HLA-איג בהתבסס Antigen תאים מלאכותיים הצגת עבור יעיל לשעבר vivo הרחבת CTL האדם

Summary

שיטה חדשה DC עצמאית לזירוז והרחבה של אנטיגן ספציפי לערמונית בתאי T מתואר. HLA-A2 איג תאים מלאכותיים הצגת מבוסס Antigen (aAPC) נטענים עם HLA-A2 פפטידים מוגבלת ביעילות להרחיב CTL הספציפיות אנטיגן מגוונים. טכנולוגיה זו מחזיקה פוטנציאל גדול עבור חיסוני CTL מבוססי המאמצת.

Abstract

CTL עם תפקוד אופטימלי מפעיל ממלאים תפקידים קריטיים בתיווך הגנה מפני זיהומים וסרטן תאיים שונים. עם זאת, אנשים יכולים להפגין microenvironment החיסונית ואת מדכאים, בניגוד להפעלת CTL, תאים עצמיים שלהם בהצגת אנטיגן עשויה נוטים tolerize או anergize CTL אנטיגן ספציפי. כתוצאה מכך, אם כי עדיין בשלב ניסיוני, CTL מבוסס חיסוני המאמצת התפתח להיות טיפול מבטיח למספר מחלות שונות כגון סרטן וזיהומים וירוס. בניסויים הראשונים לשעבר vivo מורחבת CMV (ציטומגלווירוס) CTL הספציפיים שימשו לטיפול זיהום CMV ב immunocompromised allogeneic מח העצם להשתלה בחולים. אמנם מקובל להיות מסכני חיים viremia CMV בחולים אלו, אף אחד מהחולים שקיבלו מורחבת CTL לפתח מחלות הקשורות CMV, רומז החסינות נגד CMV הוא הוקם על ידי CTL הועבר adoptively ^1. תוצאות מבטיחות גם נצפתה למלנומה וניתן להרחיב סוגים אחרים של סרטן ^2.

אמנם יש דרכים רבות לשעבר vivo לעורר ולהרחיב CTL אדם, גישות הנוכחי מוגבלים ע"י המגבלות עלות וטכני. לדוגמה, תקן הזהב הנוכחי מבוסס על שימוש של DC עצמיים. זה דורש כל מטופל לתרום מספר משמעותי של לויקוציטים, והוא גם יקר מאוד מייגע. יתר על כן, אפיון מפורט במבחנה של DC מורחבת CTL גילה כי אלו לא טובים רק פונקציה מפעיל ^3.

כאן אנו מציגים שיטה היעילה ביותר מבוסס aAPC להרחבת vivo לשעבר של CTL CMV אדם ספציפי חיסוני המאמצת (איור 1). AAPC נעשו על ידי צימוד בגודל תא חרוזים מגנטיים עם דימר האדם HLA-A2-איג ואנטי CD28mAb ^4. לאחר aAPC נעשים, הם יכולים להיות עמוסה פפטידים שונים של עניין, ולהישאר תפקודית במשך חודשים. בדו"ח זה, aAPC עמוסות פפטיד דומיננטי מ-CMV, pp65 (NLVPMVATV). לאחר culturing מטוהרים האדם CD8 ⁺ CTL מתורם בריא עם aAPC במשך שבוע אחד, CMV CTL הספציפיים ניתן להגדיל באופן דרמטי סגוליות עד 98% (איור 2) ו - מוגבר פי יותר מ -10,000. אם יותר CMV-CTL ספציפיים נדרשים, להתרחבות נוספת יכולה להיות מושגת בקלות על ידי גירויים חוזרים עם aAPC. אפיון פנוטיפי ופונקציונלי מראה תאים אלה מורחבת יש פנוטיפ זיכרון מפעיל, ולעשות כמויות משמעותיות של שני TNFα ו IFNγ (איור 3).

