גזירת יעיל של אבות עצב נוירונים האדם מן האדם תאים pluripotent גזע עובריים עם אינדוקציה מולקולה קטנה

Summary

הקמנו פרוטוקול לזירוז של neuroblasts ישירה אנושי לתאי גזע עובריים pluripotent נשמר בתנאים מוגדרים עם מולקולות קטנות, המאפשרת גזירת אספקה ​​גדולה של אבות העצבית האנושית העצבית תא סוגים של פיתוח עבור מערכת העצבים המרכזית העצבית לתיקון.

Abstract

יש צורך גדול התגשמו מקור תא אנושי קליני מתאים העצבית לתיקון או התחדשות של מערכת נזק העצבים המרכזית (CNS) מבנה המעגלים בתעשיית הבריאות של היום. Cell טיפולים מבוססי לקיים הבטחה גדולה כדי להחזיר את תפקוד רקמת עצב אבוד בהפרעות מערכת העצבים המרכזית. עם זאת, טיפולים המבוססים על תאים CNS-derived בתאי גזע עצביים נתקלים הגבלת היצע קושי להשתמש בסביבה קלינית בשל היכולת הרחבה מוגבלת שלהם בתרבות פלסטיות נכשל לאחר ^1-3 passaging נרחב. למרות כמה תוצאות מועילות, CNS-derived תאים אנושיים גזע עצביים (hNSCs) מופיעים להפעיל השפעות טיפוליות שלהם בעיקר על ידי progenies הלא העצבית שלהם באמצעות trophic בייצור מולקולות neuroprotective להציל את התאים אנדוגני ^1-3. לחלופין, pluripotent בתאי גזע עובריים אנושיים (hESCs) להציע תרופות למגוון רחב של הפרעות נוירולוגיות ידי supplying את המגוון של סוגי התאים האנושיים העצבית העצבים המרכזית פיתוח להתחדשות ^1,4-7. עם זאת, איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של hESCs pluripotent ביעילות כצפוי על הפנוטיפ הרצוי כבר אתגר גדול עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליניים. הגישות המקובלות להסתמך על הנטייה רב שושלת היוחסין של תאים pluripotent באמצעות בידול נבט ספונטנית שכבה, וכתוצאה מכך מחויבות-השושלת יעיל ובלתי נשלט זה מלווה לעתים קרובות ההטרוגניות יציבות פנוטיפי, ולכן, סיכון גבוה tumorigenicity ^7-10. בנוסף, מוגדר תוספי ביולוגיים זרים / חיה ו / או ניזונים, כי יש בדרך כלל נעשה שימוש בבידוד, הרחבה, בידול של hESCs רשאי לעשות שימוש ישיר של תאים מיוחדים כגון שתלים בחולים בעייתי ^11-13. כדי להתגבר על המכשולים הללו, אנחנו צריכים לפתור את האלמנטים של מערכת התרבות מוגדר הכרחי ומספיק sustaining pluripotence epiblast של hESCs, משמש כפלטפורמה הגזירה דה נובו של hESCs קלינית מתאימה ויעילה בימוי hESCs כזה אחיד כלפי שושלות קלינית רלוונטית על ידי מולקולות קטנות ¹⁴ (ראה סכמטית באיור. 1). חומצה רטינואית (RA) לא להשרות התמיינות נוירונים של hESCs מובחן שמרו על ניזונים ^{1, 14.} ובניגוד ESCs עכבר, טיפול hESC-הבדיל גופים embryoid (EBS) רק מגביר במקצת את התשואה הנמוכה של נוירונים ^{1, 14, 15.} עם זאת, לאחר הקרנת מגוון רחב של מולקולות קטנות, ובדרך גורמי גדילה, מצאנו כי התנאים שניתנו מוגדרים כגון חומצה רטינואית (RA) מספיק כדי לגרום את המפרט של neuroectoderm ישירה hESCs pluripotent כי עוד התקדם neuroblasts שהפיק אבות העצבית האנושית נוירונים CNS פיתוח עם יעילות גבוהה (איור 2). הגדרנו תנאים אינדוקציה של נוירוישיר hESCs pluripotent ללא שלב להתערב רב השושלת הגוף embryoid, המאפשר מבוקר היטב הגזירה יעיל של היצע גדול של תאים עצביים אדם מכל גווני הקשת של שלבי ההתפתחות של התא מבוסס הרפוי תקיעות.

