HLA-Ig Baseado Artificial células apresentadoras de antígenos para a eficiente Ex vivo Ampliação da CTL Humanos

Resumo

Um método novo CD independente para indução e expansão de células T antígeno-específicos é descrito. HLA A2-Ig baseada Células Antigen Presenting artificial (AAPC) são carregados com HLA-A2 peptídeos restrito a expandir de forma eficiente CTL de especificidade do antígeno diversas. Esta tecnologia tem um grande potencial para CTL baseada imunoterapia adotiva.

Resumo

CTL com função efetora ideal desempenham papéis críticos na mediação proteção contra diversas infecções intracelulares e câncer. No entanto, os indivíduos podem apresentar microambiente imune supressivo e, em contraste com a ativação CTL, as suas células autólogas apresentando antígeno pode tender a tolerize ou anergize CTL antígeno específico. Como resultado, embora ainda em fase experimental, baseada em CTL imunoterapia adotiva evoluiu para se tornar um tratamento promissor para diversas doenças, como câncer e infecções por vírus. Em experimentos ex vivo inicial expandiu CMV (citomegalovírus) CTL específicos têm sido utilizados para o tratamento de infecção por CMV em pacientes imunocomprometidos óssea alogênico transplante de medula. Embora seja comum ter a vida em risco viremia CMV nesses pacientes, nenhum dos pacientes que receberam expandiu CTL CMV desenvolver doenças relacionadas, implicando a imunidade anti-CMV é estabelecido pela CTL adotivamente transferidos ^1. Resultados promissores também têm sido observados para melanoma e pode ser estendido para outros tipos de câncer ^2.

Embora existam muitas maneiras de ex vivo estimular e expandir CTL humanos, abordagens atuais são restritas pelas limitações de custo e técnicas. Por exemplo, o padrão ouro atual é baseado no uso de DC autólogo. Isso exige de cada paciente para doar um número significativo de leucócitos e também é muito caro e trabalhoso. Além disso, detalhada caracterização in vitro da DC expandiu CTL revelou que estes só têm função efetora suboptimal ^3.

Aqui apresentamos um sistema altamente eficiente baseada AAPC para a expansão ex vivo de CTL CMV humano específico para a imunoterapia adotiva (Figura 1). A AAPC foram feitas pelo acoplamento de células de tamanho esferas magnéticas com humano HLA-A2-Ig dímero e anti-CD28mAb ^4. Uma vez AAPC são feitos, eles podem ser carregados com vários peptídeos de interesse, e permanecer funcional por meses. Neste relatório, AAPC foram carregados com um peptídeo dominante da CMV, pp65 (NLVPMVATV). Após o cultivo humano purificado CD8 ⁺ CTL de um doador saudável com AAPC por uma semana, CMV CTL específica pode ser aumentado dramaticamente na especificidade até 98% (Figura 2) e ampliado mais de 10.000 vezes. Se mais CTL CMV-específicos são necessários, uma maior expansão pode ser facilmente alcançado por estimulação repetitiva com AAPC. Caracterização fenotípica e funcional mostra estas células expandidas têm fenótipo efetor uma memória e fazer uma quantidade significativa de ambos os TNFa e IFNγ (Figura 3).

Protocolo

1. Fazendo, HLA-A2-Ig baseada AAPC

1. Prepare tampão borato estéril
   1. Dissolver o ácido bórico em água para fazer 0,1 M. Ajustar o pH para 7,0.
   2. Filtrar através de filtro estéril 0.22μm e armazenar a 4 ° C.
2. Prepare tampão de lavagem estéril Bead
   1. Tome 956ml PBS magnésio w / o ou cálcio.
   2. Adicionar 30ml de soro humano AB.
   3. Adicionar EDTA 2mM concentração final.
   4. Adicionar 0.1gsodium azida.
   5. Filtrar com um filtro de 0,22 mM estéril e armazenar a 4 ° C.
3. Tomar 1ml de contas Invitrogen M-450 Epoxy do estoque, aproximadamente 400 milhões de contas (contas pode ser contado por hemocitômetro), e colocado em um, frasco de vidro estéril parafuso superior.
4. Colocar o frasco contra um ímã Dynal MPC-1, enquanto as contas aderir à parede do frasco, retire o sobrenadante por aspiração. Lavar contas uma vez com 1ml de tampão borato.
5. Contas ressuspender em uma mistura de tampão borato 1ml e 20 mcg de HLA-A2-Ig dímero e 20 mg de anti-CD28 humano mAb (Clone 9.3).
6. Proteína para a conjugação talão: coloque o frasco de vidro sobre rotador e gire a 4 ° C por 24 horas.
7. Colocar o tubo no MPC-1 ímã e remover todos tampão borato.
8. Lave as contas duas vezes com tampão de lavagem 1ml Bead.
9. Incubar as contas em tampão de lavagem 1ml Bead, gire a 4 ° C por 24 horas. Porque tampão de lavagem contém Bead humana soro AB, ele irá bloquear todos os sites de proteína residual vinculativo sobre as contas.
10. Remover o sobrenadante do frasco de vidro, substitua por 1 ml tampão de lavagem fresca Bead.

