Derivação eficiente dos recursos humanos Progenitores Neuronal e Neurônios de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas com a indução de moléculas pequenas

Resumo

Nós estabelecemos um protocolo para indução de neuroblastos direta de pluripotentes células estaminais embrionárias humanas mantidas sob condições definidas com pequenas moléculas, que permite a derivação de uma grande oferta de recursos humanos progenitores neurais e células neuronais tipos no desenvolvimento neural do SNC para reparação.

Resumo

Há uma grande necessidade insatisfeita para uma fonte de células clinicamente adequado humana neuronal para reparo ou regeneração do sistema nervoso central, danificada (CNS) a estrutura e os circuitos na indústria de hoje de saúde. Terapias baseadas em células uma grande promessa para restaurar o tecido nervoso e perdeu a função de doenças do SNC. No entanto, as terapias celulares com base no SNC derivados células-tronco neurais têm encontrado restrição da oferta e dificuldade de uso na prática clínica devido à sua capacidade de expansão limitada da cultura e plasticidade falhando após extensa ^03/01 passaging. Apesar de alguns resultados positivos, o CNS-derivadas de células-tronco neurais (hNSCs) parecem exercer seus efeitos terapêuticos principalmente por sua não-neuronal através de progênies tróficos produção e moléculas neuroprotetor para resgatar as células endógenas ^1-3. Alternativamente, pluripotentes células estaminais embrionárias humanas (hESCs) curas oferecer para uma ampla gama de distúrbios neurológicos por supplying a diversidade de tipos humanos de células neuronais no SNC em desenvolvimento para a regeneração ^1,4-7. No entanto, como canalizar o potencial de diferenciação gama de hESCs pluripotentes de forma eficiente e previsível para um fenótipo desejado tem sido um grande desafio tanto para estudo de desenvolvimento e tradução clínica. Abordagens convencionais dependem de multi-linhagem inclinação de células pluripotentes através da diferenciação espontânea germe de camada, resultando em ineficiência e incontrolável linhagem compromisso, que é muitas vezes seguido de heterogeneidade fenotípica e instabilidade, portanto, um risco elevado de tumorigenicidade ^7-10. Além disso, indefinido estrangeiros / animal suplementos biológicos e / ou alimentadores que tenham sido tipicamente usadas para o isolamento, expansão e diferenciação de hESCs pode fazer uso direto de tais células especializadas enxertos em pacientes problemáticos ^11-13. Para superar esses obstáculos, temos resolvido os elementos de um sistema de cultura definidas necessárias e suficientes para sustaining o pluripotence epiblasto de hESCs, servindo como uma plataforma para a derivação de novo de hESCs clinicamente adequado e eficaz direcionando hESCs tais uniformemente para linhagens clinicamente relevante por pequenas moléculas ¹⁴ (consulte um esquema na figura 1.). Ácido retinóico (AR) não induz a diferenciação neuronal de hESCs indiferenciada mantidos em alimentadores de ^{1, 14.} E, ao contrário CES mouse, tratando CTEh diferenciadas corpos embrióides (EBs) só aumenta um pouco o baixo rendimento dos neurônios ^{1, 14, 15.} No entanto, após a triagem de uma variedade de pequenas moléculas e fatores de crescimento, verificou-se que tais condições definidas prestados ácido retinóico (RA) suficiente para induzir a especificação de neuroectoderma direta de hESCs pluripotentes que mais progrediu para neuroblastos que gerou humana progenitores neurais e neurônios na SNC em desenvolvimento com alta eficiência (Fig. 2). Nós definimos as condições para a indução de neuroexplosões diretas de hESCs pluripotentes sem uma intervenção multi-estágio corpo linhagem embrióides, permitindo bem controlados derivação eficiente de uma grande oferta de células neuronais humanas em todo o espectro de estágios de desenvolvimento para a célula-base terapêutica.