Protocol

1. ביצוע, HLA-A2-איג מבוסס aAPC

1. הכן חיץ borate סטרילי
   1. ממיסים חומצת בור מים כדי להפוך 0.1M. התאם את ה-pH ל 7.0.
   2. סינון דרך המסנן בחנות סטרילי 0.22μm ובו 4 ° C.
2. הכן לשטוף סטרילי חיץ ביד
   1. קח 956ml PBS w / o מגנזיום או סידן.
   2. הוסף 30 מ"ל האדם א.ב. בסרום.
   3. הוסף EDTA בריכוז 2mm הסופי.
   4. הוסף 0.1gsodium אזיד.
   5. סינון דרך פילטר סטרילי 0.22 מיקרומטר ולאחסן ב 4 ° C.
3. קח 1ml של Invitrogen M-450 חרוזים אפוקסי מן המניות, כ -400 מיליון חרוזים (חרוזים ניתן לספור על ידי hemocytometer), ולשים לתוך צנצנת סטרילית, בראש הבורג זכוכית.
4. שים את הבקבוקון נגד מגנט Dynal MPC-1, בעוד החרוזים לדבוק בצד של הבקבוקון, להסיר את supernatant על ידי שאיפה. לשטוף חרוזים פעם עם 1ml של חיץ borate.
5. חרוזים Resuspend בתערובת של חיץ borate 1ml ו -20 מיקרוגרם של HLA-A2-איג דימר ו -20 מיקרוגרם של אנטי אנושי CD28 מב (Clone 9.3).
6. חלבון הצמידה חרוז: לשים את בקבוקון זכוכית על הכתף וסיבוב על 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות.
7. מניחים את הצינורית מגנט MPC 1-ולהסיר את כל חיץ borate.
8. שטפו את החרוזים פעמיים עם חיץ ביד 1ml לשטוף.
9. דגירה חרוזים במאגר 1ml לשטוף ביד, לסובב ב 4 מעלות צלזיוס למשך 24 שעות. בגלל החיץ לשטוף ביד האדם מכיל א.ב. בסרום, זה יהיה לחסום את כל האתר חלבון שיורית מחייבים החרוזים.
10. הסר את supernatant מתוך בקבוקון זכוכית, להחליף עם חיץ לשטוף 1ml טרי ביד.

2. בקרת איכות של aAPC ו פפטיד טעינה, אחסון

1. הוסף את ~ 5 × 10 ⁵ חרוזים FACS 100μl כביסה חיץ צינורות FACS, ואת הכתם עם 1μl של אנטי עכבר IgG1-PE (מכירים את החלק Fc של HLA-A2-איג) ו 1μl של אנטי עכבר IgG2a-FITC (להכיר החלק Fc של אנטי CD28 מב). לאחר מכתים במשך 20 דקות ב FACS כביסה חיץ, לשטוף שוב לקרוא את התוצאה מכתים מיד cytometer זרימה (איור 4).
2. טעינת פפטיד על החרוזים: לשטוף את החרוזים פעמיים בקבוקון זכוכית עם 1ml סטרילי PBS. Resuspend עם 1ml סטרילי PBS ולאחר מכן להוסיף 10μl של CMV פפטיד (1mg/ml)
3. הרוזן חרוזים ידי hemocytometer, ואת התווית בקבוקון עם תאריך וריכוז.
4. aAPC מוכנים לשימוש לאחר לפחות 3 ימים דגירה פפטיד ב 4 ° C, כדי לאפשר זמן מספיק מחייב פפטיד על דימר HLA-A2-איג. החרוזים ניתן לאחסן 4 ° C ולהישאר תפקודית למשך חודש לפחות 6.

