Derivazione efficiente di progenitori neuronali umane e Neuroni pluripotenti da cellule staminali embrionali umane con induzione piccole molecole

Riepilogo

Abbiamo stabilito un protocollo per l'induzione di neuroblasti pluripotenti direttamente da cellule staminali embrionali umane conservati in condizioni definite con piccole molecole, che permette la derivazione di una grande quantità di progenitori neuronali umane e tipi di cellule neuronali nel sistema nervoso centrale per lo sviluppo neurale riparazione.

Abstract

C'è un grande bisogno insoddisfatto di una clinicamente adeguata fonte di cellule neuronali umane per la riparazione o rigenerazione del danneggiato sistema nervoso centrale (SNC) struttura e circuiti nel settore sanitario di oggi. Terapie basate sulle cellule sono molto promettenti per ripristinare il tessuto nervoso e la funzione perduta per i disturbi del sistema nervoso centrale. Tuttavia, terapie cellulari basate sul sistema nervoso centrale, cellule staminali neurali hanno incontrato limitazioni e difficoltà di alimentazione da utilizzare in ambito clinico grazie alla loro capacità di espansione limitata di cultura e di plasticità, dopo non aver esteso ^1-3 passaging. Nonostante alcuni risultati positivi, il CNS-derivato cellule staminali neurali (hNSCs) sembrano esercitare i loro effetti terapeutici principalmente dalla loro progenie non neuronali attraverso la produzione trofica e le molecole neuroprotettive per salvare le cellule endogene ^1-3. In alternativa, pluripotenti le cellule staminali embrionali umane (hESC) proffer cure per una vasta gamma di disturbi neurologici da supplying la diversità dei tipi di cellule umane neuronali del sistema nervoso centrale di sviluppo per la rigenerazione ^1,4-7. Tuttavia, come incanalare il potenziale ampia differenziazione delle hESC pluripotenti in modo efficiente e prevedibile di un fenotipo desiderato è stato una grande sfida sia per lo studio e la traduzione di sviluppo clinico. Approcci convenzionali si basano su multi-lignaggio inclinazione di cellule pluripotenti attraverso la differenziazione spontanea foglietto embrionale, con conseguente inefficienza e incontrollabile lignaggio impegno che viene spesso seguita da eterogeneità fenotipica e instabilità, di conseguenza, un elevato rischio di tumorigenicità ^7-10. Inoltre, non definito integratori stranieri / animale biologica e / o alimentatori che sono stati generalmente utilizzati per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle hESC può utilizzarli direttamente di tali cellule specializzate innesti nei pazienti problematici ^11-13. Per superare questi ostacoli, abbiamo risolto gli elementi di un sistema di coltura definito necessaria e sufficiente per sustaining il pluripotence epiblast di hESC, che funge da piattaforma per la derivazione de novo di hESC clinicamente adeguata ed efficace regia hESC quali uniformemente verso lignaggi clinicamente rilevanti da piccole molecole ¹⁴ (vedere uno schema in figura. 1). L'acido retinoico (RA) non induce la differenziazione neuronale di hESC indifferenziata mantenuta su linee ^{1, 14.} E a differenza di CES del mouse, trattando corpi embrionali hESC differenziato (EBS) solo leggermente aumenta la bassa resa dei neuroni ^{1, 14, 15.} Tuttavia, dopo lo screening di una serie di piccole molecole e fattori di crescita, abbiamo riscontrato che tali condizioni definite reso acido retinoico (RA) sufficiente a indurre le specifiche del neuroectoderma diretto da hESC pluripotenti che ulteriormente progredita al neuroblasti che ha generato umano progenitori neuronali ed i neuroni nel SNC di sviluppo con alta efficienza (Fig. 2). Abbiamo definito le condizioni per l'induzione della neuroesplosioni diretto da hESC pluripotenti senza un intervento a più fasi embrionali lignaggio corpo, consentendo ben controllati derivazione efficiente di una grande quantità di cellule neuronali tutta la gamma di stadi di sviluppo per le terapie basate sulle cellule.

