Barkodlu Maya Kütüphaneler Rekabet Genomik Ekranlar

Özet

Biz gen-ilaç ve gen-çevre etkileşimleri anlamak için kapsamlı, tarafsız genom ekranlar geliştirdik. Bu mutant koleksiyonlarını tarama yöntemleri sunulmaktadır.

Özet

Yeni nesil sıralama teknolojilerindeki gelişmeler sayesinde, neredeyse her gün yeni gen dizilimlerini erişimi var. Bu gelişmelerin temposu hızlanıyor, daha fazla derinlik ve genişlik umut verici. Bu olağanüstü gelişmelerin ışığında, genin işlevini tanımlamak için hızlı, paralel yöntemleri için ihtiyaç her zamankinden daha önemli hale gelir. Maya ve E. genom silme mutantlar koleksiyonları coli gen fonksiyon fonksiyonel karakterizasyonu için beygirleri olarak hizmet etmiş, ancak bu yaklaşım ölçeklenebilir değildir, mevcut gen silme yaklaşımları silinir ve doğrulanabilir bir genomu oluşturan genlerin her biri binlerce gerektirir. Bu çalışma tamamlandıktan sonra, biz yüksek verim fenotipleme takip edebilirsiniz. Geçtiğimiz on yıl boyunca, laboratuar, rekabetçi, minyatür, yüksek verimli genomu paralel olarak yapılabilir testleri geniş bir portföy rafine vardır. Bu paralelizasyon barkod mutasyonu için bir vekil olarak hizmet, çünkü DNA 'etiketler', ya da her bir mutant haline 'barkod' dahil edilmesi mümkündür ve bir mutant spor değerlendirmek için barkod bolluk ölçebilirsiniz. Bu çalışmada, DNA dizisi ve barkodlu mutant koleksiyonları arasındaki boşluğu doldurmak için çalışırlar. Bunu başarmak için yeni dizisi paralel barkod deneyleri kadar açılır, ancak zayıf mikropların karakterize bir kombine transposon kesintisiz barkodlama yaklaşımı tanıtmak. Bu yaklaşım göstermek için yeni bir Candida albicans barkodlu bozulması koleksiyonunu sergilemek ve hem mikroarray tabanlı ve yeni nesil sıralama tabanlı platformlar 10,000 toplamak için nasıl kullanılabileceğini tarif - 1.000.000, gen-gen ve ilaç-gen etkileşimleri tek bir deney .

Protokol

1. Arka plan bilgileri

, Barkod etiketleri taşıyan mutantlar üretmek için çeşitli yolları vardır. Altın standart laboratuarları oluşan bir konsorsiyum tarafından oluşturulan ve 2002 ¹ yılında tamamlanan Maya nakavt (YKO) toplanması. Orijinal YKO bu yana, diğer maya koleksiyonları oluşturuldu; farklı zorlanma kökenden, aşırı ifade yapıları kullanarak, E. olarak diğer mikroplar coli ^2. Buna paralel olarak, barkodlu shRNA kütüphaneleri oluşturmak için çaba hızla devam ediyor ve gerçekte, bu memeli koleksiyonları için tasarım ilkeleri birçok maya kabul edilmiştir. Barkodlu transpozonlar sistematik mutant koleksiyonları oluşturmak için hızlı, yaygın olarak uygulanabilir bir strateji nasıl göstermek için, son zamanlarda insan fungal patojen olan Candida albicans yaratılan bir koleksiyon üzerinde odaklanır . Candida üzerindeki çalışmaları S. barkod ekranlar başarısına dayalı cerevisiae, ve burada bir örnek organizma olarak kullanılır. Küçük değişiklikler süspansiyon kültüründe yetişen herhangi bir organizmanın ekrana kullanılacak örnek protokolü. Birkaç organizmalar dönüşümün gerekli yüksek oranda ve verimli mitotik rekombinasyon mükemmel silme mutantlar oluşturmak için gerekli olduğundan, buna göre biz bir genomik DNA kütüphanesi mutagenize in vitro transpozon mutagenez kullanan bir protokol geliştirilen ve daha sonra bu barkodlu genomik parçaları Candida albicans ³ dönüştürdü ^{, 4.} Orijinal YKO toplama ve gen ağları ^5-8, genom haploinsufficiency ^9, uyuşturucu hedef ve eylem ^10,11 mekanizması doğası ile ilgili temel keşiflerin rolünü, ve tüm genlerin esas olan genom başarısı esinlenerek ¹² diğer mikroplar bu yaklaşımın genişletilmesi tahmin son derece verimli olacaktır.

Aşağıdaki protokolü istenilen mutant koleksiyon oluşturduk (örneğin YKO veya Candida albicans bozulması toplama) ve ayrı ayrı arşivlenen suşları olarak kullanılabilir olduğunu varsayar . ^1,13,14 gerginlik inşaat ayrıntılı bir açıklama için bkz.

