HLA - Igは効率のためのベースの人工抗原提示細胞生体外で拡大

要約

抗原特異的T細胞の誘導と拡大のための新しいDCの独立した方法が記載されている。 HLA A2 - Igはベースの人工的な抗原提示細胞（aAPC）が効率的に多様な抗原特異性のCTLを拡大するHLA - A2制限されたペプチドがロードされます。この技術は、CTLベースの養子免疫療法のための大きな可能性を秘めている。

要約

最適なエフェクター機能を持つCTLは、様々な細胞内感染症や癌に対する保護を媒介に重要な役割を果たしている。しかし、個人が抑制免疫微小環境を示すことがあると、活性化CTLとは対照的に、彼らの自家抗原提示細胞が耐性化する傾向にあることまたは抗原特異的CTLをanergize。結果として、まだ実験段階にもかかわらず、CTLベースの養子免疫療法は、がんやウイルス感染など、様々な疾患に対する有望な治療になるために進化してきました。初期の実験では、ex vivoで拡張されたCMV（サイトメガロウイルス）特異的CTLは、免疫不全の同種骨髄移植患者におけるCMV感染症の治療のために使用されている。それはこれらの患者の生命を脅かすCMVのウイルス血症、拡張されたCTLを受けている患者のどれもがCMVに関連する病気を開発するのが一般的ですが、抗CMV免疫の養子転送CTL ¹で確立されている暗示。有望な結果はまた、悪性黒色腫が観察されており、がん²の他のタイプに延長することができる。

人間のCTLを刺激し、拡大し、ex vivoでの多くの方法がありますが、現在のアプローチは、コストと技術的な限界によって制限されます。例えば、現在のゴールドスタンダードは、自家DCの使用に基づいています。これにより、各患者は、白血球のかなりの数を寄付することが必要とも非常に高価で面倒です。また、DC拡張CTLのin vitroでの特性の詳細は、これらが唯一の次善のエフェクター機能^3を持っていることを明らかにした。

ここでは、養子免疫療法（図1）のためのヒトCMV特異的CTLのex vivoでの拡大のための高効率aAPCベースのシステムを提示する。 aAPCは、ヒトHLA - A2 - Igの二量体と抗CD28mAb ⁴セルサイズの磁気ビーズを結合させることによって行われた。 aAPCが行われると、彼らは興味のある様々なペプチドでロードされ、月間は継続することができます。このレポートでは、aAPCはCMV、pp65を（NLVPMVATV）から支配的なペプチドを負荷した。一週間のためのaAPCと健康なドナーからのヒトCD8 ⁺ CTLを精製培養した後、CMV特異的CTLは、98％（図2）に特異性で劇的に増加し、10,000人以上の倍に増幅することができる。より多くのCMV特異的CTLが必要な場合は、さらなる拡張が容易にaAPCで反復刺激することによって達成することができます。表現型および機能的特徴は、これらの拡張された細胞は、エフェクター、メモリー表現型を持つと（図3）TNFαとIFNγの両方を大量に作る示しています。

プロトコル

1。作り、HLA - A2 - IgをベースaAPC

1. 滅菌ホウ酸緩衝液を準備する
   1. 0.1Mを作るために水にホウ酸を溶かす。 pHを7.0に調整する。
   2. 4で0.22μm滅菌フィルターや店舗をフィルタ℃に
2. 滅菌ビーズ洗浄バッファーを準備します。
   1. 956ミリリットルPBS W / Oマグネシウムやカルシウムを取る。
   2. 30ミリリットルのヒトAB血清を追加。
   3. EDTA 2mMの最終濃度を追加。
   4. 0.1gsodiumアジを追加。
   5. 4で0.22μmの滅菌フィルターや店舗をフィルタ℃に
3. 、在庫から約4億ビーズ（ビーズは、血球計数器でカウントすることができます）インビトロジェンM - 450エポキシビーズを1mlを取り、滅菌、スクリュートップガラスバイアルに入れ。
4. ビーズは、バイアルの側面に付着しながら、DYNAL磁石MPC - 1に対するバイアルを入れ、吸引して上清を取り除く。ホウ酸緩衝液を1mlで一回ビーズを洗浄する。
5. 1ミリリットルホウ酸緩衝液およびHLA - A2 - Igの二量体と抗ヒトCD28モノクローナル抗体（クローン9.3）の20μgの20μgの混合物でビーズを再懸濁します。
6. ビーズ共役への蛋白質：ローテーター上のガラスバイアルを入れ、4℃で回転℃で24時間。
7. MPC - 1マグネットにチューブを置き、すべてのホウ酸緩衝液を取り除く。
8. 1ミリリットルビーズ洗浄バッファーで2回ビーズを洗浄してください。
9. 1ミリリットルビーズ洗浄バッファーでビーズをインキュベートし、4℃で回転させる℃で24時間。ビーズ洗浄バッファーは、ヒトAB血清が含まれているので、それは、ビーズ上のすべての残留タンパク質結合部位をブロックします。
10. ガラス瓶から上清を除去する、1mlの新鮮なビーズの洗浄緩衝液で置き換えてください。