3. בידוד האדם CTL

1. איסוף ~ 100 מ"ל של דם היקפיים טרי מתורם HLA-A2 בריא חיובית לתוך 10 הפרין BD צינורות נתרן Vacutainer. שימוש במחט 21-מד או יותר כדי למנוע המוליזה.
2. צנטריפוגה ב 300xg במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר
3. בזהירות להסיר את השכבה העליונה פלזמה על ידי שאיפה. פלזמה יכולה לשמש תוספת עבור המדיום לתרבות.
4. החלף את הפלזמה שנאספו עם סטרילי PBS ולהעביר את הדם לתוך בקבוק סטרילי תרבות T75 או 50 מ"ל צינורות חרוטי. מערבבים את הדם עם PBS היטב על ידי pipetting למעלה ולמטה.
5. לאחר כל הדם נאסף, להכין וארבעה 50 מ"ל צינורות חרוטי ולהוסיף 15ml של פלוס Ficoll-Paque.
6. לאט לאט כיסוי 30-35ml של כדוריות דם על גבי Ficoll של צינור אחד. שמור ממשק ברורים בין Ficoll ותאי דם.
7. צנטריפוגה ב 500xg במשך 20 דקות בטמפרטורת החדר. הפעל את בלם "כבוי" ואת האצת נמוך ככל האפשר כדי לשמור על ממשק ברור בין השכבות.
8. בעזרת פיפטה seriological, לשאוב בזהירות את השכבה PBMC לאסוף את PBMC לתוך צינור חרוטי טרי 50 מ"ל. כאשר PBMC כל נקצרים להוסיף 30 מ"ל של PBS ו ספין על 400xg במשך 10 דקות. בטל supernatant לשטוף פעם נוספת עם 30 מ"ל PBS כדי להסיר את כל Ficoll שיורית.
9. המשך בידוד תא T CD8 ⁺ באמצעות Miltenyi האדם CD8 ⁺ T תא הבידוד בערכה על פי פרוטוקול של היצרן. ערכה זו מעשירה מאוד עבור CD8 ⁺ תאים (בדרך כלל> 95%) על ידי depleting CD8 ^- תאים.
10. הרוזן CD8 ⁺ T תאים. טוהר צפוי להיות יותר מ 95%. כדי לאשר להשתמש 2x10 ⁵ תאים לבצע ניתוח CD4/3/8 FACS. CTL הנותרים ניתן להשתמש גם מיד לגירוי-אנטיגן ספציפי aAPC או שהם יכולים להיות קפוא לשימוש עתידי.

4. במערכת aAPC תרבות חוץ גופית מבוסס

1. הכן בינוני תרבות
   1. עבור TF (צמיחה תא T גורם, שנעשו במעבדה ⁴⁾ 2X תרבות בינוני: להשלים בינוני פלוס RPMI התורם 5% עצמיים פלזמה ו - 8% צמיחה T גורם התא.
   2. פלזמה התורם עצמיים ניתן להחליף על ידי החום האנושי מומת א.ב. בסרום.
2. Resuspend 1,000,000 CTL ב 8ml של המדיום 2X תרבות TF פלוס 8ml של המדיום RPMI להשלים, להוסיף 1 × 10 ⁶ aAPC, ומערבבים היטב.
3. השתמש pipetter מרובת ערוצים לתאי צלחת על 96 גם רקמות U בתחתית צלחות תרבות. (160 μl לכל טוב)
4. תאים תרבות 37 מעלות צלזיוס, 5% CO ₂ incubater למשך 7 ימים. להאכיל את התאים ביום 4 עם 80 μl בינוני / טוב 2X TF.
5. תאים מוכנים שנקטפו ביום 7. לאחר הקטיף, המקום התאים כנגד המגנט ולהסיר את aAPC הישן.
6. סגוליות Antigen ניתן לקבוע על ידי מכתים tetramer על פי פרוטוקול של היצרן. מכתים הפנוטיפ ואת מכתים ציטוקינים תאיים מבוצעות על פי ³ במחקר הקודם שלנו.
7. התאים נקצרו ניתן replated עם aAPC שוב באותם תנאים. מספר תאים סגוליות אנטיגן צפוי לגדול לאחר גירוי חוזר.

