Конкурентные Геномная Экраны Barcoded Библиотеки дрожжей

Резюме

Мы разработали всеобъемлющую, объективной генома экранов, чтобы понять геном наркотиков и генотипа и среды взаимодействия. Методы анализа этих мутантов коллекции представлены.

Аннотация

В силу прогресса в следующем поколении технологий секвенирования, мы имеем доступ к новой последовательности генома почти ежедневно. Темп этих достижений ускоряется, обещая большую глубину и ширину. В свете этих экстраординарных достижений, потребность в быстрых, параллельные методы для определения функций генов становится все более важным. Коллекции генома удаления мутантов дрожжей и E. кишечной послужили рабочие лошадки для функциональных характеристик функции генов, однако такой подход не является масштабируемым, текущие генов удаления подходы требуют каждый из тысяч генов, составляющих геном для удаления и проверить. Только после этого работа будет завершена мы можем преследовать высокой пропускной фенотипирование. За последние десять лет, наша лаборатория имеет изысканный ассортимент конкурентоспособной, миниатюрных, высокой пропускной способности генома анализов, которые могут выполняться параллельно. Это распараллеливание возможно благодаря включению "метки" ДНК, или "штрих-кодов," в каждый мутант, с штрих-кодом, выступающей в качестве прокси-сервера для мутации и можно измерить штрих-кодов для оценки обилия мутантов фитнеса. В этом исследовании мы стремимся, чтобы заполнить разрыв между последовательностью ДНК и штрих-мутант коллекций. Для этого мы введем комбинированные нарушения транспозона-штрихкодирования подход, который открывает параллельные анализы штрих-код на вновь последовательности, но плохо характеризуется микробов. Чтобы проиллюстрировать этот подход, мы представляем новый Candida Albicans штрих коллекции нарушения и описать, как и микрочипов основе и секвенирования следующего поколения платформ могут быть использованы для сбора 10000 - 1000000 ген-ген и наркотиков гена взаимодействия в одном эксперименте.

протокол

1. Исходная информация

Есть несколько способов получения мутантов, несущих штрих-код тегов. Текущий стандарт золото Дрожжи KnockOut (YKO) коллекция, созданная консорциумом лабораторий и завершено в 2002 году ^1. С оригинальной YKO была введена, другие коллекции дрожжей были получены, в разных слоев деформации, используя более-выражением конструкции, так и в других микробов, таких как E. кишечной ^2. Параллельно с этим, усилия для создания штрих-кодом библиотеки shRNA идет быстро, и в самом деле, многие принципы построения этих млекопитающих коллекции были приняты из дрожжей. Чтобы продемонстрировать, как штрих-транспозонов может быть быстрым, широко применимые стратегии для создания систематической коллекции мутантов, мы фокусируемся на одной коллекции мы недавно создали в человеческом грибкового патогена, Candida Albicans. Наша работа по Candida было основано на успехе штрих-код экраны в С. CEREVISIAE, и используется здесь в качестве примера организма. Образец протокола, можно с небольшими изменениями можно использовать для экрана любого организма, которые могут быть выращены в суспензионной культуре. Поскольку лишь немногие организмы имеют необходимые высокие темпы преобразования и эффективной рекомбинации митотического, необходимые для создания идеального мутантов удаления, соответственно, мы разработали протокол, который использует транспозона мутагенеза в пробирке для mutagenize геномной библиотеки ДНК, а затем превратили эти штрих фрагментов геномной в Candida Albicans ^{3 , 4.} Вдохновленный успехом оригинальную коллекцию YKO и его роль в фундаментальных открытий о природе генных сетей ^5-8, генома haploinsufficiency ^9, целевой наркотиков и механизм действия ^10,11 и существенности всех генов в геноме ¹² мы ожидаем расширения этого подхода к другим микробам будет чрезвычайно плодотворным.

Протокол подразумевает, что желаемый мутант коллекция была создана (например, YKO или Candida Albicans нарушение коллекции) и доступна в качестве индивидуально архив штаммов. Для подробного описания деформации строительства видеть ^1,13,14.