Protocol

1. הפתרון ומדיה הכנה

1. ציפוי פתרון לטין: 0.1% (w / v) ג'לטין DDH ₂ O, autoclaved ולאחסן ב 4 ° C.
2. Matrigel ציפוי פתרונות. פתרון במלאי: להפשיר Matrigel איטי (10 מ"ל) ב 4 ° C למשך הלילה, להוסיף 10 מ"ל קר כקרח DMEM או DMEM/F12, מערבבים היטב aliquot 1 מ"ל / צינור מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה, חנות ב -20 ° C. פתרון עבודה: הפשרה איטית 1 מ"ל aliquot Matrigel על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2, שעה להעביר 14 מ"ל צונן DMEM או DMEM/F12 ומערבבים היטב מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה מיד לפני הציפוי.
3. פתרון האדם ציפוי laminin: למהול 1 מ"ל האנושי פתרון laminin (0.5 מ"ג / מ"ל ​​בופר טריס NaCl, לאחסן ב -80 ° C, הפשרה איטית על 4 מעלות צלזיוס במשך שעה 1-2) עם קרים כקרח DMEM או DMEM/F12 ל 12.5 מ"ל פתרון עובד (40 מיקרוגרם / מ"ל) מתחת למכסה המנוע מעוקרים בתרבית רקמה מיד לפני הציפוי.
4. גורם צמיחה מניות פתרונות (500 1000x): להמיס גורם גדילה ב 10 מיקרוגרם/ Ml במאגר מעוקרות (0.5% BSA, 1.0 מ"מ DTT, גליצרול 10%, 1XPBS) ולאחסן כמו 50-100 μl / צינור aliquots ב -80 ° C.
5. All-טרנס retinoic חומצה עובדים פתרון (1000x): 10 מ"מ DMSO, חנות aliquots ב -80 ° C.
6. HESC התקשורת: DMEM/F12 או KO-DMEM (80%), ק.א. החלפת בסרום (20%), L-alanyl-L-L-gln או gln (2 מ"מ), חומצות אמינו חיוניות ממ (MNAA, 1X), ו β-Mercaptoethanol (100 מיקרומטר), מסונן ולאחסן ב 4 ° C, בתוספת bFGF 20 ng / ml לפני השימוש. או החלפה "לדפוק את (KO) תחליף בסרום" עם רכיבים מוגדרים: DMEM/F12 או KO-DMEM (100%), L-alanyl-L-L-gln או gln (2 מ"מ), MNAA (1X), ממ חיוני חומצות אמינו (MEAA, 1X), ו-β Mercaptoethanol (100 מיקרומטר), מסונן ולאחסן ב 4 ° C, בתוספת bFGF (20 ng / ml), אינסולין אנושי (20 מיקרוגרם / מ"ל), חומצה אסקורבית (50 מיקרוגרם / מ"ל), אדם activin (50 ng / ml), Albumax אלבומין / אדם (10 מ"ג / מ"ל), האדם transferrin (8 מיקרוגרם / מ"ל) לפני השימוש.
7. NSC התקשורת: DMEM/F12 (100%), N-2 supplemeNT (1X), הפרין (8 מיקרוגרם / מ"ל).

2. ציפוי פלייט

1. מעיל צלחות עם ג'לטין: להוסיף 2.5 מ"ל / היטב פתרון ג'לטין על 6 צלחות היטב דגירה לילה 37 ° C חממה humidified.
2. צלחות עם סמל laminin: צמרמורת ג'לטין מצופה צלחות להסיר ג'לטין, להוסיף 2.5 מ"ל / Matrigel טוב או אדם ציפוי laminin פתרון עובד מראש צונן gelatinized 6-גם צלחות דגירה על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה.