Protocollo

1. Soluzione e Media Preparazione

1. Rivestimento in gelatina soluzione: 0,1% (w / v) gelatina in DDH ₂ O, autoclave e conservare a 4 ° C.
2. Matrigel rivestimento soluzioni. Soluzione: lento disgelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C per una notte, aggiungere 10 ml ghiacciata DMEM o DMEM/F12, mescolare bene e aliquota 1 ml / tubo sotto cappuccio tessuto sterilizzato cultura, conservare a -20 ° C. Soluzione di lavoro: lento disgelo 1 ml aliquota Matrigel a 4 ° C per 1-2 ore, il trasferimento di 14 ml o refrigerata DMEM DMEM/F12 e mescolare bene sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento.
3. Umano laminina soluzione di rivestimento: diluire 1 ml di soluzione umana laminina (0,5 mg / ml in Tris tamponata NaCl, conservare a -80 ° C, lento disgelo a 4 ° C per 1-2 ore) con gelida DMEM o DMEM/F12 a 12,5 ml soluzione di lavoro (40 mcg / ml) sotto cappa sterile cultura del tessuto immediatamente prima del rivestimento.
4. Fattore di crescita soluzioni madri (500-1000X): sciogliere il fattore di crescita a 10 mcg/ Ml in tampone sterile (0,5% di BSA, 1,0 mM DTT, 10% glicerolo, 1XPBS) e di memorizzare fino a 50-100 microlitri / tubo aliquote a -80 ° C.
5. Tutte le trans retinoico soluzione di lavoro (1000X): 10 mM in DMSO, conservare in aliquote a -80 ° C.
6. Mezzi di comunicazione HESC: DMEM/F12 o KO-DMEM (80%), KO sostituzione del siero (20%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MEM acidi aminoacidi non essenziali (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrare e conservare a 4 ° C, integrato con 20 ng / ml bFGF prima dell'uso. O la sostituzione di "knock out (KO) la sostituzione del siero" con componenti definiti: DMEM/F12 o KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln o L-GLN (2 mm), MNAA (1X), MEM essenziale amminoacidi (MEAA, 1X) e β-mercaptoetanolo (100 micron), filtrata e conservare a 4 ° C, integrato con bFGF (20 ng / ml), l'insulina umana (20 mg / ml), acido ascorbico (50 mg / ml), umano activina A (50 ng / ml), albumina umana / Albumax (10 mg / ml), e transferrina umana (8 mcg / ml) prima dell'uso.
7. NSC media: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), l'eparina (8 mcg / ml).

2. Lastra di rivestimento

1. Piastre cappotto con gelatina: aggiungere 2,5 ml / pozzetto di soluzione di gelatina a 6 piastre ed incubare una notte a 37 ° C incubatore umidificato.
2. Piastre cappotto con laminina: chill gelatina rivestite piatti e rimuovere la gelatina, aggiungere 2,5 ml / o umani e Matrigel soluzione di rivestimento laminina lavoro di pre-refrigerata gelatinizzato 6 pozzetti ed incubare a 4 ° C durante la notte.

3. Passaging e semina hESC indifferenziato in condizioni definite

1. Lasciare colonie hESC crescere fino a 5-7 giorni vecchi, e prendere la cultura piastra hESC a microscopio da dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione.
2. Seleziona colonie hESC da dividere. Morfologicamente, queste colonie avrebbero dovuto> hESC 75% indifferenziato (piccole celle compatte), di solito leggermente opaco (non bianco-ammucchiati cellule non differenziate cellule chiare) con bordo ONU definitoderneath il microscopio da dissezione. Attentamente delineare le colonie selezionate e rimuovere strato differenziato dei fibroblasti che circonda la colonia e tutte le parti differenziate (se presente) della colonia con il bordo della P2 punta pipetta sterile o tirato capillare di vetro. (Si prega di notare, hESC pluripotenti sono in una fase transitoria, subiscono differenziazione spontanea anche in condizioni ottimali, anche se si preferisce, è difficile accertare le cellule tesi sono al 100% indifferenziato sotto microscopio da dissezione,> 75% indifferenziati vengono solitamente considerati come il punto di passaggio. L' cellule differenziate di solito non di semi e continuare a crescere, eliminati nel processo di passaging)
3. Rimuovere i vecchi media mobile contenente le cellule differenziate staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF.
4. Tagliare le colonie hESC indifferenziato in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o vetro tirato capillare.
5. Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC pozzetto contenente 20 ng / ml bFGF e piscina insieme.
6. Aspirare il Matrigel o umano soluzione laminina dalle piastre rivestito fresca. Aliquota 4 ml / pozzetto contenente pezzi dei media hESC colonia di un 6-pozzetti. Delicatamente trasferire la piastra per incubatore senza agitare e lasciare colonia semi di pezzi durante la notte senza disturbare umidificata in un incubatore a 37 ° C con una atmosfera di 5% di CO _2.