2. Комбинат отдельных мутантов в единый пул

1. Разрешить одна неделя для создания объединенных ячейки аликвоты (может быть сохранено на неопределенное время при температуре -80 ° С).
2. Оттепель замороженные запасы глицерина для штаммов интереса полностью, но не позволяйте клетки остаются талых в течение> 2 часа.
3. Стерилизовать 96-и контактный инструмент, окуните контактный инструмент в воде, чтобы удалить все оставшиеся клетки, затем 2 провалы в 70% этанола ванны (например, крышки кончиком пипетки коробке), пламя контактный инструмент и остыть в течение 1 минуты. Позаботьтесь, чтобы пламя контактный инструмент от этанола ванн. Уровень этанола ванны должна превышать уровня в водяную баню, чтобы обеспечить все переноса клетки вспыхнули и удалены. Замените воду каждые 4-6 pinnings.
4. Вставьте стерильный 96-и контактный инструмент в талых 96-луночного планшета, вихрем мягко и передачи клеткам лоток Nunc Omni содержащие YPD-агар в том числе соответствующим антибиотиком. Рост колоний пока они не достигнут максимальный размер при 30 ° С (2-3г). Для экономии тарелки, мы находим его наиболее полезным для консолидации четыре 96-луночных на одном Omni-поднос с ~ 384 штаммов.
5. После колонии выросли, отметить любые отсутствующие или медленно растущих штаммов и Репин эти правила в ~ 2X клеточной массы, как и остальные штаммы.
6. Работая в среде микробиологии (с пламенем и стерильные лабораторного оборудования, наводнение пластины с 5-10 СМИ мл, выдержите в течение 5 минут и ресуспендируют колонии с ячейки распределителя. Налейте жидкость плюс клеток в 50 мл коническую трубку центрифуг, а также добавлять глицерин, чтобы 15% или DMSO до 7% (объем / объем).
7. Измерить диаметр ₆₀₀ из бассейна и настройка (при разбавлении или центрифугирования) до конечной концентрации 50 OD ₆₀₀ / мл среды, содержащей 15% глицерина или 7% ДМСО.
8. Алиготе в 40 мкл в ПЦР полосы трубы и замерзать при -80 ° C.

3. Экспериментальные роста бассейн

Описание этой процедуры приводится на рисунке 1.

1. Оттепель бассейн аликвоты (в пробирки для ПЦР) на льду. Если не используется робототехника, переходите к шагу 5.
2. Сразу разбавленном (осторожно!) бассейн в средах с наркотиками или условие выбора, прививая на OD ₆₀₀ из 0,0625 в общем объеме 700 мкл в 48-луночного планшета. Включите по крайней мере одного подходящего растворителя контроль на тарелку. Для экспериментов, которые выходят за 5 поколений роста (то есть более чем на 1 лунку), заполнить соседних скважин со средствами массовой информации или условие выбора, но NO клетками.
3. Печать с пластиковой пластиной уплотнение, а если состояние требует аэробных роста (например, не способный к брожению источников углерода), используйте 21 иглы для прокалывания отверстий в мембране уплотнения в сторону каждой скважины.
4. Растут в спектрофотометр, потрясая при 30 ° С с экспериментально определеНед пожимая режима (например, дрожание 14 мин при максимальных настройках (или контролируемой температурой шейкер), читать скважин, резюме встряхивания). Часть суспензии клеток могут быть собраны на робота и сохраняется на холодную пластину на роботизированной перекладиной через заданный пользователем поколения временных точках, как правило, 5, 10, 15 и 20 поколений роста. (Http://med.stanford.edu/sgtc/technology/access.html, для контактных С. Nislow или G. Гиавера).
5. Для ручного рост клеток, привить 50 мл культуры на запуск OD ₆₀₀ из 0,002 в 250 колбе культуры мл. Встряска при 30 ° С при 250 оборотов в минуту, пока клетки достичь окончательного OD ₆₀₀ из 2.0 (для Saccharomyces или Candida) для ~ 10 поколений роста. Дополнительная поколений рост может быть получен путем разбавления клеток OD600 от 2,0 до 0,02 обратно в свежем колбу.
6. Урожай по крайней мере ~ 2 OD ₆₀₀ единиц клетки для каждого образца / временной точке в безопасном-Lock труб микроцентрифужных.

Примечание: всегда собирают начальной ячейки образца (то есть "T0 момент времени") для оценки начального представления напряжения в любой вновь созданный пул, добавив 1-2 OD ₆₀₀ из бассейн прямо из морозильника аликвоты в 1,5 мл трубки и обработки, как описано ниже.