3. Passaging וזריעה hESCs מובחן תחת תנאים מוגדרים

1. אפשר מושבות hESC לגדול ל 5-7 ימים ישנים, לקחת צלחת תרבות hESC מיקרוסקופ כדי לנתח (טרום חמים לנתח הבמה 37 ° C) מתחת למכסה המנוע לנתח מעוקרים.
2. בחר מושבות hESC להיות מפוצל. מורפולוגית, מושבות אלה צריך> hESCs מובחן 75% (תאים קומפקטי קטן), בדרך כלל אטום מעט (לא לבן שנערמו תאים, לא ברור הבדיל תאים) עם יתרון בלתי מוגדרderneath מיקרוסקופ לנתח. בזהירות מתאר המושבות נבחרים להסיר שכבת פיברובלסטים הבדיל המקיפים את המושבה ואת כל חלקי הבדיל (אם בכלל) של המושבה עם הקצה של קצה P2 פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית. (שים לב, hESCs pluripotent הן בשלב חולף, עוברים התמיינות ספונטנית אפילו בתנאים אופטימליים, על אף המועדפת, קשה תאים תזות לברר הם 100% מובחן תחת מיקרוסקופ לנתח,> 75% מובחן נחשבים בדרך כלל כנקודת מעבר. תאים מובחנים בדרך כלל לא הזרע ממשיכים לגדול, בוטלו בתהליך passaging)
3. הסר את המדיה הישנה צף המכיל תאים מובחנים מנותקת על ידי aspirating. לשטוף עם התקשורת hESC (ללא bFGF) פעם אחת. הוסף 3 מ"ל / מדיה hESC טרי היטב המכיל 20 ng / ml bFGF.
4. חותכים את מושבות hESC מובחן לחתיכות קטנות, ולנתק עם קצה פיפטה סטרילית או זכוכית משך נימי.
5. בריכת התקשורת המכיל חתיכות המושבה מנותקת יחד צינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם מ"ל 1 / מדיה hESC היטב המכיל 20 ng / ml bFGF ובריכת יחד.
6. לשאוב Matrigel או פתרון laminin אדם מהצלחות טרי מצופה. 4 Aliquot מ"ל / טוב hESC מדיה המכילה חתיכות המושבה לצלחת 6 באר. להעביר בעדינות את הצלחת באינקובטור ללא רועד לאפשר חתיכות זרע המושבה לילה ללא מפריע ב humidified 37 ° C חממה עם אווירה של 5% CO _2.

4. אינדוקציה עצבית של hESCs תחת מערכת התרבות מוגדר עם החומצה הרטינואית

1. באותו יום 3 לאחר זריעה, להסיר את רוב התקשורת הישנה מבאר כל הצלחת ולהשאיר התקשורת מספיק כדי לאפשר מושבות hESC להיות מתחת למים (לא לאפשר hESCs להתייבש). החלף עם 4 מ"ל / מדיה hESC טרי היטב המכיל 20 ng / ml bFGF ו -10 מיקרומטר החומצה הרטינואית.
2. החלף המדיה הישנה עם המדיה hESC טרי המכיל 20 ng / ml ו bFGFהחומצה הרטינואית 10 מיקרומטר בכל יום אחר, ולאפשר עצבית הנגרמת מושבות hESC לגדול עד היום 7 או 8. כל התאים בתוך המושבה יעברו שינויים במורפולוגיה התמיינות לתאים גדולים ימשיכו להתרבות. מושבות תגדיל את גודל לכסות את הצלחת ביום 7 או 8, ותאי יתחילו להצטבר באזורים מסוימים של המושבות.