2. Tek bir havuza bireysel mutantlar birleştirin

1. Bir hafta havuzlu hücre alikotları (-80 ° C 'de süresiz olarak saklanabilir) oluşturmak için izin verin.
2. Tamamen ilgi suşları için dondurulmuş gliserol stokları çözülme ancak hücreleri> 2 saat çözülmüş kalır izin vermeyin.
3. 96-kuyu pin aracı sterilize ardından 2% 70 etanol banyolarında dips (örneğin pipet ucu kutusu kapakları), alev pin aracı ve 1 dakika boyunca serin kalan tüm hücreleri, kaldırmak için pin su aracı daldırma. Pin aracı ise etanol banyoları alev özen gösterin. Etanol hamamlarının tüm taşıma-over hücreleri Alevli ve kaldırılır sağlamak için su banyosu aşmalıdır. Su her 4-6 pinnings değiştirin.
4. 96-iyi steril pin araç hafifçe çözülmüş 96 plaka, girdap içine yerleştirin ve uygun antibiyotik dahil YPD-agar içeren bir Nunc Omni Tepsi hücreleri aktarmak. 30 maksimum boyutuna ulaşana kadar koloniler büyütün ° C (2-3d). Plakalar korumak için, biz ~ 384 suşları ile tek bir Omni-tepsi üzerine dört 96 kuyucuğu pekiştirmek için en yararlı buluyorum.
5. Koloniler büyüdü sonra, herhangi bir eksik veya yavaş büyüyen suşları not ve bu Repin ~ suşlarının geri kalanı gibi hücre kitlesinin 2X.
6. Mikrobiyoloji ortamı (alev ve steril laboratuar malzemeleri ile çalışmak, 5-10 ml medya ile sel plakası, 50 ml konik santrifüj tüpü içine sıvı artı hücreleri dökün. Hücre dağıtıcı ile 5 dakika ve tekrar süspansiyon koloniler için bekletin, ve gliserol eklemek % 15 veya DMSO ile 7 (% hacim / hacim).
7. Havuz OD ₆₀₀ ölçün ve nihai konsantrasyonu% 15 veya% 7 gliserol DMSO içeren medya ile 50 OD ₆₀₀ / ml (seyreltme veya santrifüj) ayarlayabilirsiniz.
8. -80 ° C, PCR şerit tüpleri ve dondurucuda 40 ul hacimleri kısım

3. Deneysel havuzu büyüme

Bu işlem Şekil 1'de özetlenmiştir.

1. Buz üzerinde çözülme havuzu alikotları (PCR tüp). Robotik kullanarak değilse, 5. adıma geçin.
2. Hemen 0,0625 bir OD ₆₀₀ 700 ul toplam hacmi 48 plaka aşılama, ilaç ya da seçim koşulu ile ortama (gently!) havuz sulandırmak. Plaka üzerinde en az bir uygun çözücü kontrolü ekleyin. (Iyi, yani en fazla 1) büyüme 5 nesildir ötesine deneyler için, medya ya da seçim koşulu ile bitişik kuyu, ancak YOK hücreleri doldurun.
3. Seal, plastik bir plaka mühür ile durum aerobik büyüme (örneğin, non-fermente karbon kaynakları) gerektiriyorsa, her bir kuyu tarafına doğru membran mühür delikleri delmek için 21 gauge iğne kullanmak.
4. 30 ° C'de bir deneysel belirleyiciler sallayarak bir spektrofotometre büyümekned sallayarak rejimi (örneğin titreme, yüksek ayar (veya ısı kontrollü Shaker), okuma kuyulardan az 14 dakika devam sallamak). Hücre süspansiyonu kısmı, soğuk bir plaka üzerinde kullanıcı tanımlı üretim noktaları, genelde 5, 10, 15 ve 20 kuşak büyüme robotik güvertede robot tarafından hasat ve kaydedilir. (Http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, iletişim bilgileri C. Nislow veya G. Giaever).
5. Manuel hücre büyümesi için bir başlangıç ​​0.002 OD _600, 250 ml kültür balonuna 50 ml kültürü aşılamak. Hücrelerin büyüme ~ 10 nesiller için 2.0 nihai bir OD ₆₀₀ (Saccharomyces veya Candida) ulaşıncaya kadar 30 ° C'de 250 rpm'de çalkalayınız. Ek büyüme nesillere temiz bir cam şişe içinde geri 0,02 2,0 OD600 seyreltilmesi hücreleri tarafından elde edilebilir.
6. Hasat en az 2 OD ₆₀₀ örnek / Safe-Lock mikrosantrifüj tüpleri içine her zaman nokta hücre birimleri.

Not: Her zaman açıklandığı gibi 1,5 ml tüp dondurucu alikotları doğrudan havuz 1-2 _OD 600 ekleyerek ve işleme (yani bir "T0 zaman noktası") herhangi bir yeni oluşturulan havuzda ilk gerginlik temsil değerlendirmek için bir başlangıç ​​hücre numune. aşağıda.