4. Геномная выделения ДНК, ПЦР и гибридизации микрочипов или секвенирования

1. Purify геномной ДНК из ~ 2 OD ₆₀₀ клеток с Zymo исследований YeaStar комплект в соответствии с инструкциями изготовителя (Протокол I при использовании дрожжей ДНК) или другим подходящим методом характерных для организма интереса (стандартные фенол / хлороформ добыче следуют алкоголя осадков работ также для разнообразных микробов). При использовании комплекта YeaStar, элюции ДНК с 300 мкл 0.1X TE вместо 60 мкл ТЕ-1X, указанного в протоколе. Геномная ДНК можно хранить бесконечно при температуре -80 ° C.
2. Установить два ПЦР для каждого образца, по одному для uptags и один для downtags, с условиями реакции следующим образом: 33 мкл DDH ₂ O, 6 мкл 10х буфера ПЦР без MgCl _2, 3 мкл 50 мМ MgCl _2, 1,2 мкл 10 мМ дНТФ, 1,2 мкл 50 мкМ вверх или вниз грунтовку перемешать, 0,6 мкл 5 ед / мкл Taq-полимеразы, ~ 0,1 мкг геномной ДНК в 15 мкл. Общий объем составляет 60 мкл. Thermocycle при следующих условиях: 94 ° C 3 мин, 30 циклов 94 ° C 30, 55 ° C 30, 72 ° C в 30-х годов, а затем 72 ° C 3 минуты, и держать при температуре 4 ° C. Проверьте в результате ПЦР-продуктов на гель, 60 б.п. продукт как для ПЦР ожидается ампликонов используется для гибридизации и 130bp для ампликонов для штрих-кодов последовательности). ПЦР-продукты можно хранить при температуре -80 ° C до бесконечности.
3. Prewarm температура гибридизации духовку до 42 ° C и создать кипящей водяной бане и льда ведро ледяной воды шлама.
4. Предварительно мокрой массивов, медленно заполнения 120 мкл 1X буфере гибридизации.
5. Инкубируйте в гибридизации буфера при 42 ° С и 20 оборотов в минуту в течение 10 минут.
6. Подготовка 90 мкл гибридизации смеси на образец, плюс один дополнительный в качестве буфера, а именно: 75 мкл буфера 2X гибридизации, 0,5 мкл B213 контроль олигонуклеотида (0,2 фм / мкл), 12 мкл смешанных олигонуклеотидов (12,5 пм / мкл), 3 мкл 50X Денхардта раствора) в замке-топ 0,5 мл пробирок.
7. Добавить 30 мкл uptag ПЦР и 30 мкл ПЦР downtag до 120 мкл смеси для гибридизации общем объеме 150 мкл. Кипятить 2 минуты и установить в ледяной воде в течение 2 минут. Кратко спина трубы перед использованием.
8. Удалите предварительно гибридизации буфер из массива и добавить 90 мкл гибридизации / ПЦР смеси. Для предотвращения испарения, крышка массив прокладки Жесткая-Spot. Гибридизации в течение 16 часов при температуре 42 ° C, 20 оборотов в минуту.
9. Недавно подготовить 600 мкл смеси маркировки биотина на один образец, плюс один дополнительный, а именно: 180 мкл 20X ГНПП, 12 мкл 50X Денхардта, 6 мкл 1% Tween 20 (об / об), 1 мкл 1 мг / мл стрептавидином фикоэритрин, 401 мкл DDH ₂ O. Храните все стрептавидином-PE образцов в темноте. Алиготе 600 мкл в 2 мл пробирок. Удалить TOUGH-Пятна от чипов.
10. Медленно снимите гибридизации смесь из массивов, пипетки и заполнить микрочипы с 120 мкл Вымойте А. премьер станции Affymetrix струйной.
11. Вымойте массивы, используя Affymetrix струйной станции в соответствии с инструкциями производителя, используя "Ген-Flex_Sv3_450" протокол со следующими изменениями: 1 дополнительный шаг с Мойте (1 цикл, 2 смеси) перед окрашиванием, вымыть B температуре 42 ° С вместо 40 ° C, пятно на 42 ° С вместо 25 ° C. Кроме того, можно выполнять после мытья гибридизации, окрашивания биотин, и мыть после окрашивания вручную (см. стр. 396 в ссылке 15). После струйной операций, запустить станцию ​​струйной "SHUTDOWN_450" протокол.
12. После мытья, убедиться в отсутствии пузырьков воздуха присутствуют. Если необходимо добавить 90 мкл Вымойте и пипетка медленно, пока пузырьки исчезают. Если Есть какие-либо отметки или смudges на поверхности массива, чистые стекла с изопропанола и безворсовой ткани. Применяют свежие пятна TOUGH-за прокладки / перегородки и место массивов в сканер.
13. Сканирование в сканер Affymetrix GeneArray на излучение длиной волны 560 нм.

5. Массив анализа (см. Рисунок 2 для примера получены с помощью нарушения Candida Albicans коллекции)