2。 aAPCとペプチド負荷、ストレージの品質管理

1. FACSチューブに洗浄液100μlのFACSへ^〜5 × 10 5ビーズを追加し、抗マウスIgG1 - PE（HLA - A2 - IgのFc部分を認識）および抗マウスIgG2a - FITC（認識1μlの1μlのと染色抗CD28モノクローナル抗体のFc部分）。洗浄バッファーFACSで20分間染色した後、再び洗浄し、フローサイトメーター（図4）によってすぐに染色の結果をお読みください。
2. ビーズ上にペプチド負荷：1ミリリットル滅菌PBSでガラスバイアルに二回ビーズを洗浄する。 1ミリリットル滅菌PBSで再懸濁しは、CMVペプチド​​（1mg/ml）の10μlを加える
3. 血球計算盤によるビーズをカウントし、日付と濃度とのバイアルにラベルを付けます。
4. aAPCは、HLA - A2 -グロブリン二量体の上にペプチド結合の十分な時間を確保するために、4℃で少なくとも3日後にペプチドインキュベーション使用するための準備が整いました。ビーズは4℃で保存され、少なくとも6ヶ月は継続することができます。

3。人間のCTLの分離

1. 10 BDのヘパリンナトリウムバキュテイナ管に健康的なHLA - A2陽性ドナーからの新鮮な末梢血の〜100ミリリットルを収集する。 21ゲージ針または溶血を防ぐために、大きい方を使用してください。
2. 室温で10分間300xgで遠心分離
3. 慎重に吸引して上部のプラズマレイヤーを削除します。プラズマは、培地のためのサプリメントとして使用することができます。
4. 滅菌PBSで収集した血漿を交換し、滅菌T75培養フラスコまたは50ミリリットルコニカルチューブに血液を移す。上下にピペッティングによりよくPBSで血を混ぜる。
5. 一度、すべての血液が収集され、4つの追加50ミリリットルコニカルチューブを準備し、をFicoll - Paqueプラスの15ミリリットルを追加します。
6. ゆっくりオーバーレイ各チューブのフィコールの上に血液細胞の30〜35ミリリットル。フィコールと血液細胞との間のインターフェースが異なるしてください。
7. 室温で20分間500xgで遠心分離します。ブレーキ"オフ"と層の間に明確なインタフェースを維持するために可能な限り低加速を回します。
8. seriologicalピペットを使用して、慎重にPBMC層を吸引し、新鮮な50ミリリットルコニカルチューブにPBMCを収集する。すべてのPBMCを10分間400xgでPBSとスピンの30ミリリットルを追加収穫されている場合。上清を捨て、すべての残留フィコールを削除するには、30ミリリットルのPBSでもう一度洗浄する。
9. 製造業者のプロトコルに従ってミルテニーヒトCD8 ⁺ T Cellアイソレーションキットを使用することによりCD8 ⁺ T細胞の分離に進みます。細胞^-このキットは非常に（通常> 95％）CD8を枯渇させることによりCD8 ⁺細胞のために豊かに。
10. CD8 ⁺ T細胞を数える。予想される純度は95％以上でなければなりません。この使用2 × 10 ⁵細胞を確認し、CD4/3/8 FACS解析を実行する。残りのCTLは、どちらの抗原特異的aAPC刺激に対してすぐに使用することも、将来使用するために凍結することができます。