2. Controle de qualidade dos AAPC e peptídeo de carga, armazenamento

1. Adicionar ~ 5 × 10 ⁵ contas para FACS 100μl tampão de lavagem em tubos FACS, e mancha com 1μl de anti-mouse IgG1-PE (reconhecer a parte Fc de HLA-A2-Ig) e 1μl de anti-mouse IgG2a-FITC (reconhecer a parte Fc de anti-CD28 mAb). Após coloração por 20 minutos em FACS tampão de lavagem, lave novamente e ler o resultado coloração imediatamente por citômetro de fluxo (Figura 4).
2. Loading peptídeo para as contas: lavar as contas duas vezes em frasco de vidro com 1 ml estéril PBS. Ressuspender com 1ml de PBS estéril, em seguida, adicionar 10μl de peptídeo CMV (1mg/ml)
3. Contar as contas por hemocitômetro, e rotular o frasco com data e concentração.
4. AAPC está pronto para uso após pelo menos 3 dias de incubação peptídeo a 4 ° C, para dar tempo suficiente de ligação de peptídeos para o dímero HLA-A2-Ig. As esferas podem ser armazenados a 4 ° C e permanecer funcional por pelo menos seis meses.

3. CTL isolamento humano

1. Coletar ~ 100ml de sangue periférico fresco de doadores HLA-A2 saudável e positiva em 10 de sódio BD tubos Vacutainer Heparina. Use uma agulha calibre 21 ou maior para evitar a hemólise.
2. Centrifugar a 300xg por 10 minutos em temperatura ambiente
3. Remova cuidadosamente a camada de plasma topo por aspiração. O plasma pode ser utilizado como suplemento para o meio de cultura.
4. Substituir o plasma coletado com PBS estéril e transferir o sangue para um balão de cultura estéreis T75 ou tubos cônicos de 50ml. Misturar o sangue com PBS bem pipetando cima e para baixo.
5. Uma vez que todo o sangue é coletado, prepare mais quatro tubos de 50ml cónico e adicionar 15ml de Ficoll-Paque Plus.
6. Lentamente sobreposição de 30 35ml de células do sangue em cima do Ficoll de cada tubo. Manter a interface entre as distintas Ficoll e células do sangue.
7. Centrifugar a 500xg por 20 minutos em temperatura ambiente. Ligue o freio "off" ea aceleração tão baixo quanto possível manter uma relação clara entre as camadas.
8. Com uma pipeta serológico, aspirar cuidadosamente a camada de PBMC e recolher o CMSP em um tubo cônico de 50ml fresco. Quando todas as PBMC são colhidas adicionar 30ml de PBS e giram em 400xg por 10 min. Desprezar o sobrenadante e lavar mais uma vez com PBS 30ml para remover todos os Ficoll residual.
9. Proceder para isolamento de células CD8 ⁺ T usando Miltenyi humana CD8 ⁺ T kit de isolamento de células de acordo com o protocolo do fabricante. Este kit altamente enriquece de células CD8 ⁺ (geralmente> 95%), esgotando CD8 ^- células.
10. Contar as células T CD8 ^+. A pureza esperada deve ser superior a 95%. Para confirmar essa utilização 2x10 ⁵ células e realizar uma análise CD4/3/8 FACS. O CTL restante pode ser utilizado de imediato para a estimulação antígeno-específica AAPC ou eles podem ser congelados para uso futuro.