1. Выброс маскировки: Потому что массив Affymetrix tag4 содержит 5 повторов каждого штрих-кода дополнением рассеяны случайно любой штрих-код зонд, который отличается от репликации могут быть скрыты и отбрасывается. Для этого для каждого массива особенность, которая, как представляется, выброс на основе его сигнала по сравнению с другими 4 повторяет эту функцию, наше программное обеспечение анализирует первые пять функций, которые окружают подозревают выброс, производя матрица из 25 черт с подозреваемым особенность в центре. Если> 13/25 зонды в этом регионе отличаются друг от их индивидуальной отделкой повторить их среднее значение (среднее средних трех повторяет, за исключением высокой и самой низкой повторяет) более чем на 10%, этот зонд, после чего сбрасывается из дальнейшего анализа. Потому что такие выбросы чаще всего результат после гибридизации несоответствия стирки, мы расширяем или "площадка" область, содержащая подозревают зондов. Pad таких зондов, включая все зонды в течение 5-зонд радиуса, как это определено в ((х _{1-х ²⁾ 2} + (у _{1-й ²⁾ 2)} ^½ <6, где х _1, х _2, у _1, и у _2, х и у координаты две особенности. И наконец, отказаться от функций, для которых стандартное отклонение (входит в состав. Чел файла для массивов Affymetrix) художественных пикселей / среднее особенность пикселей. После удаления выбросы, средние значения интенсивности для всех остальных повторяет.
2. Удаление непригодных теги: Теги с низкой интенсивностью значения даст некачественные результаты и должны быть удалены. Исключение отсечки для этих низких зондов интенсивность может быть рассчитана следующим образом:
   1. Для любого лечебно-контроль пары массивов, рассчитать журнал ₂ ((я _с-г б) / (я _т-г б)) для каждого тега, где я _{с-контроль} интенсивности, я _т такое лечение интенсивности, и б _г является средней интенсивности неназначенный зондов тега.
   2. Пара uptag и downtag отношения к деформации и для каждого тега пары, взять минимальную интенсивность для двух меток в двух образцах. Сортировать соотношение пар этот минимум интенсивности.
   3. Использование скользящего окна размером 50 на место соотношение пар, рассчитать соотношение uptag и downtag отношения пары в пределах окна. Кроме того, вычислить среднее значение минимальной силы света рассчитывается в предыдущем шаге.
   4. Слайд окна на 25 пар, и повторите предыдущий шаг, пока все пары были скрещены.
   5. Участок средней интенсивности по сравнению с минимальным uptag-downtag корреляции для всех окон.
   6. Наконец, выберите пороговой интенсивности, в целом мы используем значение интенсивности, где корреляция первой достигает 80% от максимального уровня. Флаг и снять с дальнейшего анализа тэги, ниже этой отсечки.
3. Насыщенность коррекции: Потому что каждая функция на штрих-код микрочипов может стать насыщенным, сигнал на tag4 массив не линейно, связанные с тегом концентрации. Для исправления этой насыщенности следовать протоколу, описанному в ссылку ^16.
4. Массив нормализации: для каждого массива, нормализуют uptags и downtags отдельно. Чтобы нормализовать квантиль, звание значения, полученные из каждого массива для uptags и downtags в порядке возрастания интенсивности. Чтобы нормализовать означать для каждого набора uptags и downtags, разделить на виду. Означает нормализация всех массивов второй следующего шага преобразования необработанных данных в среднем каждом массиве.
5. Расчет чувствительности оценки для контроля обращения сравнения: чтобы использовать журнал ₂ соотношениях в качестве показателя чувствительности: Для каждого штамма, рассчитать журнал ₂ ((μ _{с г-б)} / (μ _т-г б)), где μ _с- средняя интенсивность для контрольных образцов, μ _т является средней интенсивности для лечения образцов, и б _д средней интенсивности неназначенный зондов. Штаммы с положительным отношением журнал ₂ чувствительны к лечению, и те, которые являются стойкими иметь негативные журнал ₂ соотношениях.

6. Оценка пригодности штрих штаммов дрожжей путем секвенирования

1. Изоляция ДНК из удаления бассейны, как описано для микрочипов.
2. Amplify каждый 20-Мер uptag штрих-код с композитными грунтовки состоят из последовательности общие праймеры штрих-кода и последовательности, необходимые для гибридизации с проточной Illumina (см. таблицу Illumina грунтовки и на рисунке 3 диаграмма ампликона). ЭтиПраймеры могут быть использованы обессоленной без дополнительной очистки. ПЦР выполняется в 100 мкл, с использованием ПЦР Invitrogen Платиновый Supermix (кат. № 11306-016) на следующих условиях: 95 ° C / 3 мин, 25 циклов 94 ° С/30 сек, 55 ° С/30 сек, 68 ° С/30 с; затем 68 ° C/10 мин.
3. Purify продукта ПЦР (~ 130bp) с Qiagen MinElute 96 UF ПЦР Очистка Kit (кат. № 28051).
4. После очистки ПЦР количественно ДНК с Invitrogen Квант-IT дцДНК BR Пробирной Kit (№ по Q32853). Не полагайтесь на 260/280 показания!
5. Нормализация концентрации ДНК в 10μg/ml и бассейн равных объемах нормированных ДНК.
6. Отдельные объединения ДНК на 12% полиакриламидном геле КЭ в течение 3-4 часов в зависимости от напряжения используется.
7. Пятно гели с этидий бромид (SYBR Green должны работать, а) в течение 30 минут.
8. Найдите группу процентов по лайтбокс УФ длинноволновой (ношение соответствующей защиты лица), вырезать ее и извлекли ДНК с использованием измельчить и замочить метод ¹⁷ последующим осаждением этанолом.
9. Убедитесь, что соответствующие ДНК размером (130bp) был изолирован и что праймеры были удалены с помощью Agilent Bioanalyzer высокая чувствительность ДНК комплект (№ по 5067-4626).
10. Пример последовательности:
    1. Illumina GAIIx платформы:
       1. Создание кластеров на одном-Рида проточной использованием CBOT и Едином-Рида Kit генерации кластеров (№ по GD-300-1001). Для Прочитайте 1, вверх-вниз-теги изменение последовательности праймеров объединенных в 100 мкм концентрация акций и добавлены в стрип-трубки (0.6μL каждого праймера 100 мкм последовательности в 120 мкл HT1). Рецепт SR_Amp_Block_StripTubeHyb_v7.0 используется для генерации R1 кластеров.
       2. Секвенирование генома на анализатор IIx. После 18 циклов последовательности, парные конца модуль используется для полосы синтезированных первой цепи и rehybridize проточной ячейкой, используя Illumina R1 (см. ниже). Кластеры регенерируется и последовательно в течение 5 циклов для захвата тег индекса.
11. Последовательность Индекс тег используется для бен последовательностей в экспериментальных лотков.
12. В каждой экспериментальной мусорное ведро, последовательности дрожжей штрих-кода подсчитываются, чтобы дать общее число отсчетов для каждого штрих-кода.
13. Графы являются квантиль нормированы так, каждый эксперимент имеет такое же распределение в счет. По аналогии со штрих-кодом микрочипов фитнес-экспериментов, фитнес дефект отношений для каждого штамма рассчитываются и выражается в журнале ₂ соотношение (контроль / лечение). Положительные оценки дефекта фитнес означать снижение напряжение изобилие во наркологических и предположить, что дикий тип версии гена удален в том, что напряжение требуется для сопротивления, что лекарство или ингибитора.