Protocolo

1. Solução e Mídia Preparação

1. Solução de revestimento de gelatina: 0,1% (w / v) de gelatina em DDH ₂ O, autoclavado e armazenar a 4 ° C.
2. Matrigel soluções de revestimento. Solução estoque: lento degelo Matrigel (10 ml) a 4 ° C durante a noite, adicionar 10 ml gelada DMEM ou DMEM/F12, misture bem e alíquota de 1 ml / tubo sob capô de cultura de tecidos esterilizados, armazenar a -20 ° C. Solução de trabalho: descongele lenta 1 ml alíquota Matrigel a 4 ° C por 1-2 horas a transferência, a 14 ml ou refrigerados DMEM DMEM/F12 e misture bem debaixo capa de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento.
3. Solução de revestimento laminina humana: diluir 1 ml de solução de laminina humana (0,5 mg / ml em Tris Buffered NaCl, armazenar a -80 ° C, degelo lento a 4 ° C por 1-2 horas) com gelado DMEM ou DMEM/F12 para 12,5 ml de solução de trabalho (40 mcg / ml) por baixo capota de cultura de tecidos esterilizados imediatamente antes de revestimento.
4. Soluções estoque de fator de crescimento (500-1000x): dissolver o fator de crescimento de 10 mg/ Ml em tampão esterilizado (0,5% BSA, 1,0 mM DTT, glicerol 10%, 1XPBS) e armazenar como 50-100 mL / tubo de alíquotas a -80 ° C.
5. All-trans-ácido retinóico solução de trabalho (1000X): 10 mM em DMSO, armazenar em alíquotas a -80 ° C.
6. Media células estaminais embrionárias humanas: DMEM/F12 ou KO-DMEM (80%), KO substituição de soro (20%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MEM aminoácidos não essenciais (MNAA, 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com 20 ng / ml bFGF antes de usar. Ou substituição de "knock out (KO) a substituição do soro" com componentes definidos: DMEM/F12 ou KO-DMEM (100%), L-alanil-L-gln ou L-gln (2 mM), MNAA (1X), MEM essenciais aminoácidos (MEAA, 1X), e β-mercaptoetanol (100 mM), filtrado e armazenar a 4 ° C, suplementado com bFGF (20 ng / ml), a insulina humana (20 mcg / ml), ácido ascórbico (50 mg / ml), humana ativina A (50 ng / ml), albumina humana Albumax / (10 mg / ml), e transferrina humana (8 mcg / ml) antes de usar.
7. NSC mídia: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), heparina (8 mcg / ml).

2. Revestimento placa

1. Placas de revestimento com gelatina: adicionar 2,5 ml / poço de solução de gelatina a 6 placas bem e incubar durante a noite em uma incubadora de 37 ° C umidificado.
2. Placas de revestimento com laminina: frio de gelatina revestidos e remover placas de gelatina, adicione 2,5 ml / solução de revestimento bem Matrigel ou humano laminina trabalhando para pré-gelatinizado refrigerados 6-bem placas e incubar a 4 ° C durante a noite.

3. Passaging e propagação hESCs indiferenciado sob condições definidas

1. Permitir colônias CTEh crescer até 5-7 dias de idade, e ter placa de cultura CTEh para microscópio de dissecação (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados.
2. Selecione colônias CTEh a ser dividido. Morfologicamente, essas colônias devem ter> 75% hESCs indiferenciada (pequenas células compactas), geralmente um pouco opaco (não-brancos empilhados células não diferenciadas células claras) com borda definida underneath o microscópio de dissecação. Cuidadosamente delinear as colônias selecionadas e remover camada de fibroblastos diferenciados em torno da colônia e todas as partes diferenciadas (se houver) da colônia com a borda da P2 ponteira estéril ou puxado capilar de vidro. (Por favor note, hESCs pluripotentes estão em uma fase transitória, sofrem diferenciação espontânea, mesmo em condições óptimas, apesar de preferida, é difícil para as células verificar teses são 100% indiferenciado sob microscópio de dissecação,> 75% indiferenciados são geralmente considerados como o ponto de passagem. A células diferenciadas normalmente não sementes e continuar a crescer, eliminados no processo de passaging)
3. Remover a velha mídia contendo flutuante destacada células diferenciadas por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml bFGF.
4. Cortar as colônias CTEh indiferenciado em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou vidro puxado capilar.
5. Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem contendo 20 ng / ml bFGF e piscina juntos.
6. Aspirar o Matrigel ou solução laminina humana, desde as placas revestidas fresco. Alíquota de 4 ml / poço media CTEh contendo peças colônia para uma placa de seis poços. Suavemente transferir a placa para incubadora, sem agitação e permitir semente peças colônia durante a noite sem perturbar em um umidificado 37 ° C incubadora com uma atmosfera de 5% de CO _2.

