מסכי הגנום תחרותי של ספריות שמרים המבורקדים

Summary

פיתחנו מקיף, משוחדת הגנום כולו מסכי להבין גנים סמים גנים הסביבה אינטראקציות. שיטות סינון אלה אוספים מוטציה מוצגים.

Abstract

בזכות ההתקדמות בטכנולוגיות הדור הבא ריצוף, יש לנו גישה רצפי גנום חדש כמעט מדי יום. קצב ההתקדמות אלה מואצת, מבטיח יותר עומק ורוחב. לאור ההתפתחויות הללו יוצא דופן, את הצורך, שיטות מהיר במקביל להגדיר פונקציה הגן הופך להיות יותר ויותר חשוב. אוספים של הגנום כולו מוטציות מחיקה של שמרים וא coli שימשו סוסי עבודה לאפיון פונקציונלי של תפקוד הגנים, אך גישה זו אינה מדרגית הנוכחית גנים המחיקה גישות דורשים כל אחד אלפי גנים אשר מהווים הגנום למחיקה ומאומת. רק לאחר השלמת עבודה זו נוכל לפתח תפוקה גבוהה phenotyping. במהלך העשור האחרון, במעבדה שלנו מעודן פורטפוליו של הגנום כולו תחרותי, מיניאטורי תפוקה גבוהה, מבחני שניתן לבצע במקביל. הקבלה זה אפשרי בשל הכללת "תגים" ה-DNA, או "ברקודים," לתוך כל מוטציה, עם הברקוד משמש פרוקסי עבור המוטציה, ואפשר למדוד את שפע ברקוד כדי להעריך את כושר מוטנטי. במחקר זה, אנו מבקשים למלא את הפער בין רצף הדנ"א ואוספים מוטציה המינימרקטים. לשם כך אנחנו מציגים transposon בשילוב שיבוש-barcoding גישה שנפתחת מבחני ברקוד במקביל רצף החדש, אך מאופיינת גרוע חיידקים. כדי להמחיש זאת אנו מציגים גישה חדשה קנדידה אלביקנס אוסף שיבוש המבורקדים לתאר איך הן microarray המבוסס על רצף הבא מבוססי פלטפורמות הדור ניתן להשתמש כדי לאסוף 10,000 - 1,000,000 גנים גנים סמים גן אינטראקציות בניסוי יחיד.

Protocol

1. רקע מידע

ישנן מספר דרכים לייצר מוטציות שנושאים תגי הברקוד. תקן הזהב הנוכחי הוא נוק שמרים (YKO) באוסף שנוצר על ידי קונסורציום של מעבדות הושלמה בשנת 2002 ^1. מאז YKO המקורי הוצג, אוספים שמרים אחרים נוצרו; ברקע זן שונים, תוך שימוש יתר ביטוי בונה, וכן חיידקים אחרים כגון E. coli ^2. במקביל, מאמץ ליצור המינימרקטים ספריות shRNA מתנהל במהירות, ולמעשה, רבים מעקרונות העיצוב של אוספים אלה יונקים אומצו מן השמרים. כדי להמחיש עד כמה transposons המינימרקטים יכול להיות אסטרטגיית הצמיחה המהירה, החלים נרחב ליצירת אוספי מוטציה שיטתי, אנו מתמקדים אוסף אחד אנחנו שנוצר לאחרונה הפתוגן פטרייתי אדם, קנדידה אלביקנס. העבודה שלנו על קנדידה התבססה על ההצלחה של מסכי ברקוד ס cerevisiae, והוא משמש כאן כאורגניזם דוגמה. פרוטוקול המדגם, עם שינויים קלים יכולים לשמש מסך כל אורגניזם כי ניתן לגדל בתרבית ההשעיה. בגלל כמה אורגניזמים יש שיעור גבוה של השינוי הנדרש רקומבינציה mitotic יעיל צורך ליצור מוטציות המחיקה מושלמת, ולפיכך פיתחנו פרוטוקול המשתמשת mutagenesis transposon במבחנה כדי mutagenize ספריית DNA גנומי, והפכו אז אלה שברי גנומית המינימרקטים לתוך קנדידה אלביקנס ^{3 , 4.} בהשראת ההצלחה של האוסף YKO המקורי ותפקידה תגליות בסיסיות אודות אופיו של הגן רשתות ^5-8, הגנום כולו haploinsufficiency ^9, יעד סמים מנגנון הפעולה ^10,11, ואת חיוניות של כל הגנים בגנום ¹² אנו צופים הרחבה בגישה זו כדי חיידקים אחרים יהיה פורה ביותר.

פרוטוקול להלן מניח כי אוסף מוטציה הרצוי נוצר (למשל YKO או קנדידה אלביקנס אוסף שיבוש) והוא זמין כמו זנים בארכיון בנפרד. לתיאור מפורט של בניית מתח לראות ^1,13,14.