4. Genomik DNA izolasyonu, PCR ve mikroarray hibridizasyon veya sıralama

1. (Protokol I maya DNA'sı kullanarak durumunda), ya da ilgi organizma (özgü başka bir uygun yöntem alkol yağış standart fenol / kloroform ekstraksiyon çalışır üreticinin talimatlarına göre Zymo Araştırma YeaStar kiti ile hücreleri OD ₆₀₀ ~ 2 den genomik DNA arındırın çeşitli mikroplar için iyi). YeaStar kiti kullanılarak, protokolde belirtilen 1X TE 60 mcL yerine 0.1x TE 300 mcL ile DNA Zehir. Genomik DNA -80 ° C'de süresiz olarak saklanabilir
2. 33 ul GKD ₂ O, MgCl ₂ olmadan 6 ul 10X PCR buffer, 3 ul 50 mM MgCl _2, 1.2 ul aşağıdaki gibidir: reaksiyon şartları ile her bir örnek için iki PCR reaksiyonları için bir uptags ve downtags için bir ayarlayın 10 mM dNTP, 1.2 ul 50 mcM Yukarı veya Aşağı astar karıştırın, 0.6 ul 5 U / ml Taq polimeraz, 15 ul ~ 0.1 mg genomik DNA. Toplam hacmi 60 ul. Aşağıdaki koşulları: 72 ° C 3dk, ve 4 tutun ° C, 94 ° C'de 3 dakika, 30 siklus 94 ° C'de 30 sn, 55 ° C 30s, 72 ° C 30s altında Thermocycle Bir jel üzerinde elde edilen PCR ürünleri kontrol edin; hem PCR için 60 bp ürün barkod sıralaması için amplikonlarının) hibridizasyon ve 130bp için kullanılan amplikonlarının bekleniyor. PCR ürünleri daha sonra -80 ° C süresiz olarak saklanabilir.
3. 42 Prewarm hibridizasyon fırını ° C sıcaklık ve kaynar su banyosu ve bir buz-su bulamaç içeren bir buz kovası kurdu.
4. 120 ul 1X hibridizasyon tamponu ile yavaş yavaş dolum öncesi ıslak dizileri.
5. Hibridizasyon tamponu 42 ° C'de 20 rpm ve 10 dakika.
6. Aşağıdaki gibidir: 75 ul 2X hibridizasyon tamponu, 0.5 ul B213 kontrol oligonükleotid (0.2 fm / ml), 12 ul karışık oligonükleotidler (12:05 / ml), 3 ul, hibridizasyon örnek başına karışımı, artı bir tampon olarak ekstra 90 ul hazırlayın 0.5 ml tüpler kilit top 50X Denhardt çözüm).
7. 30 ul uptag PCR ve 30 ul downtag PCR 150 mcL toplam hacmi 120 ul hibridizasyon karışımına ekleyin. En az 2 dakika 2 dakika ve set buz-su kaynatılır. Kısaca kullanmadan önce tüpler dönerler.
8. Dizilerden ön hibridizasyon tamponu çıkarın ve 90 ul hibridizasyon / PCR karışımı ekleyin. Buharlaşmasını önlemek için, Tough-Spot bir dizi conta kapağı. 42 yaşında 16 saat için melezleşme ° C, 20 dak.
9. Aşağıdaki gibi Taze, numune başına 600 ul biotin etiketleme karışımı artı ekstra bir tane hazırlamak: 180 ul 20X SSPE, 12 ul 50X Denhardt Kullanıcı, 6 ul 1% Tween 20 (hacim / hacim), 1 ul 1 mg / ml streptavidin-fikoeritrin, 401 ul GKD ₂ O. Tüm streptavidin-PE örnekleri karanlıkta saklayın. 2 ml tüpler içine kısım 600 ul. Cips Zor noktalar oluşması çıkarın.
10. Pipet dizileri hibridizasyon karışımı yavaş yavaş kaldırmak ve 120 ul Yıkama A. Başbakan Affymetrix akışkansal istasyonu ile mikroarray'ler doldurun.
11. (1 döngüsü, 2 karışımları) boyama önce, B sıcaklığı 42 ° C yerine, yıkayın A Yıkama ile 1 ekstra adım: Aşağıdaki değişiklikler "Gen-Flex_Sv3_450" protokol kullanarak, üreticinin talimatlarına göre bir Affymetrix akışkansal istasyonu kullanarak dizilerin yıkayın 40 ° C, 42 leke ° C yerine 25 ° C (Bkz. s. 396 başvuru 15) elle yazılan hibridizasyon yıkama, biotin boyama, ve yazılan boyama yıkama gerçekleştirmek de mümkündür. Akışkansal işlemleri takiben, akışkansal istasyonu "SHUTDOWN_450" protokol çalıştırın.
12. Yıkama sonrasında, herhangi bir hava kabarcıkları mevcuttur sağlar. Kabarcıkları kayboluncaya kadar gerekli 90 ul Yıkama ve pipet yavaş yavaş eklerseniz. Herhangi bir işaretleri veya sm varsadizi yüzey udges, isopropanol ile cam pencere temiz ve tüy bırakmayan bir doku. Contalar / septa üzerinde uygulayın ve taze Tough-Spotlar tarayıcı dizileri yerleştirin.
13. , 560 nm bir emisyon dalga boyunda bir Affymetrix GeneArray tarayıcı tarayın.