5. התמיינות נוירונים המשך בתרבות השעיה

1. קח תרבות hESC הצלחת לנתח מיקרוסקופ (טרום חמים לנתח הבמה 37 ° C) מתחת למכסה המנוע לנתח מעוקרים. בזהירות מתאר במושבות להסיר שכבת פיברובלסטים המקיפים את המושבה (תאים מובחנים היגרו אל מחוץ למושבה) עם הקצה של קצה P2 פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית.
2. הסר את המדיה הישנה צף המכיל תאים פיברובלסטים מנותקת על ידי aspirating. לשטוף עם התקשורת hESC (ללא bFGF) פעם אחת. הוסף 3 מ"ל / מדיה hESC טרי היטב (ללא bFGF).
3. חותכים את עצבי-iמושבות hESC nduced לחתיכות קטנות, ולנתק עם קצה פיפטה סטרילית או משך נימי זכוכית.
4. בריכת התקשורת המכיל חתיכות המושבה מנותקת יחד צינור חרוטי 50 מ"ל. לשטוף את הצלחת פעם אחת עם מ"ל 1 / מדיה hESC היטב (ללא bFGF) ובריכת יחד.
5. Aliquot 4 מ"ל / גם בסרום ללא מדיה hESC המכיל חתיכות המושבה אל צלחת 6-היטב ultralow התקשרות דגירה של 37 ° C חממה humidified כדי לאפשר אשכולות הסלולר צף (neuroblasts) כדי ליצור עבור 4-5 ימים.

6. הפנוטיפ ההבשלה העצבית תרבות דבק

1. בריכת התקשורת המכיל neuroblasts צף יחד צינור חרוטי 50 מ"ל. צנטריפוגה בסל"ד 1400 במשך 5 דקות. לשאוב את המדיה הישנה כמו שאתה יכול להוסיף כמות זהה של טרי NSC מדיה המכילה VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), ו - BDNF (10 ng / ml).
2. פיפטה מעלה ומטה כדי לערבב neuroblasts צף aliquot 4 מ"ל / 6 היטב גם הצלחות. Neuroblasts ניתן גם seeded ב laminin / קולגן (Matrigel) או אדם laminin polymerized 3 מימדי המטריצה ​​בסרום ללא מדיה NSC המכיל VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), ו - BDNF (10 ng / ml) . מעבירים את הצלחות ל 37 ° C חממה humidified לאפשר neuroblasts לצרף לילה.
3. החלף NSC מדיה המכילה VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), ו - BDNF (10 ng / ml) בכל יום אחר. רשתות נרחב neurite נושאות תאים עצביים ותאי פיגמנט יתחילו להופיע בתוך 2 שבועות של גידול מתמשך ועלייה מספרים עם הזמן, יכול להתקיים במשך 3 חודשים.

7. נציג תוצאות:

חומצה רטינואית (RA) מוצג מספיק כדי לגרום hESCs נשמר במערכת התרבות מוגדר המעבר pluripotency בלעדי פנוטיפ neuroectodermal (איור 2A). בחשיפה של hESCs מובחן אל RA, כל התאים בתוך המושבה יעברו שינויים במורפולוגיה כדיתאים מובחנים גדול הפסקת להביע pluripotency הקשורים סמנים, כפי שעולה אוקטובר-4, ולהתחיל לבטא neuroectoderm שונים הקשורים סמנים, כגון HNK1, AP2, ו TrkC (איור 2 ב). תאים אלו מובחנים גדולים ימשיכו להתרבות המושבות יגדל בגודל, הליך ספונטני להביע את הסמן העצבית מוקדם β-III-טובולין (איור 2 ב). סמן נוירונים בוגרים יותר מפה-2 יתחיל להופיע באזורים של מושבות תאים שבהם יש נערמו (איור 2 ב). ביחד עם הופעתו של התאים neuroectodermal והבחנה עצבי, הגורם העצבית תעתיק ספציפי Nurr1, מעורב התמיינות נוירונים דופאמינרגיים ההפעלה של hydroxylase טירוזין (TH) גן ^16, יהיה translocate לגרעין (איור 2 ב). לאחר מנותקת, hESCs RA שטופלו יהוו אשכולות הסלולר צף (neuroblasts) בפולחן השעיהיור להמשיך בתהליך התמיינות עצביים. לאחר הסרת bFGF ואחרי המתיר neuroblasts לצרף צלחת רקמה תרבות או זרע polymerized laminin / קולגן 3 מימדי המטריצה ​​במדיום בסרום ללא מוגדר, β-III-טובולין, ומפת-2-להביע, neurite נושאות תאים תאים פיגמנט יתחילו להופיע עם עלייה דרסטית יעילות לעומת בידול רב השושלת ספונטנית של hESCs ללא טיפול במשך אותה תקופה, יכול להתקיים במשך 3 חודשים (איור 2C).