2. שלב מוטציות בודדות לתוך בריכה אחת

1. אפשר שבוע אחד כדי לייצר aliquots תא ונקווה (ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל ב -80 ° C).
2. ההפשרה מניות גליצרול קפואים לצלילי עניין לגמרי, אבל לא נותנים התאים נשארים מופשר במשך> 2hrs.
3. לעקר כלי 96-pin היטב, לטבול את הכלי סיכה במים כדי להסיר את כל התאים הנותרים, ואחריו 2 מטבלים באמבטיות אתנול 70% (למשל תיבת פיפטה מכסים קצה), להבה כלי סיכה ומצננים דקה 1. תשמרי על הלהבה כלי סיכה הרחק אמבטיות אתנול. רמת המרחצאות אתנול יעלה את רמת באמבט מים כדי להבטיח את כל לשאת על תאים flamed והוסרו. החלף מים כל 4-6 pinnings.
4. הכנס את כלי סטרילי 96-pin גם לתוך מערבולת מופשר 96-גם צלחת, בעדינות ולהעביר התאים מגש Nunc אומני המכיל YPD-agar כולל אנטיביוטיקה המתאימה. לגדל מושבות עד שהם מגיעים לגודל מקסימלי של 30 ° C (2-3D). כדי לחסוך צלחות, אנו מוצאים אותו שימושי ביותר לגבש four 96 צלחות היטב על מגש-Omni יחיד עם ~ 384 זנים.
5. לאחר מושבות גדלו, שים לב כל זני גידול חסר או איטי רפין אלה ב ~ 2X המוני תא כמו שאר זני.
6. עבודה בסביבה מיקרוביולוגיה (עם להבה labware סטרילי, צלחת עם מבול התקשורת 5-10 מ"ל, להשרות במשך 5 דקות ומושבות resuspend עם מפזר תא. יוצקים את הנוזל בתוספת תאים לתוך שפופרת 50 מ"ל צנטריפוגה חרוטי, ולהוסיף גליצרול כדי 15% או DMSO עד 7% (כרך / כרך).
7. מדוד את OD ₆₀₀ הבריכה ולהתאים (על ידי דילול או צנטריפוגה) לריכוז סופי של 50 מ"ל OD / ₆₀₀ עם התקשורת גליצרול המכיל 15% או 7% DMSO.
8. Aliquot ב 40 כרכים μl צינורות PCR להתפשט להקפיא ב -80 ° C.

3. בריכת ניסויית צמיחה

הליך זה מתוארת באיור 1.

1. בריכת הפשירי aliquots (צינורות PCR) על קרח. אם לא באמצעות רובוטיקה, דלג לשלב 5.
2. מיד לדלל (gently!) הבריכה לתוך התקשורת עם סמים או במצב של בחירה, inoculating ב OD ₆₀₀ של 0.0625 בנפח כולל של 700 μl בצלחת 48-באר. כלול לפחות אחד לשלוט ממס המתאים על הצלחת. עבור ניסויים להרחיב מעבר 5 דורות של צמיחה (כלומר יותר מ 1 טוב), למלא בארות הסמוך עם התקשורת או מצב של בחירה, אך לא התאים.
3. חותם חותם צלחת פלסטיק; אם המצב מחייב צמיחה אירובית (למשל, אי - תסיס מקורות פחמן), שימוש במחט 21 מד לנקב את החורים לאטום את הממברנה לכיוון הצד של כל טוב.
4. לגדול ספקטרופוטומטר, רועד על 30 מעלות צלזיוס עם determi בניסוינד נד משטר (למשל ללחוץ 14 דקות על הגדרת הגבוהה ביותר (או בקרת טמפרטורה שייקר), לקרוא בארות, לחדש רועד). חלק ההשעיה התא ניתן לקצור על ידי הרובוט ונשמר על צלחת קרה על סיפון רובוטית בבית המוגדרים על ידי המשתמש בזמן נקודות הדור, בדרך כלל 5, 10, 15 ו 20 דורות של צמיחה. (Http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, לפרטים פנה ג Nislow או G. Giaever).
5. עבור צמיחת תאים ידני, לחסן תרבות 50 מ"ל ב OD החל ₆₀₀ של 0.002 בבקבוק 250 מ"ל תרבות. שייק בקצב של 30 ° C בסל"ד 250 עד התאים להגיע OD 2.0 הסופי של ₆₀₀ (עבור Saccharomyces או קנדידה) עבור ~ 10 דורות של צמיחה. דורות נוספים של צמיחה ניתן להשיג על ידי תאים דילול ב OD600 של 2.0 חזרה 0.02 בבקבוק טריים.
6. קציר לפחות 2 ~ OD ₆₀₀ יחידות של תאים עבור כל דגימה / שעה נקודת לתוך Safe-Lock צינורות microcentrifuge.

הערה: תמיד לאסוף דגימת תאים המוצא (כלומר "T0 נקודת זמן") כדי להעריך את הייצוג המתח הראשוני בבריכה כלשהו שנוצר על ידי הוספת 1-2 OD ₆₀₀ הבריכה ישירות מן המקפיא אל aliquots צינור 1.5 מ"ל ועיבוד כמתואר להלן.