5. Dizi analizi (Candida albicans bozulması toplama kullanılarak elde edilen bir örnek için bkz: Şekil 2)

1. Outlier maskeleme: 5 Affymetrix TAG4 dizi içerdiğinden, rastgele, maskeli ve atılabilir çoğaltır sapan herhangi bir barkod prob dağınık her barkod tamamlayıcı çoğaltır. Bunu yapmak için, her dizi özelliği için diğer 4 ile karşılaştırıldığında sinyali dayalı bir uç gibi görünen bu özellik, çoğaltır, yazılım ilk şüpheli ile 25 özellikleri bir matris üreten, şüpheli uç çevreleyen 5 özelliklerini inceler merkezi özelliği. > 13/25 probları bu bölgede her bireysel kesilmiş çoğaltmak ortalama (ortalama, orta üç çoğaltır çoğaltır en yüksek ve en düşük hariç)% 10 den fazla farklı ise, bu prob daha sonra daha fazla analiz atılır. Bu tür aykırı sonrası hibridizasyon yıkama tutarsızlıklar sonucu en sık olduğu için, genişletmek ya da "pad" bölgede şüpheli problar içeren. Tarafından tanımlandığı gibi 5-probe bir yarıçap içinde tüm problar dahil Tampon probları, _{((x 1-x} ²⁾ 2 + _(y 1 _y ^{2) 2)} ½ <6 x _{1, x 2, y 1} ve y ₂ iki özellik için x ve y koordinatları. Son olarak, özelliği piksel standart sapma (Affymetrix diziler için cel dosyasına dahil) / özellik piksel anlamına özellikler atın. Aykırı çıkardıktan sonra, geriye kalan tüm için ortalama yoğunluk değerleri çoğaltır.
2. Kullanılamaz etiketleri kaldırma: Etiketler düşük yoğunluklu değerleri ile düşük kaliteli sonuçlar verecek ve kaldırılması gerekir. Bu düşük yoğunluklu problar için bir dışlama kesme aşağıdaki gibi hesaplanır:
   1. Dizilerin herhangi bir tedavi ile kontrol çifti için, _i c kontrol şiddeti, _i t tedavi yoğunluğu olduğu, her etiket için _log 2 _{((i c-b} g) / _{(i t-b g))} hesaplamak ve b _g atanmamış etiketi probları ortalama yoğunluğudur.
   2. Suşu tarafından uptag ve downtag oranları Pair ve her etiketi çifti için iki örnek, iki etiketleri için minimum yoğunluğu. Bu minimum yoğunluk oranı çiftleri sıralayın.
   3. Sırada oranı çiftleri 50 sürgülü pencere boyutu, pencere içindeki oranı çiftleri uptag ve downtag korelasyonu hesaplamak. Ayrıca, önceki adımda hesaplanan asgari şiddetleri ortalama hesaplamak.
   4. 25 çift pencere Slayt ve tüm çiftleri çapraz kadar önceki adımı tekrarlayın.
   5. Uptag downtag korelasyon karşı tüm pencereleri için minimum ortalama yoğunluğu çizilir.
   6. Son olarak, bir yoğunluk eşiği seçin; genel olarak korelasyon ilk% 80 maksimum seviyeye ulaştığı yoğunluk değeri kullanın. Bu kesim altındaki herhangi bir etiketleri Bayrak ve daha fazla analiz kaldırmak.
3. Doygunluk düzeltme: barkod mikroarray her özelliği doymuş hale Çünkü, TAG4 dizi sinyal doğrusal etiketi konsantrasyonu ile ilgili değildir. Bu doygunluk referans ¹⁶ açıklanan protokol takip düzeltmek için.
4. Dizi normalleşme: her dizi için ayrı ayrı uptags ve downtags normalleştirmek. Normalleştirmek kantil için, her dizi, artan yoğunluk sırasına göre uptags ve downtags elde edilen değerler sıralaması. Uptags ve downtags her set için normale demek için, ortalama bölün. Tüm diziler ortalama normalleşme her dizi ortalama ham verileri dönüştürmek ikinci bir adım daha aşağıdadır.
5. Kontrol tedavi karşılaştırmalar için duyarlılık puanlarının hesaplanması: günlük ₂ oranları hassasiyet bir ölçü olarak kullanmak için: her bir suş için, günlük ₂ ((μ _{c-b g)} / (μ _{t-b g))} hesaplanması, burada μ _c kontrol örnekleri için ortalama yoğunluğu, μ _t tedavi örnekler için ortalama yoğunluğu ve b _g atanmamış probları ortalama yoğunluğu. Olumlu bir günlük ₂ oranı ile Suşlarının tedaviye duyarlı ve dirençli olan bu negatif günlük ₂ oranları var.