4. Induzione neurale di hESC in Sistema Cultura Definito con Acido Retinoico

1. Al 3 ° giorno dopo la semina, rimuovere la maggior parte dei vecchi media da ciascun pozzetto della piastra e di lasciare i supporti a sufficienza per permettere colonie hESC di essere sommersa (mai permettere hESC ad asciugarsi). Sostituire con 4 ml / media hESC ben fresco contenente 20 ng / ml bFGF e 10 mM acido retinoico.
2. Sostituire vecchi media con i media hESC fresca contenente 20 ng / ml bFGF e10 mM acido retinoico a giorni alterni, e permettere neurali indotti colonie hESC crescere fino a giorno 7 o 8. Tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti morfologia a grandi cellule differenziate che continueranno a moltiplicarsi. Le colonie aumenteranno di dimensioni per coprire la piastra di giorno 7 o 8, e le cellule cominceranno ad accumularsi in alcune aree delle colonie.

5. Continuando differenziamento neuronale in Cultura Sospensione

1. Prendere la cultura piastra hESC microscopio a dissezione (pre-riscaldare dissezione fase a 37 ° C) sotto cappa sterile dissezione. Attentamente delineare le colonie e rimuovere strato di fibroblasti che circonda la colonia (cellule differenziate migrate dalla colonia) con il bordo della P2 puntale sterile o tirato capillare di vetro.
2. Rimuovere i vecchi media mobile contenente cellule di fibroblasti staccato da aspirazione. Lavare con i media hESC (senza bFGF) una volta. Aggiungere 3 ml / media hESC ben fresco (senza bFGF).
3. Tagliare il neurali-icolonie hESC nduced in piccoli pezzi, e staccare con la punta della pipetta sterile o tirato capillare di vetro.
4. Piscina i supporti contenenti pezzi staccati colonia insieme in un tubo da 50 ml. Lavare la piastra una volta con 1 ml / media hESC bene (senza bFGF) e piscina insieme.
5. Aliquota 4 ml / e senza siero hESC supporti contenenti pezzi colonia di un 6-pozzetti bassissimo attaccamento e incubare a 37 ° C umidificata incubatore per consentire galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) per formare per 4-5 giorni.

6. Fenotipo maturazione neuronale nella cultura adesivo

1. Piscina i supporti contenenti neuroblasti galleggiante insieme in un tubo da 50 ml. Centrifugare a 1400 rpm per 5 min. Aspirare il vecchi media per quanto è possibile e aggiungere pari quantità di fresca NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml).
2. Pipetta su e giù per miscelare neuroblasti galleggianti e aliquota 4 ml / pozzetto a 6-pozzetti. Il neuroblasti può anche essere séeded in un laminina laminina / collagene (Matrigel) o umana polimerizzati 3-dimensionale matrice nel siero senza mezzi NSC contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) . Trasferire le piastre a 37 ° C in incubatore umidificato per consentire neuroblasti di allegare tutta la notte.
3. Sostituire NSC supporti contenenti VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) a giorni alterni. Vaste reti di cellule neuronali dei neuriti portanti e cellule pigmentate cominceranno a comparire entro 2 settimane di coltivazione continua e aumento del numero con il tempo, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi.