4. מיצוי DNA הגנום, PCR ו - הכלאה microarray או ריצוף

1. לטהר הדנ"א הגנומי מ ~ 2 OD ₆₀₀ תאים למחקר Zymo YeaStar ערכת בהתאם להוראות היצרן (פרוטוקול I אם באמצעות ה-DNA שמרים), או שיטה אחרת מתאימה ספציפית האורגניזם עניין (מיצוי פנול / כלורופורם רגיל ואחריו משקעים אלכוהול עובד גם עבור חיידקים שונים). אם באמצעות ערכת YeaStar, elute את ה-DNA עם μL 300 של 0.1X TE במקום μL 60 של 1X TE המפורטים בפרוטוקול. הדנ"א הגנומי ניתן לאחסן לזמן בלתי מוגבל ב -80 ° C.
2. הגדרת שתי תגובות PCR עבור כל דגימה, אחד uptags ואחד עבור downtags, עם התנאים התגובה כדלקמן: 33 μl DDH ₂ O, 6 חיץ μl 10X PCR ללא MgCl _2, 3 μl 50 מ"מ MgCl _2, 1.2 μl dNTPs 10 מ"מ, 1.2 μl 50 מיקרומטר למעלה או למטה תערובת פריימר, 0.6 μl 5 U / פולימראז תקי μl, ~ 0.1 מיקרוגרם DNA הגנומי של μl 15. נפח סך 60 μl. Thermocycle תחת התנאים הבאים: 94 ° C 3 דקות, 30 מחזורים של 94 ° C ה -30, 55 -30 ° C, 72 ° C ה -30, ולאחר מכן 72 ° C 3min, לחיצה ארוכה על 4 ° C. בדוק את המוצרים כתוצאה PCR על ג'ל; מוצר 60 נ"ב עבור PCRs שני צפויה amplicons המשמש הכלאה ו 130bp עבור amplicons עבור סידור ברקוד). המוצרים PCR אז יכול להיות מאוחסן ב -80 ° C ללא הגבלת זמן.
3. תנור Prewarm הכלאה הטמפרטורה ל 42 ° C ו להגדיר אמבט מים רותחים בדלי קרח המכיל slurry קרח מים.
4. טרום רטוב מערכי ידי לאט מתמלא המאגר הכלאה μl 120 1X.
5. דגירה במאגר הכלאה ב 42 ° C ו 20 סל"ד במשך 10 דקות.
6. הכינו תערובת של 90 μl הכלאה לפי המדגם, ועוד אחד נוסף חיץ, כדלקמן: 75 הכלאה μl חיץ 2X, 0.5 oligonucleotide μl B213 הביקורת (0.2 fm / μl), 12 oligonucleotides מעורבת μl (12:05 / μl), 3 μl 50X Denhardt של פתרון) במנעול העליונה צינורות 0.5 מ"ל.
7. הוסף 30 μl uptag PCR ו 30 μl downtag PCR לערבב 120 הכלאה μl עבור בהיקף כולל של 150 μL. מרתיחים במשך 2 דקות וקבע ב קרח מים לפחות 2 דקות. בקצרה לסובב את הצינורות לפני השימוש.
8. הסר את חוצץ מראש הכלאה בין מערכים ומוסיפים 90 הכלאה μl / לערבב PCR. כדי למנוע אידוי, לכסות את מערך אטמים עם ספוט קשוח. להכליא עבור 16 שעות 42 ° C, 20 סל"ד.
9. טרי להכין 600 ביוטין μl תיוג לערבב לדגימה ועוד אחד נוסף, כדלקמן: 180 μl 20X SSPE, 12 μl 50X של Denhardt 6 μl 1% Tween 20 (כרך / כרך), 1 μl 1 מ"ג / מ"ל ​​streptavidin-phycoerythrin, 401 μl DDH ₂ O. אחסן את כל streptavidin-PE דגימות בחושך. Aliquot 600 μl לתוך צינורות 2 מ"ל. הסרת כתמים קשים, מבית שבבי.
10. לאט לאט להסיר לערבב הכלאה בין מערכים על ידי פיפטה ולמלא microarrays עם 120 μl לשטוף א ראש תחנת fluidics Affymetrix.
11. שטפו את מערכי באמצעות fluidics Affymetrix התחנה על פי הוראות היצרן, באמצעות "גנים Flex_Sv3_450" פרוטוקול בשינויים הבאים: 1 צעד נוסף עם שטפי (1 מחזור, 2 תערובות) לפני מכתים, שטפי הטמפרטורה ב 42 ° C במקום 40 ° C, כתם על 42 מעלות צלסיוס במקום 25 ° C. אפשר גם לבצע את ההכלאה לשטוף לפרסם, מכתים ביוטין, ואת לשטוף מכתים לפרסם באופן ידני (ראה עמ '396 התייחסות 15). בעקבות פעולות fluidics, להפעיל את התחנה fluidics "SHUTDOWN_450" פרוטוקול.
12. בעקבות לשטוף, לוודא שאין בועות אוויר נוכחים. אם יש צורך להוסיף 90 לשטוף μl ו פיפטה לאט עד הבועות להיעלם. אם יש סימנים או SMudges על פני מערך, לנקות את חלון זכוכית עם isopropanol ו ונטולת מוך רקמות. החל טרי קשוח כתמים על אטמים / septa והמקום מערכים של הסורק.
13. סריקה בתוך סורק Affymetrix GeneArray באורך גל 560 ננומטר פליטת.

5. מערך ניתוח (ראה איור 2 למשל שהושגו באמצעות קנדידה אלביקנס אוסף שיבוש)