6. Sıralama tarafından barkodlu maya suşları fitness Değerlendirilmesi

1. Mikroarray'ler için açıklandığı gibi silme havuzlarından DNA'sı izole edin.
2. (Bkz. Tablo Illumina astar ve Amplikon bir diyagram Şekil 3) Illumina flowcell hibridizasyon için gerekli ortak barkod primerlerin dizileri ve dizileri oluşan kompozit primerler ile her 20-mer uptag barkod artırın. Buprimerler ek arıtma olmadan desalted kullanılabilir. ; 25 döngü, 94 ° C/30 saniye, 55 ° C/30 saniye, 68 95 ° C / 3 dk: PCR aşağıdaki koşullar Invitrogen Platinum PCR Supermix (Kat. No: 11.306-016) kullanarak, 100μL yapılır ° C/30 saniye, 68 ° C/10 dakika izledi.
3. Qiagen MinElute 96 UF PCR Arıtma Kiti (Kat. No: 28.051) ile PCR ürününün (~ 130bp) arındırın.
4. PCR saflaştırma, Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit (Cat No Q32853) ile DNA belirlenir. 260/280 okuma güvenmeyin!
5. Normalize DNA 10μg/ml ve havuz eşit hacimleri DNA konsantrasyonu Normale.
6. Kullanılan voltaj bağlı olarak 3-4 saat,% 12 poliakrilamid TBE jel üzerinde ayrı havuzlu DNA.
7. 30 dakika etidyum bromür (SYBR Green de çalışması gerekir) jeller Leke.
8. (Uygun yüz koruyucu giyen) Uzundalga UV lightbox faiz bant bulun, kesip ve ezilme kullanarak DNA ayıklanır ve etanol yağış ¹⁷ yöntem bekletin.
9. Uygun büyüklükte DNA (130bp) izole edilmiş ve bu primerler Agilent Bioanalyzer Yüksek Hassasiyet DNA kiti (Cat No 5.067-4626) kullanılarak kaldırıldı onaylayın.
10. Örnek sıralama:
    1. Illumina GAIIx platformu:
       1. CBOT ve Tek-Read Küme Üretimi Kiti (Cat No GD-300-1001) Tek Salt flowcell kümeleri oluşturun. Oku 1 için, UP ve DOWN-etiketi değiştirilmiş sıralama primerler 100uM stok konsantrasyonda toplanmış ve bir şerit-tüp (120 ul HT1 her 100uM sıralama astar 0.6μL) eklenir. Tarif SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 R1 kümeleri oluşturmak için kullanılır.
       2. Genome Analyzer IIx Sıralama. 18 sıralama döngüleri, Eşleştirilmiş sonu modülü Illumina R1 (aşağıda) kullanılarak, sentezlenen ilk iplikçik şerit ve flowcell rehybridize kullanılır. Kümeler rejenere ve dizin etiketi yakalamak için 5 devir için sıralı.
11. Endeks etiketi sırası deneysel bidonları içine bin dizileri için kullanılır.
12. Her deneysel bin içinde, maya barkod dizileri her barkod sayımı toplam sayı vermek sayımı.
13. Her deney aynı sayısı dağılımı böylece sayar kantil normalize edilir. Barkod mikroarray fitness deneyler, her bir suş için fitness kusur oranları ile kıyas yoluyla günlük ₂ oranı (kontrol / tedavi) olarak hesaplanır ve ifade. Pozitif spor kusur puanları ilaç tedavisi sırasında zorlanma bolluk içinde bir azalma anlamına gelir ve bu zorlanma silinen genin yabani tip sürümü uyuşturucu ya da inhibitör direniş için gerekli olduğunu göstermektedir.

Not: Bar-seq dizi hibridizasyon bir alternatif olarak göz önüne alındığında. Yüksek verimli sıralama maliyetler, azalan etiketi bolluğun bir okuma olarak yüksek verimli sıralama ile uygulanabilir olma ve birçok durumda, daha fazla maliyet ¹⁸ etkili. Bu şekilde, amplifiye PCR ürününün doğrudan sinyal yoğunluğu olarak bir dizi melezleşmiştir olarak değil, 'sayıları' olarak ölçülür . Bu etiketi çapraz kontaminasyon, doygunluk, ya da çok yüksek veya çok düşük sinyal intensitesi kaynaklanan sorunlar kaynaklanan yanlış negatif ve pozitif ortadan kaldırır. Ayrıca, birden fazla deneyler 4-8 baz DNA indeksi ¹⁹ ilavesi ile sıralama önce kombine edilebilir. Maya barkodlar 20 bp, 100 için aşırı izin 2-aşamalı multiplex indeksi ve benzersiz barkod yakalar 26-28 üsleri okuma tek, + çoğullama . Bu yazının yazıldığı zamanda, Bar-seq Bar-kod mikroarray'ler üzerinde bir maliyet avantajı sunuyor ve ayrıca, Bar-seq okuma / run artar sayısı olarak, çoğullama düzeyini daha da maliyetleri düşürmek için artırabilir gibi doğası gereği esnek . Önemli bir platform üreticilerinden çeşitli "orta kapasiteli" sıralayıcıları daha fazla tercih okuma hale gelebilecektir sıralama, Bar-seq demokratikleştirmek.

Bu protokol aynı zamanda Illumina HiSeq2000 onaylandı .

Gresham ve ark tarafından yapılan son çalışmada, Saccharomyces cerevisiae, büyüme kontrolü temel bir biyolojik soruya cevap Bar-seq mükemmel bir gösteri ^sunuldu. 20 anahat birçok önemli deneysel tasarım ve yorumlama kuralları .

7. Toplanmış tarama veri doğrulaması

Herhangi bir fonksiyonel genomik ekran sonuçlar, bireysel suşlar izole kültür ile doğrulanması gerekir. Onaylamak için aday suşlarının numarasını seçerek, her bir deney duyarlı suşlarının sayısı bakımından farklılık Çünkü biraz keyfi. Bir rehber olarak, günlük ₂ oranı ya da z-skoru ile en hassas suşlar (genellikle 2-3 standart de çevirir hangi sıralama ve adayların% 25-50 testviations havuzunda tüm suşları) ortalama maliyetlerin ve faydaların arasında iyi bir denge. Bireysel teyidinde herhangi bir cam şişe içinde yapılır ama biz, (Bakınız Şekil 4), 100 sallayarak spektrofotometre medya ul _0.06 OD 600 bir başlangıç ​​inokulum kullanarak, her 15 dakikada bir ölçüm alarak 96 kuyucuğu büyüme 5 nesildir bu testleri .

