמים של א ' coli ב שפופרת המכילה 5 מ"ל של LB. הלוח השמאלי מציג את התרבות הצגת עכירות בסדר אחיד אופייני ה טהור coli התרבות. לעומת זאת, הפאנל הימני מראה התרבות מזוהמים שבהם המאפיינים הצמיחה לסטות אלה צפוי מתח זה חיידקי.

"> טעויות טכניות עלולה להתרחש כאשר מניפולציה סרולוגיות בטפי להחדרת נוזלים וכתוצאה מכך העברת כמויות נכונות של התקשורת בין מבחנות. למשל, תוכל לקרוא את עוצמת הקול פיפטה באופן שגוי (כלומר, למעלה לעומת התחתון של המניסקוס) או שאתה יכול לגרש את התקשורת לחלוטין פיפטה TD, אשר תוכנן לצאת טיפה בקצה לא יועברו. בעת ביצוע המסירה נקודה לנקודה של התקשורת, אתה יכול להשתמש בסימני כיול הלא נכונים לוותר נפח שגוי. 8B איור מראה דוגמה מבחנות עם כמויות נכונות לעומת נכונה של המדיה. צינור בצד שמאל מכיל 3.5 מ"ל של LB נמדד עם פיפטה 5 מ"ל סרולוגית. הסטודנט שנערך משלוח נקודה לנקודה של התקשורת שבו LB הוכנה לציון סיום הלימודים 5.0 מ"ל ו לוותר על הגובה 1.5 מ"ל. צינור בצד ימין מכיל 2.5 מ"ל של LB נמדד עם טפטפת באותו גודל כי התלמיד שביצע את המסירה נקודה לנקודה של התקשורת אניncorrectly לוותר עליו מפני סימן 5.0 מ"ל לציון 2.5 מ"ל. טעות זו תגרום התרבות חיידקי שיהיה בריכוז גבוה יותר מהמתוכנן, וגרם דילולים הבאים להיות שגוי. זה התפשטות של שגיאות יכול לגרום הניסוי נכשל כי היה צריך לחזור עם ריכוזים סלולריים הנכונות.

יישום לדוגמה עבור משתמש micropipettors להעביר נוזלים מוצג באיור 9. Pipettors אלה משמשים עבור מגוון רחב של ניסויים בביולוגיה מולקולרית ומיקרוביולוגיה כולל הכנת דוגמאות ל-PCR ו אלקטרופורזה בג'ל או יחסנו התקשורת סטריליים או בולם עם כמויות קטנות (פחות מ 1.0 מ"ל) של תאים חיידקיים או חלקיקים הפאג. בדוגמה המוצגת, התלמיד הועבר 12.5 μl מאגר TE לתוך צינור microcentrifuge 1.8 מ"ל (הצינור השמאלי בפאנל: לב צבע נוספה למאגר כדי להקל על ויזואליזציה של הנוזל בתוך הצינורות microcentrifuge ברורים).הליך זה נדרש התלמיד 1 כדי לבחור את micropipettor הנכון, במקרה זה P20, וליד הגדר volumeter אמצעי האחסון הנכון (לוח ב '). עצה שימש המכילה צמר גפן תקע בסוף כדי למנוע זיהום אפשרי, כי יכול להיות מגורש מן החבית של micropipettor להגיע מדגם חיץ בקצה. אמצעי זהירות זה אינו נחוץ אם הטיפול נלקח כאשר aspirating נוזלים לתוך העצות, מדכאת את הבוכנה לאט כל כך הנוזל לא להתיז לתוך חבית pipettor. טעויות טכניות עלולות להתרחש כי התוצאה של העברת כמויות לא נכונות. לדוגמה, תוכל לבחור micropipettor נכון לתפקיד או להגדיר את volumeter על micropipettor הנכונה נפח שגוי. לפני לטבול את קצה למאגר, ניתן לדחוף את הבוכנה בעבר בתחנה הראשונה, גורם עודף של חיץ להיגרר עצה כאשר משחררים את הבוכנה. לחלופין, ייתכן שלא לטבול את קצה רחוק מספיק למאגר, כך שהאוויר נשאבאל קצה במקום למאגר. אתה יכול לשכוח לדחוף את הבוכנה לתחנת 2 כאשר מחלק חיץ לתוך הצינור microcentrifuge גורם פחות נפח הרצוי להשתחרר עצה. הצינור הימני בהרכב של איור 9 מראה צינור microcentrifuge המכיל נפח נכונה של המאגר ביחס צינור בצד שמאל. במקום לחלק 12.5 μl של המאגר, התלמיד חילק 125 μl. במקרה זה, אם כי המספרים נקבעים באופן זהה על volumeter, micropipettor הלא נכון נבחר לתפקיד (התלמיד להשתמש P200 במקום P20: לוח ב ') וכתוצאה מכך משלוח של נפח גדול יותר באופן משמעותי של המאגר. אם פתרון זה היה בשימוש כדי להכין תערובת של חומרים כימיים עבור יישום כגון PCR, אז טעות זה ישתנה הריכוז הסופי של כל ריאגנטים שתצטרף בעתיד הצינור אותו דבר. כתוצאה מכך, אין זה סביר כי הניסוי יהיה מוצלח, שכן הליכים כגון ביולוגיה מולקולריתכמו PCR דורשים כל הרכיבים להיות בריכוזים מסוימים של התגובה לעבוד כמו שצריך.