（4） 体外 aAPCベースの培養系で

1. 培地を準備
   1. 完全RPMI培地に加え、プラズマ、8％のT細胞増殖因子自家5％のドナー：TF（ラボ⁴で作られたT細胞増殖因子、）2X培地用。
   2. ドナー自己血漿は、熱不活化ヒトAB血清で置換することができる。
2. 再懸 ​​濁し、完全RPMI培地中のTF 2X培地を加えた8ミリリットルの8ミリリットルで100万CTLは、1を追加× 10 ⁶ aAPCを、よく混ぜる。
3. 96ウェルU底の組織培養プレート上にプレートの細胞へのマルチチャンネルピペッターを使用してください。 （ウェルあたり160μlを）
4. 37培養細胞° C、7日間、5％CO ₂ incubater。 80μlの/ウェルTF 2X培地で4日目に細胞を養う。
5. 細胞は7日目に収穫する準備が整いました。収穫後は、磁石から細胞を配置し、古いaAPCを取り外します。
6. 抗原特異性は、製造業者のプロトコルに従ってテトラマー染色により決定することができる。表現型の染色と細胞内サイトカイン染色は、私たちの以前の研究の³に従って実行されます。
7. 収穫された細胞は、同じ条件の下で再びaAPCと色を保ち続けることができます。細胞数や抗原特異性は、反復刺激後に増加すると予想される。

5。代表的な結果：

HLA A2 - Igおよび抗CD28接合後のaAPCの例を図4に示されています。成功したタンパク質コンジュゲーションは、対応する抗体染色の明確なシフトによって明らかである。末梢血中のCMV特異的CTLの頻度がaAPCを介した刺激の単週後に、通常は0.5から1パーセントですが、特異度は55に到達することができます - 93％（図2および3）。抗原特異的CTLの拡張は、さまざまなドナーの間で非常に可変することができますが、結果は同じドナー内で再現可能です。外挿によって、CMV特異的細胞の拡大は、前駆体のレベルを直接ex vivoで （データは示さず）に比べて倍の数千になることができます。細胞内サイトカイン染色（図3）これらの拡張されたCTLは、長期細胞培養と有意な増殖の後、多官能性ではなく、疲れていることを示しています。

図1。同種HSCTにおける養子免疫療法のためのヒトCTLのaAPCベースのex vivoでの展開の代表的なフローチャート

文化の一週間後にaAPCによって生成されたCMV特異的CTLの図2。代表テトラマー染色の結果

図3。aAPCによって生成されたCMV特異的CTLの代表的な細胞内サイトカイン染色の結果（CMV特異性は61％であった）

図4 M - 450エポキシビーズの代表的な染色の結果抗マウスIgG1 - PEと抗マウスIgG2の- FITCで染色したタンパク質コンジュゲーション後の

ディスカッション

我々はここで説明するaAPCシステムは、抗原の多様性に対する人間のCTLのex vivoでの拡大のための効率的なシステムです。特別なケアは、タンパク質共役および96ウェルプレート培養でaAPCとCTLの均一な分布の品質に関しては注意が必要です。我々は百万倍の⁴に抗原特異的CTLを展開した中に、8週間以上のためにCTLを拡大することができたこのアプローチを使用する。細胞株や他の無細胞プラットフォーム⁵活用した様々な人工APCシステムが行われているが、公表されたデータによると、すべてのシステムは、異なるアプリケーションをサポート拡張し、特異性に関して持つ独自のプロファイルを持っています。 CTLの質は量と同様に重要であるので重要なのは、、私たちのシステムによって生成されたCMV特異的CTLのpolyfunctionalityは、優れた抗ウイルス効果を付与することが期待されています。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
試薬	会社	カタログ番号
バキュテイナ管（ヘパリンを含む）	ベクトンディッキンソン	367874
ヒトCD8 + T Cellアイソレーションキット	国内でのみ有効	130-094-156
ダイナビーズM - 450エポキシ	インビトロジェン	140.11
DYNAL MPC - 1マグネット	インビトロジェン	120 - 01D
をFicoll - Paqueプラス	GEヘルスケア	17-1440-03
RPMI培地1640	ギブコ	11875
HLA - A2 -グロブリン二量体X	ベクトンディッキンソン	551263
iTAgMHC四量体（HLA - A2 - CMV）- PE	ベックマンコールター	T20099
ファルコン明確な96穴マイクロプレート	ベクトンディッキンソン	353077
ラット抗マウスIgG2a - FITC	ベクトンディッキンソン	553390
ヤギ抗マウスIgG1 - PE	インビトロジェン	P21129
ヒト血清型AB	アトランタ生物学的製剤	S40110
マウス抗ヒトCD8a - FITC	シグマアルドリッチ	F0772
マウス抗ヒトCD8a - APC	ベクトンディッキンソン	340684
マウス抗ヒトIFNγ- FITC	ベクトンディッキンソン	340449
マウス抗ヒトTNFα- PE	ベクトンディッキンソン	340512