1. מיסוך Outlier: כי מערך TAG4 Affymetrix מכיל 5 משכפל של משלימים זה את הברקוד מפוזרים באופן אקראי כל בדיקה ברקוד אשר חורג מן משכפל ניתן רעולי פנים זרוקים. כדי לעשות זאת, עבור כל תכונה מערך שנראה outlier מבוסס על האות שלה לעומת 4 אחרים משכפל של תכונה זו, התוכנה שלנו בוחנת תחילה את 5 התכונות המקיפים את outlier החשוד, ייצור מטריצה ​​של 25 תכונות עם החשוד תכונה במרכז. אם> 13/25 בדיקות באזור זה שונה כל אחד אומר האישית שלהם לשכפל גזוז (הממוצע של שלושת באמצע משכפל, למעט הגבוה ביותר והנמוך ביותר משכפל) על ידי יותר מ -10%, בדיקה זו נמחקת אז מניתוח נוסף. כי חריגים כאלה לרוב תוצאה של חוסר עקביות פוסט הכלאה כביסה, אנו להרחיב או "כרית" באזור המכיל בדיקות החשוד. Pad בדיקות כאלה כולל כל בדיקות ברדיוס 5-בדיקה, כפי שהוגדר על ידי ((x _{1-x 2)} ² + (y _{1-y 2)} ^{2) ½} <6 כאשר x _1, x _2, y _1, y ₂ הן x ו-y עבור שתי התכונות. לבסוף, לבטל את התכונות עבורו סטיית התקן (כלול בקובץ. Cel עבור מערכים Affymetrix) של פיקסלים תכונה / מתכוון פיקסלים תכונה. לאחר הסרת חריגים, ממוצע עוצמת ערכים עבור כל שנותר משכפל.
2. הסרת תגי שמיש: תגיות בעוצמה נמוכה ערכים ייתן באיכות ירודה התוצאות יש להסיר. הפסקת הדרה עבור אלו בדיקות בעצימות נמוכה יכול להיות מחושב באופן הבא:
   1. עבור זוג טיפול שליטה כלשהי של מערכים, לחשב יומן _{2 ((i-c-b g)} / (i _{t-b g))} עבור כל תג, שם אני _c הוא עוצמת הביקורת, אני _לא הוא את עוצמת הטיפול, ו-b הוא _גרם את עוצמת הממוצע של בדיקות תג לא מסומנים.
   2. זוג uptag ויחסים downtag על ידי זן ועבור כל זוג תג, לקחת את העוצמה מינימום שני תגים שתי דגימות. מיין זוגות יחס מעוצמת זה המינימום.
   3. השתמש גודל חלון הזזה של 50 זוגות על יחס מדורגת, לחשב את המתאם של uptag ו downtag זוגות יחס בתוך החלון. גם לחשב את הממוצע של עוצמות המינימום מחושב בשלב הקודם.
   4. החלק את החלון על ידי 25 זוגות, וחזור על השלב הקודם עד שכל זוגות כבר חצתה.
   5. מגרש את עוצמת המינימום הממוצע לעומת המתאם uptag-downtag עבור כל החלונות.
   6. לבסוף, בחר סף עצימות: בדרך כלל אנו משתמשים בו ערך עוצמת המתאם הראשון מגיע 80% לרמה המקסימלית שלה. דגל ולהסיר ניתוח נוסף לכל התגיות מתחת לציון הזה.
3. תיקון הרוויה: כי כל תכונה על microarray את הברקוד יכול להיות רווי, את האות על מערך TAG4 לא קשורה באופן ליניארי לריכוז תג. כדי לתקן את הרוויה זה לעקוב אחר פרוטוקול המתואר התייחסות ^16.
4. נורמליזציה מערך: עבור כל מערך, לנרמל את uptags ו downtags בנפרד. כדי לנרמל quantile, בדרגת הערכים שהתקבלו עבור כל מערך uptags ו downtags כדי בעוצמה הולכת וגוברת. כדי לנרמל את ממוצע עבור כל קבוצה של uptags ו downtags, לחלק מתכוון. נורמליזציה הממוצע של כל מערכי היא השלב השני לאחר הפיכת נתונים גולמיים לממוצע של מערך זה.
5. חישוב ציוני רגישות שליטה טיפול השוואות: כדי להשתמש ₂ יומן יחסי כמדד של רגישות: עבור כל זן, לחשב יומן ₂ ((μ _{c-b g)} / _(t-b μ _g)), שם μ _c הוא ממוצע עוצמת עבור דגימות שליטה, μ _t היא עוצמת מתכוון דגימות טיפול, b _g הוא העוצמה הממוצע של בדיקות לא מסומנים. זנים עם יחס חיובי יומן ₂ רגישים לטיפול, ואלה הם עמידים יש יחס שלילי ₂ יומן.