4. Indução neural da hESCs em Sistema Cultura Definido com ácido retinóico

1. No dia 3 após a semeadura, remover a maior parte velha mídia de cada poço da placa e deixe a mídia o suficiente para permitir colônias CTEh a ser submersa (nunca permitir hESCs a secar). Substituir com 4 ml / media CTEh bem fresco contendo 20 ng / ml e 10 mM bFGF ácido retinóico.
2. Substituir a velha mídia com a mídia CTEh fresco contendo 20 ng / ml e bFGF10 mM de ácido retinóico em dias alternados, e permitir que as colônias neural induzida CTEh crescer para dia 7 ou 8. Todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações morfologia de grandes células diferenciadas que continuarão a se multiplicar. As colônias irão aumentar de tamanho para cobrir a placa de dia 7 ou 8, e as células começam a se acumular em algumas áreas das colônias.

5. Continuando Diferenciação Neuronal em Cultura Suspensão

1. Tome placa CTEh cultura para dissecar microscópio (pré-aquecido dissecar palco para 37 ° C) por baixo de dissecação capô esterilizados. Cuidadosamente delinear as colônias e remover camada de fibroblastos ao redor da colônia (células diferenciadas migraram para fora da colônia) com a borda da ponta da pipeta estéril ou P2 puxado capilar de vidro.
2. Remover a velha mídia contendo flutuante células de fibroblastos destacado por aspiração. Lavar com media hESC (sem bFGF) uma vez. Adicionar 3 ml / media CTEh bem fresco (sem bFGF).
3. Cut the-neural icolônias CTEh nduced em pequenos pedaços, e retire com ponteira estéril ou puxado capilar de vidro.
4. Piscina a mídia que contém peças colônia separada juntos em um tubo de 50 ml. Lave a placa uma vez com 1 ml / media CTEh bem (sem bFGF) e piscina juntos.
5. Alíquota de 4 ml / poço media sem soro CTEh contendo peças colônia para uma placa de fixação 6-ultralow bem e incubar em um 37 ° C incubadora umidificada para permitir flutuante aglomerados celulares (neuroblastos) para formar por 4-5 dias.

6. Maturação Fenótipo neuronal em Cultura Adhesive

1. Piscina a mídia que contém neuroblastos flutuando juntos em um tubo de 50 ml. Centrifugar a 1400 rpm por 5 min. Aspirar a velha mídia, tanto quanto você pode e adicionar uma quantidade igual de novo NSC mídia contendo VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml).
2. Pipeta cima e para baixo para misturar neuroblastos flutuante e alíquota de 4 ml / poço a 6-lamelas. Os neuroblastos também pode ser sieded em um laminina / colágeno (Matrigel) ou humana laminina polimerizada 3-dimensional da matriz nos meios de comunicação sem soro contendo NSC VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) . Transferir os pratos para a 37 ° C incubadora umidificada para permitir neuroblastos para anexar durante a noite.
3. Substituir NSC mídia contendo VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), e BDNF (10 ng / ml) em dias alternados. Extensas redes de neurite, tendo células neuronais e células pigmentadas começarão a aparecer dentro de 2 semanas de cultivo contínuo e aumentar em número com o tempo, e poderia ser sustentado por mais de 3 meses.