8. Temsilcisi Sonuçlar

Bir genom-geniş ekran ve dizileri normalize edilmiş ve her suşu davranışı en kolay veri genleri ile bir excel dosyası manipüle (örneğin mikroarray şiddetleri karşılaştırarak veya sıralama sayıları / zorlanma) bir kontrol tedavi ile karşılaştırıldığında log2 oranları kontrol / deney göre sıralanmış. Bu şekilde, olumsuz log2 oranı daha fazla, daha hassas özellikle suşu test durumu. Bu excel dosyaları çeşitli yazılım paketleri grafik çizilebilir. Y ekseni ve X ekseni üzerinde gen ya da ORF isimleri log2 oranları çizmek için basit bulabilirsiniz. Şekil 2a gösterilen örnek, böyle bir komplo klotrimazol tedavi (bilinen bir antifungal ajan) gösterilir. 2 log2 oranı ile tedavi önemli ölçüde duyarlı tüm gerginlik kırmızı vurgulanır ve biz genellikle aynı konsantrasyonda ilacın varlığı, her bir mutant bireysel gelişim testlerinin bu suşları birçok doğrulamak. Bu örnekte, 4 suşlar NCP1, ERG2 ve ERG11 2 bağımsız allel klotrimazol bilinen protein hedef vurgulanır. Bu 4 genlerin her biri doğrudan ergosterol biyosentezi, kolesterol eşdeğer maya yer almaktadır. Örneğin, NCP1 ergosterol biyosentezi yer almaktadır ve Erg11 ile ilişkili ve koordineli olarak düzenlenmiş olan bir NADP-sitokrom P450 redüktaz kodlar . Bu örnek, bilinen bir ilaç hedefi (Erg11) bu tarafsız ekran tespit, hedef yolun yanı sıra diğer birçok anahtar bileşenleri olduğunu vurgulamaktadır. Son olarak, birkaç kırmızı vurgulanan genlerin ergosterol biyosentezinde veya farklı biyolojik süreçlerde yer olabilir genler temsil eder. Yukarıda belirtildiği gibi, havuzlu bir ekran hassas olarak tespit edilen her bir suş bireysel gelişim testinin duyarlılığını olarak kontrol edilmelidir. Şekil 2b gösterilen örnekte, dört suşları yabani tip ana gerilme, BWP17 göre azalmış büyüme dayalı klotrimazol için duyarlı olmaya teyit edilir. Bu bireysel bir büyüme eğrileri gibi toplanmış gen-ilaç ekranlar önemli bir özelliği vurgulamak, bu belirli bir gerginlik mutlak sırada mutlaka hassasiyet tam yansıtmıyor. Ayrıca, Şekil 2b de bu durumda, her gen için birden fazla allel değerini gösterir, iki erg11 bozulması mutantlar biraz farklı hassasiyetleri var. Bu kesintileri hassasiyet derecesi ile doğa ilişkilendirerek eylem uyuşturucu mekanizması içine ek bilgi sağlayabilir.

Şekil 1 toplanmış büyüme tahlil ve barkod tespiti için iş akışı. Kültürler ile inoküle toplanmış hücreleri çözülmüş alikotları (adım 1) ve sonra ya robot nesiller istenilen sayıda (adım 2) için yetiştirilen (Seçenek A) veya manuel (Seçenek B). Hücreler santrifüj yoluyla hasat (adım 3) ve hasat hücreleri (adım 4) genomik DNA izole uptags ve downtags bağımsız (5 adım) amplifiye ve bir dizi (adım 6a veya doğrudan 6b adım dizisi) melezleşmiştir vardır.

Şekil 2. Örnek veri protokol belirli noktalarda toplanır. (A) tarama sonuçları ⁽¹³ adapte) örnek verileri. Etiketli mutantlar havuz klotrimazol ve DMSO (kontrol) huzurunda 20 nesiller için yetişmiştir. Günlük ₂ oranı (kontrol yoğunluğu / tedavi yoğunluğu) geninin bir fonksiyonu olarak hesaplanır ve çizilir oldu. Çok hassas suşların (kırmızı) klotrimazol, ERG11p bilinen hedef dahildir. Bu testte, bileşik gerçek hedefine ek olarak, sık sık diğer hassas mutantlar ortaya çıkarır. Genellikle, bu mutantlar hedefi ile sentetik olarak hareket ettiklerini, bir genel stres / tedavi yanıtının bir parçası olduğunu, ya da onaylamak için başarısız yanlış pozitif. (B) onay veri Örnek ⁽¹³ uyarlanmıştır). Toplanmış büyüme testlerin sonuçları, bireysel kültür gerginlik büyüyor tarafından doğrulanmış ve yabani tip büyüme (siyah) karşılaştırılır.

Şekil 3 mikroarray hibridizasyon veya Barkod sıralama için toplanmış barkod deneyleri üretilen Amplikon yapısı. Her mutant için üretilen Amplikon in toplama entegrasyonu için genom (ATG ve TAA etiketli mavi bölgeler), benzersiz barkod (AG etiketli ve siyah bir çizgi ile gösterilen) homoloji içerir. Mikroarray hibridizasyon için, mavi ortak primerler mikroarray hibridizasyon 60bp için bir prob yükseltmek için kullanılır. Barkod sıralama için, uzun primerler Illumina adaptörü (kırmızı bar) ve 6bases çapraz-kapakları index) ve upstream astar mavi ortak astar kodlama dizilerinin oluşan PCR tepki olarak kullanılan ve aynı bileşik astar (eksi ikinci astar için 6 temel indeks).