כי זה לא תמיד אפשרי כדי להבטיח micropipettors (במיוחד את החלק הפנימי של החבית) הם סטריליים, פתרונות המניות יכולים להזדהם ולגרום אפילו המאמצים לפתרון בעיות כדי להיכשל בעת ביצוע הניסויים. אם אתה משתמש micropipettors להעביר פתרונות סטריליים, זה מומלץ מאוד aliquots של פתרונות מניות (מדיה, מאגר מים) להתבצע באמצעות טכניקה אספטי עם בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות. נהוג לשמור על עבודה פתרונות מניות ב 15 מ"ל או 50 מ"ל צינורות חרוטי סטריליים. אלה הם בדרך כלל יותר קל לתמרן בזמן ההפעלה micropipettor והוא יכול להיות מוחלף עם aliquot חדשה של פתרון המניות אם מזוהמים במהלך העברת נפח.

באיור 1. בשדה סטרילי נוצר על ידי זרם אוויר עולה הלהבה מבער בונזן. כדי המזעריimize זיהום של פתרונות ותרבויות סטריליים, זה קריטי, כי כל המניפולציות להתנהל בתוך שדה סטרילי. שפת התרבות צינורות זכוכית עגולים ושטוחים יש עבר קצה קונוס כחול, החלק החם ביותר של הלהבה. צינורות פלסטיק עצות לא ניתן להטו - אלה יש לעקר מראש על ידי שיטות חלופיות לפני השימוש.

באיור 2. בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות המשמש להעברת אספטי של נוזלים. (א) מוצג משמאל לימין הם ציורים של 25 מ"ל, 10 מ"ל, ו -5 טפטפות מ"ל. (ב) בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות יכול להיות פלסטיק או זכוכית. בטפי להחדרת נוזלים פלסטיק הן חד פעמיות (חד פעמי שימוש), ובדרך כלל מזוהים אישית בשרוולים נייר ופלסטיק, שבו כל המשטחים בפנים יש סטרילית (צד שמאל). בטפי להחדרת נוזלים זכוכית ניתן להשתמש מספר פעמים בתנאי שהם ניקה לעקר בין משתמש, אלה בדרך כלל מאוחסנים מיכלי מתכת (מימיןצד).

. איור 3 בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות הם משני סוגים: TC ("להכיל") או TD ("לספק"). שתופיע היא תווית ההסבר של פיפטה 5 מ"ל TD.