Примечание: Учитывая, Бар-след как альтернатива массиву гибридизации. В стоимость такой высокой пропускной последовательности уменьшается, использованием высокой пропускной последовательности, как считывание тегов изобилие становится возможным и во многих случаях является экономически более эффективным ^18. Таким образом, усиливается ПЦР-продукта измеряется непосредственно, как «считает», а не как сигнал интенсивности гибридизации с массивом. Это позволяет избежать ложных негативов и позитивов, которые возникают из тега перекрестного загрязнения, насыщенность, или вопросов, связанных с очень высокой или очень низкой интенсивности сигнала. Кроме того, многочисленные эксперименты могут быть объединены до секвенирования путем добавления ДНК 4-8 базовый индекс ^19. Поскольку дрожжи штрих-коды на 20 б.п., один сингл, 2-х ступенчатый читаем 26-28 баз захватывает оба индекса мультиплекс и уникальным штрих-кодом, что позволяет для экстремальных 100 + мультиплексирования. На момент написания этой статьи, Бар-след предлагает ценовое преимущество над штрих-кода микрочипов, и более того, Бар-далее по своей сути гибким, что как число операций чтения / выполнения увеличивается, уровень мультиплексирования может увеличиться до дальнейшее снижение затрат . Несколько "средней мощности" секвенсоры от всех основных производителей платформа дальнейшей демократизации Бар-след, с последовательными, вероятно, станет считывания выбора.

Этот протокол также были проверены на Illumina HiSeq2000.

Отличная демонстрация использования Бар-след для решения фундаментальных биологических вопрос в Saccharomyces контролировать рост CEREVISIAE представлен в недавнем исследовании Грешам и соавт. ^20, которые выделить несколько важных опытно-конструкторских и интерпретации принципов.

7. Проверка объединенных данных скрининга

Результаты от любого функциональной геномики экран должен быть проверены с помощью отдельных штаммов в изолированных культуры. Потому что каждый эксперимент будет отличаться с точки зрения числа чувствительных штаммов, выбирая число кандидатов штаммов для подтверждения является несколько условным. В качестве ориентира, рейтинг самых чувствительных штаммов журнал ₂ отношение или Z-счет и тестирование верхней 25-50% кандидатов (обычно переводится как 2-3 стандартом де-viations от среднего значения всех напряжений в бассейне) это хороший баланс между затратами и выгодами. Индивидуальные подтверждения может быть выполнена в любом колбу, но мы проводим эти тесты уже 5 поколений роста в 96-луночных использованием начиная посевной на 0,06 OD ₆₀₀ в 100 мкл среды в пожимая спектрофотометр, замеры каждые 15 минут (см. рисунок 4) .