6. הערכת הכושר של זני שמרים המינימרקטים על ידי רצף

1. בידוד DNA מבריכות המחיקה כפי שתואר עבור microarrays.
2. Amplify כל ברקוד 20-mer uptag עם primers המשולב המורכב של רצפים של primers ברקוד משותף רצפי נדרש הכלאה של flowcell Illumina (ראו טבלה של primers Illumina ואיור 3 עבור תרשים של amplicon). אלהprimers ניתן להשתמש desalted ללא טיהור נוספים. PCR מתבצעת 100μL, באמצעות PCR Supermix Invitrogen פלטינום (קט 'מס' 11306-016) עם התנאים הבאים: 95 ° C / 3 דקות, 25 מחזורים של 94 ° C/30 שניות, 55 ° C/30 שניות, 68 ° C/30 שניות; ואחריו 68 ° C/10 דקות.
3. לטהר את מוצר ה-PCR (~ 130bp) עם Qiagen MinElute 96 UF-PCR טיהור Kit (קט 'מס' 28051).
4. לאחר טיהור PCR, לכמת DNA עם קוואנט-IT Invitrogen dsDNA BR Assay Kit (חתול מס 'Q32853). אל תסמוך על 260/280 קריאה!
5. נרמל ריכוז ה-DNA כדי כרכים 10μg/ml ובריכת שווה של ה-DNA תקין.
6. ה-DNA ונקווה הפרד על ג'ל 12% polyacrylamide TBE 3-4 שעות, תלוי מתח בשימוש.
7. הכתם ג'ל עם ethidium ברומיד (Sybr גרין צריך לעבוד גם) במשך 30 דקות.
8. אתר הלהקה של הריבית על Lightbox UV longwave (לבוש הגנה בפני המתאים), לחתוך את זה והוציא את ה-DNA באמצעות למחוץ ולספוג שיטה ¹⁷ ואחריו משקעים אתנול.
9. ודא כי ה-DNA בגודל המתאים (130bp) כבר מבודדים כי primers הוסרו באמצעות Bioanalyzer Agilent רגישות גבוהה ערכת DNA (חתול מס '5067-4626).
10. לדוגמה סידור:
    1. Illumina פלטפורמה GAIIx:
       1. יצירת אשכולות על יחיד קראו flowcell באמצעות הדור cBOT ו Single-Cluster קראו Kit (חתול מס 'GD-300-1001). במשך קרא 1, מעלה ומטה, תג primers סידור שונה הם אספו בריכוז מניות 100uM והוסיף צינור רצועה (0.6μL של פריימר כל רצף 100uM ב μl 120 HT1). SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 מתכון משמש ליצירת צבירי R1.
       2. סידור על Analyzer הגנום IIx. לאחר 18 מחזורים ברצף, מודול ה-end מותאמים משמש רצועת first גדיל מסונתז rehybridize flowcell, באמצעות R1 Illumina (להלן). אשכולות הם מחדש ועל רצף של 5 מחזורים כדי ללכוד את תג המדד.
11. רצף תג אינדקס משמש רצפים bin לתוך פחי ניסיוני.
12. בתוך סל כל ניסיוני, הברקוד רצפים שמרים נספרים לתת המספר הכולל של סופר עבור כל ברקוד.
13. ספירת הם מנורמל quantile כך כל ניסוי יש הפצה לספור אותו. על ידי אנלוגיה עם microarray ברקוד ניסויים כושר, כושר פגם יחסי עבור כל זן מחושבים והביע כיחס יומן ₂ (שליטה / טיפול). חיובי פגם עשרות כושר מסמנים ירידה שפע זן במהלך הטיפול בסמים עולה כי גרסה wild-type של הגן שנמחקו זן הדרוש התנגדות תרופה או מעכב.

הערה: בהתחשב בר seq כחלופה הכלאה המערך. עם העלויות של סידור תפוקה גבוהה יורד, באמצעות תפוקה גבוהה רצף כמו readout של שפע תג הופך להיות ריאלי, ובמקרים רבים, הוא יותר חסכוני ^18. בדרך זו, הגברה מוצר PCR נמדדת ישירות כמו "סופר", ולא כמו עוצמת האות כמו הכלאה למערך. זה מבטל נגטיבים שווא חיוביות הנובעות תג צולבות זיהום, הרוויה, או בעיות הנובעות עוצמות אות גבוהות מאוד או נמוך מאוד. יתר על כן, בניסויים רבים ניתן לשלב לפני ריצוף על ידי תוספת של דנ"א 08/04 בסיס מדד ^19. מכיוון ברקודים שמרים הם 20 נ"ב, אחד, 2-צעד לקרוא של 26-28 בסיסים לוכדת גם מדד זמנית ו ברקוד ייחודי, המאפשר ריבוב + 100 קיצוניים. בזמן כתיבת שורות אלה, בר seq מציע יתרון העלות על בר קוד microarrays, יתר על כן, בר seq היא גמישה מטבעה כזו כפי שמספר קורא / ריצה, רמת ריבוב יכול להגדיל עלויות ירידה נוספת . כמה "אמצע קיבולת" sequencers מכל היצרניות הגדולות פלטפורמה יהיה עוד יותר דמוקרטיזציה בר seq, עם רצף צפויה להפוך את ההודעה של בחירה.

פרוטוקול זה גם אומתו על HiSeq2000 Illumina.

הפגנה מעולה של שימוש בר seq לכתובת שאלה ביולוגית בסיסית בשליטה צמיחה Saccharomyces cerevisiae מוצג מחקר שנערך לאחרונה על ידי Gresham et al. ²⁰ אשר מתאר מספר תכנון הניסוי חשוב והנחיות פרשנות.

7. אימות של נתונים ההקרנה נקווה

התוצאות מכל מסך גנומיקה פונקציונלית צריך להיות מאומת באמצעות זנים בודדים תרבות מבודדת. כי כל ניסוי יהיה שונה במונחים של מספר זנים רגישים, בחירת מספר זנים של המועמד לאשר היא שרירותית למדי. כמדריך, בדירוג הזנים הרגישים ביותר ביחס יומן או _2-Z ציון ובדיקת% העליונים של המועמדים 25-50 (אשר בדרך כלל מתרגם ל 2-3 תקן דהviations מן הממוצע של כל זני בבריכה) הוא איזון טוב בין עלות ותועלת. אישורים בודדים ניתן לבצע כל בקבוק אבל אנו מבצעים בדיקות אלה במשך 5 דורות של גידול 96 צלחות היטב באמצעות inoculum התחלתי של 0.06 OD ₆₀₀ ב 100 μl של התקשורת ספקטרופוטומטר רועד במדידות כל 15 דקות (ראה איור 4) .