איור 1 סכימטי של אינדוקציה מבוקר היטב יעיל בתאי גזע אנושיים pluripotent בלעדי שושלת קליני רלוונטי במיוחד על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות.

איור 2 retinoic גורם מפרט השושלת עצביים התקדמות עצבי ישיר pluripotency בתנאים מוגדרים. (א) סכמטי המתאר של הקו פרוטוקול זמן של בידול מכוון של נוירונים hESCs. (ב) עם חשיפה של hESCs מובחן לחומצה רטינואית (RA) תחת מערכת התרבות מוגדר, גדול הבדיל אוקטובר-4 (אדום) בתאי שלילי בתוך המושבה החלו להופיע, לעומת מדומה שטופלו (DMSO) hESCs כמו שליטה . RA-Induced תאים אוקטובר-4-השלילית הבדיל החלו להביע HNK-1 (אדום), AP2 (אדום), TrkC (ירוק), ולאחר מכן β-III-טובולין (אדום), עולה בקנה אחד עם בידול neuroectodermal מוקדם. תאים אלה המשיכה בשלה בסופו של דבר לבטא את הסמן העצבית מפת-2 (ירוק), בדרך כלל באזורים שבהם התאים החלו להיערם. ביחד עם הופעתו של התאים neuroectodermal והבחנה עצבית, את עצבי ספציפי גורם Nurr1 תעתיק (ירוק), מעורבבידול עצבי דופאמין והפעלה של hydroxylase הגן טירוזין (TH), translocated לגרעין. כל התאים מוצגים על ידי מכתים DAPI הגרעינים שלהם (כחול). (ג) לטיפול בדלקת מפרקים שגרונית גורם בידול כלפי שושלת העצבית עם יעילות גבוהה כפי שהוערכו על ידי רשתות נרחב של neurite נושאות תאים להביע β-III-טובולין (אדום) ומפת-2 (ירוק, המוצג מטריקס 3-dimentional א). החצים מצביעים על תאים פיגמנט טיפוסית של אלה במערכת העצבים המרכזית. כל התאים מוצגים על ידי מכתים DAPI הגרעינים שלהם (כחול) ריבועי. סולם ברים: 0.1 מ"מ.

Discussion

אחד האתגרים הגדולים עבור המחקר הן התפתחותיות תרגום קליני כבר איך לתעל את פוטנציאל התמיינות רחב של pluripotent בתאי גזע אנושיים הפנוטיפ הרצוי ביעילות כצפוי. למרות תאים כאלה יכולים להבדיל באופן ספונטני במבחנה לתאים של כל שכבות הנבט ידי עובר שלב רב שושלת צבירה, רק חלק קטן של תאים להמשיך ^1,4 השושלת נתון. באותם hESC הנגזרות אגרגטים, המראה בו זמנית של כמות ניכרת של מסתעף נרחב סוגי תאים לא רצויים אשר עשויים להימצא בתוך שלוש שכבות נבט עובריים לעתים קרובות הופך את הופעתה של פנוטיפים הרצוי לא רק לא יעילה, אבל בלתי נשלט ולא אמינה גם כן. למרות שושלות לב עצביים כבר נגזר בדוחות הקודמים, עם זאת, יעילות ביצירת תאים מיוחדים באמצעות אינדוקציה נבט-שכבה של תאים pluripotent לבין סיכון גבוה tumorigenicity הבאים transplantation יש הפריע התרגום קליניים נוספים.