4. In vitro sistema de cultivo baseado AAPC

1. Prepare meio de cultura
   1. Para TF (T fator de crescimento celular, feita no laboratório ⁴⁾ 2X meio de cultura: meio RPMI completo, mais 5% de doadores autólogos plasma e 8% T fator de crescimento celular.
   2. Plasma de doadores autólogos pode ser substituído por inativado pelo calor humano AB soro.
2. Ressuspender CTL 1 milhão em 8ml de TF meio de cultura 2X mais 8ml de meio RPMI completo, adicionar 1 × 10 AAPC ^6, misture bem.
3. Use uma pipeta multi-canal para as células em placa de 96 poços fundo U placas de cultura de tecidos. (160 mL por poço)
4. Células de cultura em 37 ° C, 5% CO ₂ incubater durante 7 dias. Alimentar as células no dia 4 com 80 mL bem TF / médio 2X.
5. As células estão prontas para serem colhidas no dia 7. Após a colheita, coloque as células contra o ímã e remova a AAPC de idade.
6. Especificidade do antígeno pode ser determinada através da coloração tetrâmero acordo com o protocolo do fabricante. Coloração fenótipo e coloração de citocinas intracelulares são realizadas de acordo com nossos ³ estudo anterior.
7. As células podem ser colhidas com replated AAPC novamente sob as mesmas condições. Número de células e especificidade do antígeno é esperado um aumento após a estimulação repetida.

5. Resultados representativos:

Um exemplo de AAPC após conjugação HLA A2-Ig e anti-CD28 é mostrado na Figura 4. Conjugação de proteínas de sucesso é evidente uma clara mudança de coloração do anticorpo correspondente. Enquanto a freqüência de CMV CTL específicas no sangue periférico é tipicamente 0,5-1%, após uma única semana de AAPC mediada estimulação, a especificidade pode chegar a 55-93% (Figura 2 e 3). A expansão da CTL antígeno específico pode ser muito variável entre os diferentes doadores, mas os resultados são reprodutíveis dentro do mesmo doador. Por extrapolação, a expansão de células CMV específicos podem ser milhares de vezes em comparação com os níveis de precursor diretamente ex vivo (dados não mostrados). Coloração de citocinas intracelulares (Figura 3) mostra que essas CTL expandidas são polifuncionais, ao invés de exausto, depois de cultura de células prolongada e proliferação significativa.

Figura 1. Gráfico Representante fluxo de expansão vivo baseado ex AAPC de CTL humanos para imunoterapia adotiva em alogênico HSCT

Figura 2. Representante resultado coloração tetrâmero de CMV CTL específicos gerados por AAPC após uma semana de cultura

Figura 3. Resultado coloração intracelular de citocinas Representante da CMV CTL específicos gerados pela AAPC (CMV especificidade foi de 61%)

Figura 4. Coloração resultado Representante do M-450 contas Epoxy após conjugação de proteínas marcadas com anti-camundongo IgG1-PE e anti-mouse IgG2-FITC

Discussão

O sistema AAPC descrevemos aqui é um sistema eficiente para a expansão ex vivo de CTL humana contra uma variedade de antígenos. Cuidados especiais devem ser tomados com relação à qualidade da conjugação de proteínas e distribuição uniforme da AAPC e CTL na cultura placa de 96 poços. Usando essa abordagem, temos sido capazes de expandir CTL por mais de oito semanas, durante a qual expandiu-antígeno específico CTL até um milhão de vezes ^4. Houve vários sistemas APC artificial utilizando linhas celulares ou outras plataformas acelular ^5, no entanto, de acordo com os dados publicados a cada sistema tem seu perfil único no que diz respeito à expansão e especificidade suporte a aplicações diferentes. Importante, uma vez que a qualidade do CTL é tão importante como a quantidade, o polyfunctionality do CTL CMV-específico gerado pelo nosso sistema são esperadas para conferir eficiência anti-viral superior.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reagente	Companhia	Número de catálogo
Vacutainer tubo (contém heparina)	Becton Dickinson	367874
Humana CD8 + T kit de isolamento de células	Miltenyi	130-094-156
Dynabeads Epoxy M-450	Invitrogen	140,11
Dynal Magnet MPC-1	Invitrogen	120-01D
Ficoll-Paque Plus	GE Healthcare	17-1440-03
Meio RPMI 1640	Gibco	11875
HLA-A2-Ig dímero X	Becton Dickinson	551263
iTAgMHC tetrâmero (HLA-A2-CMV)-PE	Beckman Coulter	T20099
Falcon clara de 96 poços da placa de microtitulação	Becton Dickinson	353077
Rato anti-rato IgG2a-FITC	Becton Dickinson	553390
Cabra anti-rato IgG1-PE	Invitrogen	P21129
Soro humano tipo AB	Atlanta biológicos	S40110
Camundongo anti-humano-FITC CD8a	Sigma-Aldrich	F0772
Camundongo anti-humano CD8a-APC	Becton Dickinson	340684
Camundongo anti-humano-FITC IFNγ	Becton Dickinson	340449
Camundongo anti-humano TNFa-PE	Becton Dickinson	340512