8. נציג תוצאות

לאחר מסך הגנום כולו תושלם, ואת מערכי כבר מנורמל ואת ההתנהגות של כל זן בהשוואה לטיפול שליטה (למשל על ידי השוואת עוצמות microarray או רצף ספירות / זן) הנתונים הם מניפולציה בקלות בקובץ אקסל עם הגנים מדורגת על ידי log2 יחסי שליטה / ניסוי. באופן זה, כך גדל יחס log2 שלילית, רגיש יותר כי זן מסוים הוא תנאי הבדיקה. קבצים אלה ניתן להתוות מצטיינים במגוון רחב של גרפים חבילות תוכנה. אנו מוצאים אותו הפשוטה העלילה יחסי log2 על ציר Y ואת הגן או שמות ORF על ציר ה-X. בדוגמה המוצגת באיור 2a, כגון חלקת טיפול clotrimazole (סוכן פטריות ידוע) מוצג. כל זן הרגישים משמעותית לטיפול עם יחס של 2 log2 מודגשים באדום, ואנחנו היינו בדרך כלל לוודא רבות של זנים כאלה מבחני צמיחה אישית של כל מוטציה בנוכחות של ריכוז זהה של התרופה. בדוגמה זו, 4 זנים מודגשים, NCP1, ERG2 ו 2 אללים עצמאית של ERG11, היעד של חלבון ידוע clotrimazole. כל אחד מהם 4 גנים מעורבים באופן ישיר ביוסינתזה ergosterol, את השמרים המקבילה של כולסטרול. לדוגמה, NCP1 מקודד NADP reductase-ציטוכרום P450 כי הוא מעורב ביוסינתזה ergosterol ואשר קשורה מוסדר מתואמת עם Erg11. דוגמה זו מדגישה את העובדה כי היעד התרופה הידועה (Erg11) מזוהה במסך זה משוחד, כמו גם מספר מרכיבים מרכזיים אחרים של מסלול היעד. לבסוף, מספר הגנים המסומנים באדום מייצגים גנים העשויים להיות מעורבים ביוסינתזה ergosterol או תהליכים ביולוגיים נפרדים. כפי שצוין לעיל, כל זוהה זן רגיש כמו מסך ונקווה צריך להיות מאומת כמו רגישות שלה assay צמיחה אישית. בדוגמה המוצגת באיור 2b, ארבעה זנים הם אישרו להיות רגישים clotrimazole מבוסס על צמיחה וירידה שלהם ביחס למתח wild-type ההורה, BWP17. אלה עקומות גדילה בודדים מדגישים תכונה חשובה של הגן כגון סמים מסכי ונקווה, כלומר לדרגת מוחלטת של זן מסוים אינה משקפת בהכרח ברמה המדויק של רגישות. יתר על כן, איור 2b מראה גם את הערך של בעל אללים מרובים עבור כל גן, במקרה זה, שתי מוטציות erg11 שיבוש יש מעט רגישויות שונות. בדיקת ההתאמה בין האופי של שיבושים אלה עם מידת הרגישות יכולה לספק תובנה נוספת לתוך מנגנון התרופות פעולה.

באיור 1. Workflow עבור assay צמיחה ונקווה וזיהוי ברקוד. תרבויות הם מחוסן עם aliquots מופשר של תאים ונקווה (שלב 1), גדל אז עבור המספר הרצוי של דורות (שלב 2) או רובוט (אופציה) או באופן ידני (אפשרות ב '). תאים נקצרים על ידי צנטריפוגה (שלב 3) ו-DNA הגנומי הוא מבודד אז מתאי שנקטפו (שלב 4), uptags ו downtags הם מוגבר באופן עצמאי (שלב 5), הכלאה למערך (שלב 6a או רצף ישירות לשלב 6 ב).

איור 2. נתוני המדגם נאספו בנקודות מסוימות של הפרוטוקול. (א) נתונים לדוגמה מתוצאות המיון (מותאם מ - ^13). הבריכה של מוטנטים מתויג היה גדל במשך 20 דורות בנוכחות clotrimazole ו DMSO (שליטה). התחבר יחס ₂ (עוצמת / טיפול בעוצמה מלאה) היה מחושב זממו כפונקציה של הגן. זנים רגישים מאוד (אדום) כללה את היעד ידוע clotrimazole, ERG11p. שים לב assay זה לעתים קרובות חושף מוטנטים רגישים אחרים בנוסף היעד בפועל של המתחם. באופן כללי, מוטנטים הם אלו לפעול סינטטי עם יעד, אלה הם חלק בתגובה ללחץ / טיפול כללי, הן חיוביות שגויות או שאינן מצליחות לאשר. (ב) דוגמה של נתוני אישור (מותאם מ - ^13). תוצאות של מבחני צמיחה ונקווה ניתן תוקף על ידי גידול זן בתרבות הפרט לעומת צמיחה נגד wild-type (שחור).

איור 3. מבנה amplicon המופק מבחני ברקוד ונקווה עבור הכלאה microarray או רצף ברקוד. Amplicon מיוצר עבור כל מוטציה in האוסף מכיל הומולוגיה כדי הגנום לשילוב (אזורים כחול שכותרתו ATG ו TAA), ברקודים ייחודי (שכותרתו AG והצביע על ידי קורטוב שחור). עבור הכלאה microarray, primers המשותף כחול משמשים כדי להגביר בדיקה 60bp עבור הכלאה microarray. עבור סידור ברקוד, primers המורחבת משמשים תגובת PCR, המורכב רצפי קידוד מתאם Illumina (אדום בר), וכן מדד 6bases צולבות בוקע) ואת צבע יסוד משותף כחול תחל הזרם, ואת פריימר מרוכבים זהה (מינוס 6 המדד הבסיסי) עבור פריימר השני.