5. נציג תוצאות:

דוגמה aAPC לאחר נטיה HLA-A2 איג אנטי CD28 מוצג באיור 4. נטיה חלבון מוצלח ניכר על ידי שינוי ברור של נוגדן מכתים המקביל. בעוד שכיחות CMV CTL הספציפיים בדם ההיקפי הוא בדרך כלל 0.5-1%, לאחר שבוע אחד של גירוי aAPC בתיווך, סגוליות יכול להגיע 55-93% (איור 2 ו -3). הרחבת CTL אנטיגן ספציפי יכול להיות משתנה מאוד בין תורמים שונים, אבל התוצאות הן לשחזור בתוך התורם זהה. על ידי ניפוח, התרחבות של תאים ספציפיים CMV ניתן אלפי לקפל לעומת רמות מבשר ישירות vivo לשעבר (מידע לא מוצג). מכתים ציטוקינים תאיים (איור 3) מראה כי אלה הם polyfunctional CTL מורחבת, ולא מותשים, לאחר תרבית תאים ממושכת התפשטות משמעותית.

באיור 1. תרשים זרימה נציג של aAPC הרחבה vivo מבוסס לשעבר של CTL האדם חיסוני המאמצת ב allogeneic HSCT

2. איור נציג מכתים tetramer תוצאה של CTL CMV ספציפי שנוצר על ידי aAPC לאחר שבוע של תרבות

איור 3. מכתים נציג תאיים ציטוקינים תוצאה של CTL CMV ספציפי שנוצר על ידי aAPC (סגוליות CMV היה 61%)

איור 4. התוצאה מכתים נציג M-450 חרוזים אפוקסי לאחר נטיה חלבון מוכתם אנטי עכבר IgG1-PE ואנטי עכבר IgG2-FITC

Discussion

מערכת aAPC אנו מתארים כאן היא מערכת יעילה להרחבת vivo לשעבר של CTL אדם נגד מגוון רחב של אנטיגנים. טיפול מיוחד צריך להילקח בכל הנוגע לאיכות נטיה חלבון ההפצה אפילו aAPC ו CTL בתרבות צלחת 96-היטב. בגישה זו הצלחנו להרחיב CTL במשך יותר מ 8 שבועות, במהלכו הרחבנו אנטיגן ספציפי CTL עד מיליון פי ^4. היו שונים APC מערכות מלאכותיות ניצול שורות תאים או פלטפורמות אחרות acellular ^5, אולם על פי הנתונים שפורסמו בכל מערכת יש פרופיל ייחודי בכל הקשור להרחבת וספציפיות לתמוך ביישומים שונים. חשוב לציין, כי איכות CTL חשובה כמו כמות, polyfunctionality של CMV-CTL ספציפי שנוצר על ידי המערכת שלנו צפויים להעניק יעילות מעולה אנטי ויראלית.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	חברה	מספר קטלוגי
Vacutainer צינור (מכיל הפרין)	בקטון דיקינסון	367874
האדם CD8 + T ערכת בידוד תא	Miltenyi	130-094-156
Dynabeads M-450 אפוקסי	Invitrogen	140.11
Dynal MPC-1 מגנט	Invitrogen	120-01D
Ficoll Paque-Plus	GE Healthcare	17-1440-03
RPMI בינוני 1640	Gibco	11875
HLA-A2-איג דימר X	בקטון דיקינסון	551263
iTAgMHC tetramer (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter	T20099
פלקון 96-ברור גם צלחת Microtest	בקטון דיקינסון	353077
עכברוש אנטי עכבר IgG2a-FITC	בקטון דיקינסון	553390
עיזים אנטי עכבר IgG1-PE	Invitrogen	P21129
האדם בסרום סוג AB	אטלנטה ביולוגיות	S40110
עכבר אנטי אנושי CD8a-FITC	סיגמא אולדריץ	F0772
עכבר אנטי אנושי CD8a-APC	בקטון דיקינסון	340684
עכבר אנטי אנושי IFNγ-FITC	בקטון דיקינסון	340449
עכבר אנטי אנושי TNFα-PE	בקטון דיקינסון	340512