8. Представитель Результаты

После генома экрана завершена, и массивы были нормализованы и поведение каждого штамма по сравнению с контролем лечения (например, путем сравнения интенсивности микрочипов или последовательности отсчетов / деформации) данные являются наиболее легко манипулировать в файл Excel с генами ранжированных по log2 отношениями контроля / эксперимент. Таким образом, чем больше отрицательное отношение log2, более чувствительны, что особый штамм, чтобы условия теста. Эти файлы Excel могут быть построены в различных графических пакетов программного обеспечения. Мы находим его проще всего участка log2 отношения на оси Y и ген или ORF имена на оси X. В примере, показанном на рис 2а, такой сюжет клотримазол лечения (известный противогрибковый препарат) показан. Все напряжение, которые значительно чувствительны к лечению log2 соотношении 2 выделяются красным цветом, и мы, как правило, проверить многие из таких штаммов в отдельных тестах рост каждого мутанта в присутствии той же концентрации препарата. В этом примере, 4 штамма выделены, NCP1, ERG2 и 2 независимых аллелей ERG11, известная белка-мишени из клотримазол. Каждый из этих 4 генов, непосредственно участвующих в биосинтезе эргостерола, дрожжи эквивалент холестерина. Например, NCP1 кодирует НАДФ-цитохром Р450 редуктазы, который участвует в биосинтезе эргостерола и который связан и согласованно регулируемый с Erg11. Этот пример подчеркивает тот факт, что известный препарат цели (Erg11) отождествляется в этой беспристрастной экрана, а также ряд других ключевых компонентов целевой путь. Наконец, некоторые из выделенных генов в красном представляют гены, которые могут быть вовлечены в биосинтез эргостерола и в различных биологических процессах. Как упоминалось выше, каждый штамм обнаружен в качестве чувствительных в объединенный экран должен быть проверен, чтобы ее чувствительность в отдельных анализ роста. В примере, показанном на рисунке 2, б, четыре штамма подтверждают, чувствительны к клотримазол в зависимости от их роста снизились по сравнению с диким типом родительского штамма, BWP17. Эти индивидуальные кривые роста подчеркнуть важную особенность таких объединенных генов с наркотиками экранов, то есть абсолютное ранга конкретного штамма не обязательно отражает его точный уровень чувствительности. Кроме того, 2б также показывает ценность наличия множественных аллелей для каждого гена, в данном случае, два erg11 мутантов нарушения имеют немного отличающиеся чувствительности. Сопоставляя характер этих нарушений со степенью чувствительности может обеспечить дополнительное понимание наркотиков механизмом действия.

Рисунок 1. Последовательность действий для объединенного анализа роста и штрих-кодов обнаружения. Культуры засевают талой аликвоты объединенных ячеек (шаг 1), а затем выросли на нужное число поколений (шаг 2) либо робота (опция) или вручную (вариант Б). Клетки собирали центрифугированием (шаг 3) и геномной ДНК, затем выделяют из собранных клеток (шаг 4), uptags и downtags независимо усиливается (шаг 5) и гибридизации с массивом (шаг 6a или последовательный шаг непосредственно 6б).

Рисунок 2. Пример данных, собранных в определенных точках протокола. () Пример данных из результатов скрининга (адаптировано из ^13). Бассейн меченых мутантов выращивали в течение 20 поколений в присутствии клотримазол и ДМСО (контроля). Вход ₂ соотношение (контроль интенсивности / лечения интенсивность) был рассчитан и на графике как функцию гена. Высокая чувствительность штаммов (красного цвета) включены известные цели клотримазол, ERG11p. Заметим, что этот анализ часто раскрывает других чувствительных мутантов в дополнение к фактическим целевым соединением в. Как правило, эти мутанты являются те, которые действуют с синтетическим цели, те, которые являются частью общего стресса / ответа на лечение, или ложных срабатываний, что не подтверждают. (B) Пример подтверждения данных (адаптировано из ^13). Результаты анализов объединенных рост может быть проверена растущего напряжения в отдельных культуры и по сравнению с диким типом роста (черный).

Рисунок 3. Структура ампликона производится из объединенных анализах штрих-кодов для гибридизации микрочипов или штрих секвенирования. Ампликона производится для каждого мутанта ян коллекция содержит гомологию с геном для интеграции (синий регионах помечены ATG и ТАА), уникальный штрих-код (обозначение AG и указал на черное тире). Для микрочипов гибридизации, синий общих грунтовки используются для усиления 60bp зонда для гибридизации микрочипов. Для штрих-кодов последовательности, расширенные грунтовки используются в реакции ПЦР, состоящий из последовательности, кодирующие Illumina адаптер (красная полоса), а индекс 6bases перекрестной люков) и синий общих грунт для грунтовки вверх по течению, и то же композитный праймера (минус 6 базовый индекс) для второго праймера.

Рисунок 4. Индивидуальные тесты роста для: 1) Prescreening соединений против дикого типа дрожжей, чтобы определить необходимую дозу для генома скрининга и 2) подтверждение результатов из генома широкие экраны. (А) 96-плоским дном пластины заполнено 100 мкл суспензии клеток в ОП 0,062. Каждая скважина может содержать тот же штамм (для определения дозы) или различные комбинации напряжения и наркотиков (для подтверждения анализов). 2 мкл соединения (обычно растворяется в ДМСО) добавляется и клетки выращивают при постоянном встряхивании в течение 16-20 ч при 30 ° C. Конечная концентрация ДМСО не должна превышать 2%. В этом примере, в каждую лунку пластины роста кривую в черном против участок кривой контролировать рост в красный цвет. (B) Более высокое разрешение изображения нескольких prescreens получены на примере препарата накладывается на верхней части друг с другом. В этом титрование серии IC _10-15 получается с фиолетовыми дозы и целесообразно для удаления профилей (HIP HOP и). Из-за нелинейности при более высокой оптической плотности, Tecan (или любой подобный читатель пластины) ОР должен быть откалиброван с помощью этих, полученных с "традиционными" 1 мм пути длиной кюветы.