איור 4. מבחני צמיחה אישיות 1) Prescreening תרכובות נגד שמרים wild-type כדי לקבוע מינון מתאים להקרנה-הגנום רחב 2) אישור נובע מסכי הגנום רחב. (א) צלחת 96 קרקעית שטוחה גם מלא μl 100 ההשעיה התא OD של 0.062. גם כל יכול להכיל את המתח זהה (לקביעת מינון) או זן שונה סמים שילובים (עבור מבחני אישור). 2 μl של המתחם (מומס בדרך כלל DMSO) הוא הוסיף התאים גדלים עם הזמן רועד עבור שעות 16-20 ב 30 ° C. הריכוז הסופי של DMSO לא יעלה על 2%. בדוגמה זו, היטב כל הצלחת עקומת הצמיחה להתוות שחור נגד מזימה של עקומת הגדילה השליטה באדום. (ב) רזולוציית תמונה גבוהה של prescreens מספר שהושג עם התרופה דוגמה מעולף על גבי זו. בסדרה זו טיטרציה, IC _10-15 מתקבל עם המינון סגול יהיה מתאים פרופיל המחיקה (HIP HOP ו). בשל אי - ליניאריות בצפיפויות אופטיות גבוהות יותר, טקאן (או כל קורא צלחת דומה) מכנסי הש"כ חייב להיות מכויל באמצעות לאלה שהושגו עם "מסורתי" קובט שביל באורך 1 מ"מ.