7. Rappresentante dei risultati:

L'acido retinoico (RA) è reso sufficiente a indurre hESC mantenuto nel sistema cultura definita la transizione da pluripotenza esclusivamente ad un fenotipo neuroectodermici (Fig. 2A). In caso di esposizione di hESC indifferenziato a RA, tutte le cellule all'interno della colonia subirà cambiamenti di morfologiagrandi cellule differenziate che cessano esprimere pluripotenza associati marcatori, come indicato dalla Oct-4, e cominciare a esprimere diverse neuroectoderma associati marcatori, come HNK1, AP2, e TRKC (Fig. 2B). Queste cellule differenziate grandi continueranno a moltiplicarsi e le colonie aumenteranno di dimensione, di procedere spontaneamente per esprimere il marker precoce neuronale β-III-tubulina (fig. 2B). Il marcatore più maturo neuronale Mappa-2 si cominciano ad apparire nelle aree delle colonie dove le cellule si sono accumulati (Fig. 2B). In coincidenza con la comparsa delle cellule neuroectodermici e la differenziazione neuronale, il meccanismo neuronale specifico fattore trascrizionale Nurr1, implicato nella differenziazione dei neuroni dopaminergici e l'attivazione della tirosina idrossilasi (TH) del gene ^16, sarà traslocare al nucleo (Fig. 2B). Dopo aver staccato la hESC RA trattati formeranno galleggiante ammassi cellulari (neuroblasti) in una setta sospensioneure per continuare il processo di differenziazione neuronale. Dopo la rimozione di bFGF e dopo permettendo neuroblasti per collegare ad una piastra di coltura tissutale o seminati in un laminina / collagene polimerizzato 3-dimensionale matrice di un siero privo di un terreno specifico, β-III-tubulina e mappa-2-esprimere, neuriti portante cellule e cellule pigmentate inizieranno ad apparire con un drastico aumento di efficienza rispetto ai spontanea multi-lignaggio differenziazione delle hESC senza trattamento nel periodo di tempo stesso, e potrebbe essere sostenuta per oltre 3 mesi (Fig. 2C).

Figura 1 Uno schema di ben controllata induzione efficiente delle cellule staminali umane pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti da semplice disposizione di piccole molecole.

Figura 2 Acido retinoico induce specifiche neurali lignaggio e la progressione neuronale diretta di pluripotenza in determinate condizioni. (A) Schema raffigurante della linea Time Protocol of diretto differenziazione neuronale di hESC. (B) Dopo l'esposizione di hESC indifferenziato ad acido retinoico (RA) nell'ambito del sistema cultura definita, grande differenziati ottobre-4 (rosso), le cellule negative all'interno della colonia ha cominciato ad emergere, rispetto ai mock-trattati (DMSO) hESC come il controllo . RA-indotta delle cellule differenziate ottobre-4-negativi cominciarono a esprimere HNK-1 (rossa), AP2 (rosso), TRKC (verde), e poi β-III-tubulina (rosso), in linea con primi differenziazione neuroectodermici. Queste cellule hanno continuato a maturare in ultima analisi, che esprimono il marcatore neuronale Map-2 (verde), di solito in aree in cui cellule hanno cominciato ad accumularsi. In coincidenza con la comparsa delle cellule neuroectodermici e la differenziazione neuronale, il meccanismo neuronale specifico fattore trascrizionale Nurr1 (verde), implicato indopaminergici differenziazione neuronale e l'attivazione della tirosina idrossilasi (TH) del gene, traslocato al nucleo. Tutte le cellule sono mostrati dalla colorazione DAPI dei loro nuclei (blu). (C) il trattamento con RA induce la differenziazione verso una linea neuronale ad alta efficienza come dimostrato dalle reti estese di neuriti-cuscinetto cellule che esprimono β-III-tubulina (in rosso) e mappa-2 (verde, mostrata in un 3-dimensionali matrice). Le frecce indicano le cellule pigmentate tipico di quelli del sistema nervoso centrale. Tutte le cellule sono mostrati dalla colorazione DAPI dei loro nuclei (blu) in riquadri. Barre di scala: 0,1 mm.

Discussione

Una delle sfide più importanti sia per lo studio dello sviluppo e la traduzione clinica è stata come incanalare le ampie potenzialità di differenziazione delle cellule staminali umane pluripotenti da un fenotipo desiderato in modo efficiente e prevedibile. Anche se tali cellule possono differenziarsi spontaneamente in vitro in cellule di tutti gli strati germinali passando attraverso un multi-stadio lignaggio aggregato, solo una piccola frazione di cellule perseguire un ^1,4 lignaggio dato. In questi hESC derivati ​​aggregati, la simultanea comparsa di una notevole quantità di ampiamente divergenti tipi di cellule indesiderate che possono risiedere in tre strati germinali embrionali rende spesso la comparsa di fenotipi desiderati non solo inefficiente, ma incontrollabile e inaffidabile pure. Anche se lignaggi cardiache e neuronali sono stati ottenuti in precedenti relazioni, tuttavia, l'inefficienza nella generazione di cellule specializzate attraverso strato germinale, l'induzione di cellule pluripotenti e l'alto rischio di cancerogenicità a seguito transplantation hanno impedito ulteriori traduzioni cliniche.