7. Resultados representativos:

Ácido retinóico (AR) é prestado suficiente para induzir hESCs mantido no sistema de cultura definida para a transição de pluripotência exclusivamente a um fenótipo neuroectodérmico (Fig. 2A). Após a exposição de hESCs indiferenciada à AR, todas as células dentro da colônia vai sofrer alterações a morfologiagrandes células diferenciadas que deixam expressar pluripotência associada a marcadores, como indicado por Oct-4, e começar a expressar vários neuroectoderma associados marcadores, como HNK1, AP2 e TrkC (Fig. 2B). Estas células grandes diferenciada continuarão a se multiplicar e as colônias irão aumentar de tamanho, procedendo-se espontaneamente para expressar o marcador precoce neuronal β-tubulina III (Fig. 2B). O marcador mais maduro neuronal Mapa-2 começará a aparecer em áreas das colônias, onde as células se acumularam (Fig. 2B). Coincidente com a aparência das células neuroectodérmico e diferenciação neuronal, o fator de transcrição específicos neuronal Nurr1, implicado na diferenciação neuronal dopaminérgica e ativação da tirosina hidroxilase (TH) gene ^16, vai translocar para o núcleo (Fig. 2B). Depois de separado, o hESCs RA-tratados formarão flutuante aglomerados celulares (neuroblastos) em um culto de suspensãoure para continuar o processo de diferenciação neural. Após a remoção de bFGF e depois permitir a neuroblastos para anexar a uma placa de cultura de tecidos ou semeadas em um polimerizado laminina / colágeno 3-dimensional da matriz em um meio isento de soro definido, β-III-tubulina e Mapa-2-expressando, neurite de rolamento de células e células pigmentadas começarão a aparecer com um aumento drástico em termos de eficiência, em comparação com diferenciação multi-linhagem espontânea de hESCs sem tratamento sobre o mesmo período de tempo, e poderia ser sustentado por mais de três meses (Fig. 2C).

Figura 1 Um esquema de bem-controlados de indução eficiente de células-tronco pluripotentes humanas exclusivamente a uma linhagem particular clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas.

Figura 2 ng retinóico induz especificação linhagem neural e progressão neuronal direta de pluripotência sob condições definidas. (A) Esquema mostrando a linha do tempo de protocolo de dirigido diferenciação neuronal de hESCs. (B) Após a exposição de hESCs indiferenciada ao ácido retinóico (AR), sob o sistema de cultura definido, grande diferenciados Oct-4 (vermelho) células negativas dentro da colônia começaram a surgir, em comparação com o mock-tratados (DMSO) hESCs como o controle . RA-induzida diferenciada células Oct-4-negativos começaram a expressar HNK-1 (vermelho), AP2 (vermelho), TrkC (verde), e depois β-tubulina III (vermelho), consistente com a diferenciação neuroectodérmico cedo. Estas células continuou a amadurecer, em última análise expressando o marcador neuronal Mapa-2 (verde), geralmente em áreas onde as células começaram a se acumular. Coincidente com a aparência das células neuroectodérmico e diferenciação neuronal, o fator de transcrição específicos neuronal Nurr1 (verde), implicados nadiferenciação neuronal dopaminérgica e ativação da tirosina hidroxilase (TH) gene, translocada para o núcleo. Todas as células são mostrados por DAPI coloração de seus núcleos (azul). (C) induz a diferenciação de tratamento RA em direção a uma linhagem neuronal com alta eficiência, avaliada pela extensa rede de neuritos-bearing células que expressam β-tubulina III (vermelho) e Map-2 (verde, mostrado em uma matriz 3-dimensionais). Setas indicam células pigmentadas típico daqueles no SNC. Todas as células são mostrados por DAPI coloração de seus núcleos (azul) na inserções. Barras de escala: 0,1 mm.

Discussão

Um dos grandes desafios tanto para estudos de desenvolvimento e tradução clínica tem sido a forma de canalizar o potencial de diferenciação gama de células-tronco pluripotentes humanas a um fenótipo desejado de forma eficiente e previsível. Apesar de tais células podem se diferenciar espontaneamente in vitro em células de todas as camadas germinativas, passando por uma fase agregado multi-linhagem, apenas uma pequena fração de células perseguir um ^1,4 linhagem dada. Naqueles agregados CTEh derivados, o aparecimento simultâneo de uma quantidade substancial de amplamente divergentes tipos de células indesejadas que podem residir em três folhetos embrionários, muitas vezes faz com que o surgimento de fenótipos desejados não só ineficiente, mas incontroláveis ​​e não confiável também. Embora linhagens cardíaco e neural foram derivados em relatórios anteriores, no entanto, a ineficiência na geração de células especializadas, por meio de germes camada de indução de células pluripotentes e alto risco de tumorigenicidade seguintes transplantation têm impedido de nova tradução clínica.