Обсуждение

Здесь мы изложили протокол, который, со скромной модификации, могут быть легко адаптированы к широкому кругу существующих коллекций штрих-мутант коллекций различных микроорганизмов для создания меткой мутант коллекций. Мы подчеркиваем, что в то время как мы уже сообщали протокол о меткой транспозона мутагенеза для патогенных дрожжей C. Albicans, очень похожий протокол может быть адаптирован для широкого круга одноклеточных грибов. Изменения, данный протокол хорошо работает в бактериях ^13, и в настоящее время коллекции для ряда дополнительных грибковых и бактериальных геномов находятся в стадии строительства. В настоящее время этот препарат обеспечивает только комплексный, генома беспристрастного экран для ген-малых взаимодействий молекулы. Одним из наиболее убедительных особенностью анализа является то, что никаких предварительных знаний о гене или маленькая молекула не требуется. Несмотря на огромный объем и мощность этих анализов, их передачи в другие лаборатории он был осложнен несколько начальными капиталовложениями и информатики инструменты для анализа результатов. С принятием следующего считывания последовательности поколения в сочетании с надежными инструментами для анализа, мы ожидаем, что их принятие, возрастет.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Антибиотики	Продавец и каталожные номера
Карбенициллин	Sigma, часть # C1613
Канамицин	Sigma, часть # K1876
спектиномицину	Sigma, часть # S0692
Хлорамфеникол	Sigma, часть # C0378
ДНК очистки и концентрации комплекты
QIAprep Спиновые Miniprep Kit	Qiagen, часть # 27106
HiSpeed ​​плазмиды Комплект Maxi	Qiagen, часть # 12663
QIAquick ПЦР Очистка Kit	Qiagen, часть # 28106
QIAquick Гель Добыча Kit	Qiagen, часть # 28704
ПЦР и электрофорез реагентов
Taq-ДНК-полимераза (Мг бесплатный) Буфер	New England Biolabs, часть # M0320L
Дезоксинуклеотидов Mix решение	New England Biolabs, часть # N0447L
25 мМ MgCl 2	Sigma, часть # 63036
Агарозы, погрузка краситель, и нуклеиновые кислоты пятно подходит для гель-электрофореза	Различный
10X TAE буфер	Sigma, часть # T8280
1 Кб Плюс ДНК Лестница	Invitrogen, часть # 10787026
YPD бульон
10 г дрожжевого экстракта	Sigma, часть # Y1625
20 г пептона Бакто	BD Biosciences, часть # 211677
20 г декстрозы	Sigma, часть # D9434
Лабораторное
Многоканальные пипетки (1000, 200 и 20 мкл)	Различный
Одноразовые пипетки резервуаров	Различный
15 и 50 мл центрифужные пробирки	Различный
96 - и 384-Ну Глубокое Ну Плиты	Axygen Научные, часть № Р-2 мл-SQ-CS & P-384240SQCS
96-и и 384-луночных ПЦР пластины и уплотнения фильм	Различный
Пластина ролик для герметизации мульти-луночных	Sigma, часть # R1275
30 ° C и 37 ° C пожимая инкубаторы для выращивания бактерий и дрожжей на тарелки и в трубах	Различный
В пробирке транспозона мутагенеза
EZ-Tn5 транспозазы	Эпицентр биотехнологии, часть # TNP92110
Высокая пропускная способность преобразования
Seqprep 96 HT плазмиды Kit Prep	Пограничный Biosystems, часть # 84359
полиэтиленгликоль, молекулярная масса 3350	Различный
ацетат лития	Sigma, часть # 517992
6-луночный, стерильный	Corning, часть # 3335
50 мг / мл уридина	Sigma, часть # U3750
100X Трис-ЭДТА буферного раствора	Sigma, часть # T9285
1X TE/0.1M LiOAc	Различный
Лосось яичка ДНК	Sigma, часть # 1626
Рост штрих коллекции
48-луночный, если растущие культуры в пластинах	Greiner, часть # M9437
Клей уплотнения пластины	ABgene, часть # AB-0580
200 мл колб культуры	Различный
Спектрофотометр способны поглощения	Различный
Температура контролируемой шейкер для 250 мл колб или встряхивания спектрофотометр	Различный
Безопасная-Lock Микроцентрифуга Тюбе, 2 мл	Эппендорф, часть # 0030 120.094