Le linee di hESC inizialmente sono stati ottenuti e mantenuti in co-coltura con una crescita arrestato topo fibroblasti embrionali (MEF) ^4. Anche se molti di alimentazione umana, senza alimentatore, e sistemi di coltura chimicamente formulati sono stati sviluppati per hESC ^11-13, gli elementi necessari e sufficienti per sostenere l'auto-rinnovamento delle cellule pluripotenti umane restano irrisolti. Queste cellule alimentatore esogeni e reagenti biologici aiutano a mantenere la crescita a lungo termine stabile di hESC indifferenziata, mentre la maschera la capacità delle cellule pluripotenti di rispondere ai segnali di sviluppo. Mantenere hESC indifferenziato in un definito biologici sistema privo di cultura che consente l'espansione fedeli e controllabili differenziazione diretta è una delle chiavi per la loro utilità e le potenzialità terapeutiche. RA non era sufficiente a indurre la differenziazione neuronale di hESC indifferenziato mantenuto sotto condiz precedentemente riportatoioni contenenti cellule alimentatore esogeni. Anche se lignaggi neurale compaiono in una fase relativamente precoce nella differenziazione hESC, trattando hESC differenziato multi-lignaggio aggregati (corpi embrionali) con artrite reumatoide solo leggermente aumentato la bassa resa dei neuroni ^{1, 14, 15.} Per raggiungere in modo uniforme la conversione di cellule staminali umane pluripotenti da una stirpe particolare, abbiamo impiegato un sistema di coltura definito in grado di assicurare la proliferazione di hESC indifferenziato per identificare le condizioni per ben controllata induzione efficiente delle hESC pluripotenti esclusivamente ad una particolare stirpe clinicamente rilevanti dalla semplice fornitura di piccole molecole (Fig. 1, fig. 2). Studi futuri rivelerà molecole controllo genetico ed epigenetico dello sviluppo umano nel sistema nervoso centrale come alternative, che possono aprire la strada a piccole molecole-mediata controllo diretto e la modulazione del destino hESC quando pluripotenti derivanti lignaggi clinicamente rilevanti per terapie rigenerative. Senza trattamento con RA, 1-5HESC% sarà oggetto di differenziazione spontanea in neuroni ^{1, 14, 15.} Con il trattamento con RA, siamo stati in grado di generare> 95% progenitori embrionali neuronali ed i neuroni dalle hESC mantenuto nell'ambito di una definizione di cultura in un processo che potrebbe emulare sviluppo embrionale umano ^14. Recentemente, noto neurali destino determinare i geni sono stati utilizzati per transdifferenziarsi fibroblasti di topo adulto in progenitori neurali e dei neuroni con un basso livello di efficienza che vanno 0,5-8% ^{17, 18.} Tuttavia, riprogrammato le cellule somatiche sono state storicamente associato con l'espressione genica anormale e senescenza accelerata con compromissione della utilità terapeutica ^19-21. Infine, il protocollo abbiamo stabilito qui è limitato alle hESC pluripotenti derivate dalla massa cellulare interna (ICM) o epiblast della blastocisti umana ^4, non possono applicarsi a cellule pluripotenti altri, tra cui origine animale-CES, CES derivati ​​da precedenti morula (otto celle) embrioni allo stadio ^22, e artificially cellule riprogrammate ^23.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome del reagente	Azienda	Numero di catalogo	Commenti (opzionale)
Gelatina	Sigma	G1890
Matrigel	Bioscienze BD	356231	Fattore di crescita ridotta
Umano laminina	Sigma	L6274
all trans retinoico	Sigma	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out sostituzione siero	Invitrogen	10828028
MEM soluzione di aminoacidi non essenziali (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEM unoMino acidi soluzione (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β-mercaptoetanolo	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Acido ascorbico	Sigma	A4403
Transferrina umana	Sigma	T8158
BFGF umano	Peprotech	AF-100-18B
L'insulina umana	Invitrogen	12585014
Un umano activina	Peprotech	120-14E
Umano BDNF	Peprotech	AF-450-02
VEGF umano	Peprotech	AF-100-20
Umano NT-3	Peprotech	450-03
Eparina	Sigma	H5284
N-2 supplemento (100X)	Invitrogen	17502048
6-ben ultrabassa piastra di fissaggio	Corning	3471
6 pozzetti	Corning	3516