איור 4. טכניקה אספטי. כאשר aspirating נוזלים מבקבוק, הבקבוק, או צינור עם כובעים, אף פעם לא להניח את הכובע על הספסל. במקום זאת, מחזיקים את המכסה ביד כמו סיוע פיפטה תוך מניפולציה של כלי המכיל נוזל עם היד הנגדית כפי שמוצג.

איור 5. המניסקוס שנוצר כאשר ציור נוזל לתוך פיפטה סרולוגית. נפח מתאים בסימן סיום הלימודים על פיפטה שבו החלק התחתון של המניסקוס מיישרת. בדוגמה זו, המניסקוס מתיישר עם 2.5 מ"ל gradua tion מארק.

איור 6. Micropipettor ערוץ אחד. (א) שתופיע היא micropipettor המדגם עם קצה פלסטיק מחובר אל החלק התחתון של בעל קצה לחבית. הם ציינו את מיקומם של volumeter, גלגל אצבע לשינוי ההגדרה volumeter, בעל קצה הקנה, לחצן עצה מפליט, ואת לחיץ על הבוכנה. (ב) דו להפסיק מערכת הבוכנה על micropipettor.

איור 7. שימוש בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות להעביר את התקשורת לתוך צלוחיות סטריליים 125 מ"ל. הבקבוק השמאלי יש 25 מ"ל של התקשורת בלבד (LB), ואילו את הבקבוק הנכון היא תרבות של א ' coli הנובעות יחסנו LB עם תאים ואז דוגרים לילה ב 37 מעלות ג שים לב איך התקשורת הבקבוק בצד ימין הוא לעכור עקב צמיחת תאים.

ה 8 "src =" / files/ftp_upload/2754/2754fig8.jpg "/>
איור 8. שימוש בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות להעביר את התקשורת לתוך מבחנות סטריליות. (א) צינור השמאלי מכיל 5 מ"ל של ה טהור תרבות coli, ואילו צינור הזכות מכיל 5 מ"ל של תרבית תאים מזוהמים חיידקי. הערה ההבדלים במאפייני הצמיחה בין שתי התרבויות. למרות שגם הם עכור, תרבות מימין כבר מזוהם עם פטריות או מיקרואורגניזמים אחרים הנישאים באוויר לתת תרבות עקביות צבע שונה מזה הצפוי א ' קולי תאים. (ב) צינור תרבות השמאלי מכיל 3.5 מ"ל LB תוך הצינור הנכון מכיל רק 2.5 LB מ"ל. זה ההבדל בנפח נובע טעות עשה בעת ביצוע המסירה נקודה לנקודה של התקשורת צינורות.

איור 9. מנצליםmicropipettors גרם להעביר למאגר לתוך צינורות microcentrifuge סטריליים. (א) צינור microcentrifuge שמאל מכיל רק 12.5 μl של TE חיץ, תוך צינור הזכות מכיל 125 μl. שים לב כי צבע נוספה למאגר כדי להקל על ויזואליזציה של הנוזל בתוך הצינורות microcentrifuge ברורים. (ב) volumeter השמאלי הוא מן micropipettor P20, בעוד volumeter הנכונה היא מן micropipettor P200. טעות נפוצה היא בחירת micropipettor הלא נכון. למרות המספרים נקבעים באופן זהה על P20 ו P200 volumeter, מבחר תוצאות micropipettor לא נכונים העברת כמויות לא נכונות.

איור 10. זרימה למינרית מכסה המנוע כדי למנוע זיהום של פתרונות ותרבויות. הוא מוצג ארון בטיחות ביולוגית שאושרה לעבודה עם BSL-2 אורגניזמים.