Şekil 4 1 için bireysel Büyüme deneyleri) genom ekranlarından sonuçlarının onaylanması) için uygun bir genom tarama ve 2 dozunu saptamak için, yabani tip maya karşı bileşikler prescreening. (A) 96 sıra düz alt plakası 0.062 bir OD 100 ul hücre süspansiyonu ile doludur. Her iyi, aynı suşu (doz-determinasyon) ya da farklı zorlanma ve ilaç kombinasyonları (onay deneyleri için) içerebilir. 2 ul bileşik (genellikle DMSO içinde çözünmüş) eklenir ve hücreler sürekli 30 C'de 16-20 saat süreyle sallayarak yetiştirilen ° C DMSO son konsantrasyon% 2 yi geçmemelidir. Bu örnekte, plaka, her iyi büyüme eğrisi siyah kırmızı kontrol büyüme eğrisi bir komplo karşı çizilmiştir. Biri diğerinin üstüne, üst üste örnek bir ilaç ile elde edilen çeşitli prescreens (B) Yüksek çözünürlüklü görüntü. Bu titrasyon serisi, IC _10-15 mor doz ile elde edilir ve silme profil (HIP HOP) için uygun olacaktır. Doğrusal olmayan yüksek optik yoğunlukları nedeniyle, Tecan (veya benzeri bir plaka okuyucu) ODS "geleneksel" 1mm yol boyu küvet ile elde edilen kullanılarak kalibre edilmelidir.