הקווים hESC בתחילה נגזרו ומתוחזק בתרבות בשיתוף עם צמיחה נעצר עכבר fibroblasts עובריים (MEFs) ^4. למרות מזין אנושי מספר, מזין חופשי, ומערכות תרבות כימי ניסח פותחו עבור ^11-13 hESCs, האלמנטים הכרחי ומספיק לקיום העצמי התחדשות של תאים pluripotent אדם נותרו לא פתורות. תאים אלה מזין אקסוגניים ו ריאגנטים ביולוגיים לעזור לשמור על צמיחה ארוכת טווח יציבה של hESCs מובחן ואילו למסכה היכולת של התאים pluripotent להגיב על אותות התפתחותיים. שמירה hESCs מובחן במערכת ביולוגי ללא מוגדר תרבות המאפשר הרחבת נאמן בידול ישיר לשליטה הוא אחד המפתחות השירות הטיפולי שלהם ואת הפוטנציאל. RA לא היה די כדי לגרום בידול העצבית של hESCs מובחן נשמר תחת Condit בעבר דיווחיונים מזין המכיל תאים חיצוניים. למרות שושלות עצביים מופיעים בשלב מוקדם יחסית בידול hESC, טיפול hESC-הבדיל רב השושלת אגרגטים (גופים embryoid) עם RA גדל רק במעט את התשואה הנמוכה של נוירונים ^{1, 14, 15.} על מנת להשיג אחיד ההמרה של אדם בתאי גזע pluripotent לשושלת מסוימת, אנחנו עובדים מערכת תרבות מוגדרת מסוגלים לבטח את הפצת hESCs מובחן לזהות תנאים לזירוז מבוקר היטב יעיל של hESCs pluripotent בלעדי מסוים בשושלת קליני רלוונטי על ידי הוראה פשוטה של מולקולות קטנות (איור 1, איור. 2). מחקרים עתידיים יגלה מולקולות בקרה גנטית epigenetic בהתפתחות מערכת העצבים המרכזית האדם חלופות, אשר עשוי לסלול את הדרך לשלוט מולקולה בתיווך קטן אפנון ישיר של גורל pluripotent hESC כאשר הנובעות שושלות קליני רלוונטי עבור טיפולים רגנרטיבית. ללא טיפול בדלקת מפרקים שגרונית, 1-5HESCs% יעברו התמיינות ספונטנית לתוך נוירונים ^{1, 14, 15.} באמצעות טיפול בדלקת מפרקים שגרונית, הצלחנו לייצר> 95% אבות העצבית העוברית נוירונים מ hESCs שמרו תחת תרבות להגדיר בתהליך שעשוי לחקות ההתפתחות העוברית האנושית ^14. לאחרונה, ידוע עצביים-בקביעת גורל גנים שימשו transdifferentiate fibroblasts העכבר לתוך אבות עצביים נוירונים בוגרים עם יעילות נמוכה בטווח 0.5-8% ^{17, 18.} עם זאת, reprogrammed התאים הסומטיים יש היסטורית היה קשור ביטוי גנים חריגים הזדקנות מואצת עם התועלת הטיפולית לקויי ^19-21. לבסוף, פרוטוקול הקמנו כאן מוגבל hESCs pluripotent נגזר מסת התאים הפנימית (ICM) או epiblast של הבלסטוציסט אדם ^4, אינן חלות pluripotent תאים אחרים, כולל בעלי חיים שמקורם ESCs, ESCs נגזר מוקדם יותר morula (שמונה תאים) בשלב עוברי ^22, ו artifתאים reprogrammed icially ^23.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	חברה	מספר קטלוגי	הערות (אופציונלי)
לטין	סיגמא	G1890
Matrigel	במדעי החיים BD	356231	גורם צמיחה מופחת
האדם laminin	סיגמא	L6274
כל טרנס retinoic חומצה	סיגמא	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-החוצה בסרום תחליף	Invitrogen	10828028
ממ פתרון חומצת אמינו חיונית (MNAA, 100x)	Invitrogen	11140050
מממינו פתרון חומצות (MEAA, 100x)	Invitrogen	11130050
β-Mercaptoethanol	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
חומצה אסקורבית	סיגמא	A4403
האדם transferrin	סיגמא	T8158
האדם bFGF	PeproTech	AF-100-18 ב
האדם אינסולין	Invitrogen	12585014
האדם activin	PeproTech	120-14E
האדם BDNF	PeproTech	AF-450-02
האדם VEGF	PeproTech	AF-1-200
האדם NT-3	PeproTech	450-03
הפרין	סיגמא	H5284
N-2 תוספת (100x)	Invitrogen	17502048
6 טוב מצורף ultralow צלחת	קורנינג	3471
6 גם צלחת	קורנינג	3516