Discussion

כאן, אנו התווה פרוטוקול, עם שינוי צנוע, יכול בקלות להיות מותאמים למגוון רחב של אוספים קיימים אוספים מוטציה המינימרקטים של מיקרואורגניזמים שונים על מנת ליצור קולקציות מוטציה מתויג. אנו מדגישים כי בעוד אנו מדווחים על פרוטוקול mutagenesis transposon מתוייגים עבור שמרים פתוגניים ג אלביקנס, פרוטוקול דומה מאוד יכול להתאים למגוון רחב של פטריות unicellular. השתנה, פרוטוקול זה עובד היטב בחיידקים ^13, וכיום אוספים במשך מספר הגנום פטריות וחיידקים נוספים בבנייה. נכון לעכשיו, assay זה מספק מקיף בלבד, הגנום כולו מסך משוחדת עבור גנים קטנים אינטראקציות מולקולה. תכונה אחת משכנעת במיוחד של assay הוא לא ידע קודם של הגן או מולקולה קטנה נדרשת. למרות ההיקף והעוצמה של מבחני אלה, עבירות שלהם במעבדות אחרות כבר הפריע במקצת על ידי השקעות ההון הראשוני אינפורמטיקה וכלים לניתוח התוצאות. עם אימוץ של readout רצף הדור הבא בשילוב עם כלים חזקים לניתוח, אנו מצפים להגדיל את האימוץ שלהם.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
אנטיביוטיקה	הספק וקטלוג מספרים
Carbenicillin	סיגמא, חלק # C1613
Kanamycin	סיגמא, חלק # K1876
spectinomycin	סיגמא, חלק # S0692
Chloramphenicol	סיגמא, חלק # C0378
ה-DNA לנקות וערכות ריכוז
QIAprep ספין Miniprep Kit	Qiagen, חלק # 27106
HiSpeed ​​מקסי פלסמיד Kit	Qiagen, חלק # 12663
QIAquick PCR ערכת טיהור	Qiagen, חלק # 28106
QIAquick ג'ל הפקת Kit	Qiagen, חלק # 28704
PCR ו ריאגנטים אלקטרופורזה
תקי פולימראז ה-DNA (Mg-free) הצפת	ניו אינגלנד Biolabs, חלק # M0320L
הפתרון Deoxynucleotide Mix	ניו אינגלנד Biolabs, חלק # N0447L
25 מ"מ MgCl 2	סיגמא, חלק # 63036
Agarose, טוען לצבוע, וגם חומצות גרעין כתם מתאים ג'ל אלקטרופורזה	שונים
חיץ 10X טה	סיגמא, חלק # T8280
1 Kb פלוס סולם DNA	Invitrogen, חלק # 10787026
YPD מרק
10 גרם של תמצית שמרים	סיגמא, חלק # Y1625
20 גרם Bacto peptone	BD Biosciences, חלק # 211677
20 גרם דקסטרוז	סיגמא, חלק # D9434
Labware
רב pipettes (1000, 200, ו - 20 μL)	שונים
מאגרי pipetting פנויה	שונים
15 ו 50 צנטריפוגות צינורות מ"ל	שונים
96 - ו 384, באר עמוקה צלחות טוב	Axygen מדעי, חלק # P-2ml-SQ-CS & P-384240SQCS
96-384-היטב היטב PCR צלחות הסרט חותם	שונים
פלייט רולר עבור רב גם צלחות איטום	סיגמא, חלק # R1275
30 ° C ו 37 ° C רועד חממות לגידול חיידקים ושמרים על הצלחות ועל צינורות	שונים
במבחנה transposon mutagenesis
EZ-Tn5 Transposase	Epicentre ביוטכנולוגיות, חלק # TNP92110
תפוקה גבוהה טרנספורמציה
Seqprep 96 HT ערכת הכנה פלסמיד	אדג' Biosystems, חלק # 84359
פוליאתילן גליקול, משקל מולקולרי 3350	שונים
ליתיום אצטט	סיגמא, חלק # 517992
6 צלחות, טוב, סטרילי	קורנינג, חלק # 3335
50 מ"ג / מ"ל ​​uridine	סיגמא, חלק # U3750
100x טריס-EDTA חיץ פתרון	סיגמא, חלק # T9285
1X TE/0.1M LiOAc	שונים
סלמון testis-DNA	סיגמא, חלק # 1626
צמיחה של אוספים המינימרקטים
48 גם הצלחות, אם גדל תרבויות צלחות	גריינר, חלק # M9437
צלחת חותמות דבק	ABgene, חלק # AB-0580
200 מ"ל צלוחיות תרבות	שונים
יכולת ספיגת ספקטרופוטומטר	שונים
טמפרטורה מבוקרת שייקר עבור 250 מ"ל צלוחיות או ספקטרופוטומטר רועד	שונים
Safe-Lock Tube Microcentrifuge, 2 מ"ל	Eppendorf, חלק # 0030 120.094
הכלאה ציוד
הכלאה תנור 640	Affymetrix, חלק # 800138
GeneChip Fluidic תחנה 450	Affymetrix, חלק # 00-0079
GeneArray סורק 3000	Affymetrix, חלק # 00-0212
מי האמבט רתיחה עם מתלה צף	שונים
הכלאה מתכלים
Genflex תג 16K מערך v2	Affymetrix, חלק # 511331
Denhardt של פתרון, להתרכז 50X	סיגמא, חלק # D2532
Streptavidin, R-phycoerythrin המצומד (SAPE)	Invitrogen, חלק # S866
Safe-Lock Tube Microcentrifuge, 0.5 מ"ל	Eppendorf, חלק # 0030 123.301
קטנטן קשוח כתמים	מגוונים ביוטק, חלק # LTTM-1000
0.5 M EDTA	BioRad, חלק # 161-0729
10% Tween	סיגמא, חלק # T2700
MES monohydrate חומצה חינם	סיגמא, חלק # M5287
MES מלח נתרן	סיגמא, חלק # M5057
5 M NaCl	סיגמא, חלק # 71386
20X SSPE	סיגמא, חלק # S2015
ביולוגיה מולקולרית כיתה מים	סיגמא, חלק # W4502
הכלאה primers	ספקים שונים (desalting רגילה)
Uptag	5 "GATGTCCACGAGGTCTCT 3"
Buptagkanmx4	5 "ביוטין GTCGACCTGCAGCGTACG-3"
Dntag	5 "CGGTGTCGGTCTCGTAG 3"
Bdntagkanmx4	5 "ביוטין GAAAACGAGCTCGAATTCATCG-3"
B213	5 "ביוטין CTGAACGGTAGCATCTTGAC-3"
Uptagkanmx	5 "GTCGACCTGCAGCGTACG 3"
Dntagkanmx	5'GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 "
Uptagcomp	5'AGAGACCTCGTGGACATC 3 "
Dntagcomp	5'CTACGAGACCGACACCG 3 "
Upkancomp	5'CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 "
Dnkancomp	5'CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 "
סידור primers: פלטפורמה Illumina	ספקים שונים
UpTag קדימה (100uM)	5 "CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T גת GTC CAC GAG GTC TCT 3"
UpTag הפוך (100uM)	5 "AAT גת ACG מהפקולטה לרוקחות אוכלים ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T אננננן GTC GAC CTG החטיבה CGT ACG 3"
DownTag קדימה (100uM)	5 "CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3"
DownTag הפוך (100uM)	5 "AAT גת ACG מהפקולטה לרוקחות אוכלים ACC ACC GAC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T אננננן CGG CGG TGT TCT CGT AG 3`
קראו 1 UP-תג seq פריימר (100uM)	5 "GTC GAC CTG החטיבה CGT ACG 3"
קראו 1 למטה תג פריימר seq (100uM)	5 "CGG CGG TGT TCT CGT AG 3"
קראו 2 סידור אינדקס פריימר (פריימר תקן Illumina R1) (100uM)	5 "AC ACT CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC-T 3"
סידור ריאגנטים נוספים / ציוד
Qiagen MinElute 96 UF-PCR ערכת טיהור	Qiagen, חלק # 29051
לשאוב אבק	כל ספק
Macherey-נגל אבק סעפת	Macherey-נגל, חלק # 740 681
Invitrogen קוואנט-IT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen, חלק # Q32853
Invitrogen קיוביט צינורות assay	Invitrogen, חלק # Q32856
40% acrylamide N פלוס 1%, N'-מתילן-bis-acrylamide, 37.5:1	ביו רד, חלק # 161-0148
מאגר טריס	סיגמא, חלק # T1503-1 ק"ג
בור Acid	סיגמא, חלק # B6768-500 גרם
EDTA 0.5m, pH 8.0	Teknova, חלק # E0306
אמוניום Persulfate	סיגמא, חלק # A3678-25 גרם
TEMED	Bioshop, חלק # TEM001.25
Ethidium פתרון ברומיד	Bioshop, חלק # ETB444.10
אמוניום אצטט 0.5m	Teknova, חלק # A2000
מגנזיום 10mm אצטט tetrahydrate	סיגמא, חלק # M0631-100 גרם
1mm EDTA, pH 8.0	ראה EDTA 0.5m, pH 8.0
אתנול	שונים
נתרן אצטט, pH 5.2	Teknova, חלק # S0297
מהירות בריק	שונים
יחיד קרא הדור Cluster Kit	Illumina, חלק # GD-300-1001
36 ג סידור v4 Kit	Illumina, חלק # FC-104-4002

סכומים	ריאגנטים
108 גרם	מאגר טריס
55 גרם	בור Acid
40mL	0.5m EDTA (pH 8.0)
הוסף DH 2 O ל 1L סימן

כרכים	ריאגנטים
5.8 מ"ל	40% acrylamide N פלוס 1%, N'-מתילן-bis-acrylamide, 37.5:1
12 מ"ל	DH 2 O
2 מ"ל	10X TBE
140 μl	10% אמוניום Persulfate
נפח כולל: 20ml