Tartışmalar

Burada, biz Etiketli mutant koleksiyonları oluşturmak için farklı mikroorganizmaların barkodlu mutant koleksiyonları mevcut koleksiyonları geniş bir yelpazede kolayca adapte edilebilir, mütevazı bir değişiklik ile bir protokol sıraladı. Patojenik maya C etiketli transposon mutagenez bir protokol bildirdin Biz vurgulamak albicans, çok benzer bir protokol, tek hücreli mantarlar geniş bir yelpazede adapte olabilir . Modifiye Bu protokol, bakteri ¹³ iyi çalışıyor ve şu anda ek fungal ve bakteriyel genomların bir dizi koleksiyonları yapım aşamasındadır . Şu anda, bu testte, gen-küçük molekül etkileşimleri için tek kapsamlı, genom tarafsız ekran sağlar. Testinin özellikle ikna edici bir özelliği gen ya da küçük molekül hiçbir ön bilgi gerekli olmasıdır. Bu testlerin kapsam ve gücüne rağmen, diğer laboratuarlara aktarılabilirliği sonuçların analizi için başlangıç ​​sermayesi yatırım ve bilişim araçları ile biraz engellemiştir. Analizi için güçlü araçlar ile birlikte bir sonraki nesil dizisi okuma kabulü ile, onların evlat edinme artmasını bekliyoruz.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Antibiyotikler	Satıcı ve katalog numaraları
Carbenicillin	Sigma, part # C1613
Kanamisin	Sigma, part # K1876
spectinomycin	Sigma, part # S0692
Kloramfenikol	Sigma, part # C0378
DNA Temizlik-up ve konsantrasyon kitleri
QIAprep Spin Miniprep Kiti	Qiagen, part # 27.106
HiSpeed ​​Plazmid Maxi Seti	Qiagen, part # 12.663
QIAquick PCR Arıtma Kiti	Qiagen, parçası # 28106
QIAquick Jel Ekstraksiyon Seti	Qiagen, part # 28.704
PCR ve elektroforez reaktifler
Taq DNA Polimeraz (Mg-serbest) Tampon	New England Biolabs, part # M0320L
Deoksinükleotid Çözüm Mix	New England Biolabs, part # N0447L
25 mM MgCl 2	Sigma, part # 63.036
Agaroz yükleme, boya, ve nükleik asit jel elektroforezi için uygun leke	Çeşitli
10X TAE tampon	Sigma, part # T8280
1 Kb Plus DNA Ladder	Invitrogen, parçası # 10787026
YPD suyu
10 g maya özü	Sigma, part # Y1625
20 g Bacto pepton	BD Biosciences, part # 211.677
20 g dekstroz	Sigma, part # D9434
Laboratuvar
Çok kanallı pipetler (1000, 200, ve 20 mcL)	Çeşitli
Tek kullanımlık pipetleme rezervuarları	Çeşitli
15 ve 50 ml santrifüj tüplerine	Çeşitli
96 - ve 384-Eh Derin Şey Tabaklar	Axygen Bilimsel parçası # P-2ml-SQ-CS & P-384240SQCS
96-ve 384-iyi PCR plakaları ve mühür filmi	Çeşitli
Plaka silindir, conta çok iyi plakaları için	Sigma, part # R1275
30 ° C ve 37 ° C plakalar üzerinde bakteri ve maya büyüyen ve tüpler sallayarak inkübatörler	Çeşitli
In vitro transpozon mutagenez
EZ-Tn5 Transposase	Epicentre Biyoteknoloji, part # TNP92110
Yüksek verim dönüşüm
Seqprep 96 HT Plazmid Hazırlık Seti	Kenar Biosystems, part # 84.359
polietilen glikol, moleküler ağırlığı 3350	Çeşitli
Lityum asetat	Sigma, part # 517.992
Steril, tabak 6-iyi	Corning, part # 3335
50 mg / ml üridin	Sigma, part # U3750
100X Tris-EDTA tampon çözelti	Sigma, part # T9285
1x TE/0.1M LiOAc	Çeşitli
somon testis DNA	Sigma, part # 1626
Barkodlu koleksiyonları Büyüme
48 kuyucuğu; plakalar kültürlerin büyüyen eğer	Greiner, part # M9437
Yapışkan levha contaları	ABgene, kısmen # AB-0580
200 mL kültür matara	Çeşitli
Absorbans yetenekli Spektrofotometre	Çeşitli
250 ml'lik şişeler veya sallayarak spektrofotometre ısı kontrollü çalkalayıcı	Çeşitli
Güvenli-Lock Mikrosantrifüj Tüp, 2 mL	Eppendorf, kısmen # 0030 120.094
Hibridizasyon ekipman
Hibridizasyon Fırını 640	Affymetrix, part # 800.138
GeneChip akışkan İstasyonu 450	Affymetrix, parça # 00-0079
GeneArray Tarayıcı 3000	Affymetrix, parça # 00-0212
Kayan kabinle birlikte Kaynar su banyosu	Çeşitli
Hibridizasyon sarf
Genflex Etiket 16K Dizi v2	Affymetrix, part # 511.331
Denhardt Çözüm 50X konsantre	Sigma, part # D2532
Streptavidin, Ar-fikoeritrin konjuge (SAPE)	Invitrogen, part # S866
Güvenli-Lock Mikrosantrifüj Tüp, 0,5 mL	Eppendorf, kısmen # 0030 123.301
Ufacık Tough-Spotlar	Çeşitlendirilmiş Biotech, part # LTTM-1000
0.5 M EDTA	BioRad, part # 161-0729
10% Tween	Sigma, part # T2700
MES serbest asit monohidrat	Sigma, part # M5287
MES sodyum tuzu	Sigma, part # M5057
5 M NaCl	Sigma, part # 71.386
20X SSPE	Sigma, part # S2015
Moleküler biyoloji notu suyu	Sigma, part # W4502
Hibridizasyon Astarlar	Çeşitli tedarikçileri (standart tuzsuzlaştırma)
Uptag	5 'GATGTCCACGAGGTCTCT 3'
Buptagkanmx4	5 'biotin GTCGACCTGCAGCGTACG 3'
Dntag	5 'CGGTGTCGGTCTCGTAG 3'
Bdntagkanmx4	5 'biotin GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3'
B213	5 'biotin CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3'
Uptagkanmx	5 '3 GTCGACCTGCAGCGTACG'
Dntagkanmx	5'GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 '
Uptagcomp	5'AGAGACCTCGTGGACATC 3 '
Dntagcomp	3 5'CTACGAGACCGACACCG '
Upkancomp	5'CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 '
Dnkancomp	5'CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 '
Sıralama Astarlar: Illumina Platformu	Çeşitli tedarikçilerden
UpTag İleri (100uM)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3'
UpTag Ters (100uM)	5 'AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T nnnnn GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3'
DownTag İleri (100uM)	5 'CAA GCA GAA GAC GGC ATA CGA GCT CTT CCG ATC T GAA AAC GAG CTC GAA TTC ATC G 3'
DownTag Ters (100uM)	5 'AAT GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T nnnnn CGG TGT CGG TCT CGT AG, 3 `
1 okuyun UP-tag sıra astar (100uM)	5 'GTC GAC CTG CAG CGT ACG 3'
1 AŞAĞI-etiket sıra astar (100uM)	3 5 'CGG TGT CGG TCT CGT AG'
2 Endeksi Sıralama astar (standart Illumina R1 astar) (100uM)	5 'AC ACT CTT TTK CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC T 3'
Ek Sıralama Reaktifler / Ekipman
Qiagen MinElute 96 UF PCR arıtma Takımı	Qiagen, part # 29.051
Vakum pompası	Herhangi bir satıcı
Macherey-Nagel Vakum Manifold	Macherey-Nagel, kısmen # 740 681
Invitrogen Quant-iT dsDNA BR Assay Kit	Invitrogen, part # Q32853
Invitrogen Qubit tahlil tüpleri	Invitrogen, part # Q32856
% 40 akrilamid artı% 1 N, N'-metilen-bis-akrilamid, 37.5:1	Bio Rad, part # 161-0148
Tris Base	Sigma, part # T1503-1KG
Borik Asit	Sigma, part # B6768-500G
0,5 M EDTA, pH 8.0	Teknova, part # E0306
Amonyum persulfate	Sigma, part # A3678-25G
TEMED	Bioshop, part # TEM001.25
Ethidium Bromür Çözümü	Bioshop, part # ETB444.10
0,5 M amonyum asetat	Teknova, part # A2000
10mM Magnezyum asetat tetrahidrat	Sigma, part # M0631-100G
1mm EDTA, pH 8.0	0,5 M EDTA, pH 8.0
Etanol	Çeşitli
Sodyum asetat, pH 5.2	Teknova, part # S0297
Hız vakum	Çeşitli
Tek-Read Küme Üretimi Kiti	Illumina, kısmen # GD-300-1001
V4 36C Sıralama Seti	Illumina, part # FC-104-4002

Tutarlar	Reaktifler
108 gram	Tris Base
55 gram	Borik Asit
40ml	0,5 M EDTA (pH 8.0)
DH 2 O 1L işareti

Hacimleri	Reaktifler
5.8 ml	% 40 akrilamid artı% 1 N, N'-metilen-bis-akrilamid, 37.5:1
12 ml	dH 2 O
2 ml	10X TBE
140 ul	% 10 amonyum persülfat
Toplam hacmi: 20ml