Гибридизация оборудования
Гибридизация духовки 640	Affymetrix, часть # 800138
GeneChip Fluidic станции 450	Affymetrix, часть # 00-0079
GeneArray Сканер 3000	Affymetrix, часть # 00-0212
Кипящей водяной бане с плавающей стойку	Различный
Гибридизация расходные материалы
Genflex тегов 16K массив v2	Affymetrix, часть # 511331
Денхардта Solution, 50X концентрат	Sigma, часть # D2532
Стрептавидином, R-фикоэритрин сопряжены (SAPE)	Invitrogen, часть # S866
Безопасная-Lock Микроцентрифуга Тюбе, 0,5 мл	Эппендорф, часть # 0030 123.301
Teeny TOUGH-Пятна	Diversified Biotech, часть # LTTM-1000
0,5 М ЭДТА	BioRad, часть # 161-0729
10% Tween	Sigma, часть # T2700
МЧС свободной кислоты моногидрат	Sigma, часть # M5287
MES-натриевая соль	Sigma, часть # M5057
5 М NaCl	Sigma, часть # 71386
20X ГНПП	Sigma, часть # S2015
Молекулярная биология воды класса	Sigma, часть # W4502
Гибридизация Грунтовки	Различные поставщики (стандартный обессоливания)
Uptag	5 'GATGTCCACGAGGTCTCT 3'
Buptagkanmx4	5 'биотин-GTCGACCTGCAGCGTACG 3'
Dntag	5 'CGGTGTCGGTCTCGTAG 3'
Bdntagkanmx4	5 'биотин-GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3'
B213	5 'биотин-CTGAACGGTAGCATCTTGAC 3'
Uptagkanmx	5 'GTCGACCTGCAGCGTACG 3'
Dntagkanmx	5'GAAAACGAGCTCGAATTCATCG 3 '
Uptagcomp	5'AGAGACCTCGTGGACATC 3 '
Dntagcomp	5'CTACGAGACCGACACCG 3 '
Upkancomp	5'CGTACGCTGCAGGTCGAC 3 '
Dnkancomp	5'CGATGAATTCGAGCTCGTTTTC 3 '
Секвенирование Грунтовки: Illumina платформы	Различные поставщики
UpTag вперед (100 мкм)	5 'CAA GCA ГАА GAC GGC ATA CGA GCT СТТ CCG УВД Т GAT GTC CAC GAG GTC TCT 3'
UpTag Reverse (100 мкм)	5 'ААТ GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT СТТ TCC ГТС САЦ GAC GCT СТТ CCG УВД Т NNNNN GTC GAC КТГ CAG ВКТ АЧГ 3'
DownTag вперед (100 мкм)	5 'CAA GCA ГАА GAC GGC ATA CGA GCT СТТ CCG УВД Т ГАА AAC GAG СТС GAA TTC УВД G 3 "
DownTag Reverse (100 мкм)	5 'ААТ GAT ACG GCG ACC ACC GAC ACT СТТ TCC ГТС САЦ GAC GCT СТТ CCG УВД Т NNNNN CGG TGT CGG TCT ВКТ AG 3 `
Прочитайте 1 UP-теги след праймера (100 мкм)	5 'GTC GAC КТГ CAG ВКТ АЧГ 3'
Прочитайте 1 DOWN-теги след праймера (100 мкм)	5 'CGG TGT CGG TCT ВКТ AG 3'
Прочитайте 2 Индекс последовательности праймера (стандартный Illumina R1 грунтовки) (100 мкм)	5 'AC ACT СТТ TCC ГТС САЦ GAC GCT СТТ CCG УВД, Т 3'
Дополнительные реагенты Секвенирование / Оборудование
Qiagen MinElute 96 UF ПЦР очистки Kit	Qiagen, часть # 29051
Вакуум-насос	Любой поставщик
Macherey-Nagel вакуумном коллекторе	Macherey-Nagel, часть # 740 681
Invitrogen Квант-IT дцДНК BR Пробирной Kit	Invitrogen, часть # Q32853
Invitrogen труб Кубит анализа	Invitrogen, часть # Q32856
40 акриламида% плюс 1% N, N-метилен-бис-акриламид, 37.5:1	Bio Rad, часть # 161-0148
Трис базы	Sigma, часть # T1503-1 кг
Борная кислота	Sigma, часть # B6768-500G
0,5 М ЭДТА, рН 8,0	Teknova, часть # E0306
Персульфата аммония	Sigma, часть # A3678-25G
TEMED	Bioshop, часть # TEM001.25
Бромистый этидий решения	Bioshop, часть # ETB444.10
0,5 М ацетата аммония	Teknova, часть # A2000
10 мМ ацетат магния тетрагидрата	Sigma, часть # M0631-100G
1 мМ ЭДТА, рН 8,0	Смотрите 0,5 М ЭДТА, рН 8,0
Этанол	Различный
Ацетат натрия, рН 5,2	Teknova, часть # S0297
Скорость вакуум	Различный
Single-Прочитано генерации кластеров Kit	Illumina, часть # GD-300-1001
36c Секвенирование Kit v4	Illumina, часть # FC-104-4002

Суммы	Реагенты
108 грамм	Трис базы
55 грамм	Борная кислота
40 мл	0,5 М ЭДТА (рН 8,0)
Добавить дН 2 O к 1L знак

Объемы	Реагенты
5,8 мл	40 акриламида% плюс 1% N, N-метилен-бис-акриламид, 37.5:1
12 мл	дН 2 O
2 мл	10X TBE
140 мкл	10% персульфат аммония
Общий объем: 20 мл