As linhas CTEh inicialmente foram obtidos e mantidos em co-cultura com crescimento de fibroblastos de rato preso embrionárias (MEFs) ^4. Apesar de alimentador humanas diversas, alimentador-livre, e sistemas de cultura quimicamente formuladas têm sido desenvolvidos para hESCs ^11-13, os elementos necessários e suficientes para sustentar a auto-renovação das células pluripotentes humanas permanecem sem solução. Estas células de alimentação exógena e reagentes biológicos ajudam a manter o crescimento estável a longo prazo de hESCs indiferenciada, enquanto máscara a capacidade das células pluripotentes a responderem aos sinais de desenvolvimento. Manter hESCs indiferenciado em um sistema de cultura definida biológicos livre que permite a expansão fiel e diferenciação direta controlável é uma das chaves para a sua utilidade terapêutica e potenciais. RA não foi suficiente para induzir a diferenciação neuronal de hESCs indiferenciada mantido sob Condit anteriormente relatadosíons contendo células de alimentação exógena. Embora linhagens neural aparecer em um estágio relativamente inicial na diferenciação CTEh, tratando CTEh diferenciadas multi-linhagem agregados (corpos embrióides) com AR apenas um ligeiro aumento do baixo rendimento dos neurônios ^{1, 14, 15.} A fim de alcançar uniformemente conversão de células pluripotentes estaminais humanas a uma linhagem especial, empregamos um sistema de cultura definido capaz de segurar a proliferação de hESCs indiferenciado para identificar as condições para o bem-controlados de indução eficiente de hESCs pluripotentes exclusivamente para uma determinada linhagem clinicamente relevante pelo simples fornecimento de pequenas moléculas (Fig. 1, fig. 2). Futuros estudos revelarão moléculas controle genéticas e epigenéticas no desenvolvimento do SNC humano como alternativas, que podem pavimentar o caminho para o controle de molécula pequena mediada direta e modulação do destino pluripotentes CTEh quando derivar linhagens clinicamente relevantes para terapias regenerativas. RA sem tratamento, 1-5HESCs% serão submetidos a diferenciação espontânea em neurônios ^{1, 14, 15.} Com o tratamento RA, temos sido capazes de gerar> 95% embrionárias progenitores neurais e de neurônios a partir de hESCs mantido sob uma cultura define em um processo que pode emular o desenvolvimento embrionário humano ^14. Recentemente, conhecido destino neural-determinação genes têm sido usados ​​para transdifferentiate fibroblastos de rato adulto em progenitores neurais e neurônios com uma baixa eficiência variando 0,5-8% ^{17, 18.} No entanto, as células somáticas reprogramadas têm sido historicamente associada com a expressão do gene anormal e senescência acelerada com utilidade terapêutica prejudicada ^19-21. Finalmente, o protocolo que estabelecemos aqui é limitado a hESCs pluripotentes derivadas da massa celular interna (ICM) ou epiblasto do blastocisto humano ^4, não se aplicar a outras células pluripotentes, incluindo animais originou-CES, CES derivadas de anteriores mórula (oito células) em estágio embriões ^22, e ArtifAs células reprogramadas icially ^23.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nome do reagente	Companhia	Número de catálogo	Comments (opcional)
Gelatina	Sigma	G1890
Matrigel	BD biociência	356231	Fator de crescimento reduzida
Laminina humana	Sigma	L6274
all-trans-ácido retinóico	Sigma	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out substituição de soro	Invitrogen	10828028
MEM solução aminoácido não essencial (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEM ummino solução ácidos (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β-mercaptoetanol	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
Ácido ascórbico	Sigma	A4403
Transferrina humana	Sigma	T8158
Humana bFGF	PeproTech	AF-100-18B
Insulina humana	Invitrogen	12585014
Humana ativina A	PeproTech	120-14E
Humana BDNF	PeproTech	AF-450-02
Humano VEGF	PeproTech	AF-100-20
Humana NT-3	PeproTech	450-03
Heparina	Sigma	H5284
N-2 suplemento (100X)	Invitrogen	17502048
6-bem placa de fixação ultralow	Corning	3471
6 bem-placa	Corning	3516