Discussion

הטכניקה אספטי מתייחס למערכת של נהלים שגרתיים לעשות כדי למנוע פתרונות סטריליים ותרבויות מלהפוך מזוהמים על ידי מיקרואורגניזמים לא רצויים במעבדה. טכניקות אלה חיוניים לניסויים הדורשים התאים גוברת. אף על פי הגדרת העבודה כי הוא סטרילי לחלוטין לא ניתן להשיג, נהלים כגון חיטוי משטחים מעבדה, יצירת שדה סטרילי באמצעות מבער בונזן, הגבלת החשיפה של תרבויות התקשורת הסיר את המיכסה לאוויר, עיקור חומרים כגון בקבוקים, צינורות טפטפות זכוכית, ועל הימנעות ממגע של מכשירים סטריליים עם לא סטריליים משטחים מפחית את האפשרות של זיהום פתרונות ותרבויות בניסוי. המטרה היא נהלים אלה זהירות להפוך לטבע שני, זה מגיע עם הכשרה בפועל תוך כדי עבודה במעבדה.

נפח העברות עם פתרונות ותרבויות סטריליים באמצעות מכשירים כגון בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות ו מיקרופוןropipettors הם אחד סוגים רבים של טכניקות שגרתיות שנעשו במעבדה. יישומים ניסיוניים שונים דורשים מכשירים המסוגלים להעביר שונים, כמויות מדויקות עדיין ומדויק. בטפי להחדרת נוזלים סרולוגיות משמשים במיקרוביולוגיה מעבדות להכנת תרביות תאים הדורשים הכנות מדיה מעורבים כרכים למיליליטר, ואילו micropipettors חיוניים ניסויים בביולוגיה מולקולרית, כי צריך כמויות רק microliter של פתרונות. כאשר טכניקה אספטי הוא התאמן עם מכשירים אלה, זיהום ממוזער במהלך העברת נפח ללא קשר לכמות של נוזל או סוג של ניסוי.

אמנם לא דנו בפרוטוקול זה, אחד באמצעים אחרים נפוצים על מנת למנוע זיהום היא לעבוד בתוך ברדס למינרית הזרימה (איור 10). ציוד זה הוא קריטי עבור התרבות רקמות ניסויים שבוצעו עם מיקרואורגניזמים המסווגים BLS-2 ומעלה. מכסה המנוע זרימה למינרית מכיל (HEPA יעילות גבוההחלקיקי האוויר) מסנן מסיר חומרים מזהמים הנישאים באוויר מן האוויר זורם לתוך מכסה המנוע תוך מניעת בלי פילטר אוויר מהחדר מ המחלחל סביבת העבודה. ראוי לציין, מבער בונזן לא ניתן להשתמש בו בתוך מכסה המנוע זרימה למינרית בגלל החום מהאש משבש את זרימת האוויר חיוני לפעולה התקינה של מכסה המנוע.

זה בדרך כלל מועיל כדי לבדוק את איכות הטכניקה aseptic שלך בעת ביצוע הניסויים. כדי לאשר את פתרונות התקשורת והתרבות לא מקבלים מזוהמים במהלך המניפולציה, תמיד להכין בקרת שלילית. לדוגמה, אם הכנת צינורות של מרק לצמיחה של תרבויות חיידקים, לא לחסן 1 ולהשאיר רק צינור התקשורת סטריליים. דגירה בינוני לצד צינורות מחוסן ואז לבדוק את צינור השליטה uninoculated סימנים של זיהום כגון עכירות מן הצמיחה של תאים לא רצויים שהוכנסו בטעות לתוך הצינור. אם הצינור השליטה מזוהם, שפופרת הניסויסביר להניח מזוהמים גם כן, הניסוי יהיה צורך לחזור. אמצעים אלה זהירות צריך להיעשות בכל ניסוי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
LB מרק	Difco	244620	מתכון זמינה גם התייחסות 6
TE חוצץ:
EDTA הרכב: dihydrate מלח	סיגמא	E5134
Trizma-HCl	סיגמא	T-3253
CiDecon	Decon Laboratories, Inc	8504	מחטא
אתנול	פישר סיינטיפיק	A406	לשימוש חומר חיטוי, להכין 70% (V / V) עם מים מזוקקים