Dérivation efficace des ressources humaines progéniteurs neuronaux et des neurones à partir pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines à l'induction de petites molécules

Résumé

Nous avons établi un protocole pour l'induction de neuroblastes direct pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines maintenues dans des conditions définies avec de petites molécules, qui permet la dérivation d'une offre importante de progéniteurs neuronaux humains et neuronale types de cellules dans le développement du SNC pour les neurones de réparation.

Résumé

Il ya un grand besoin non satisfait d'une source cliniquement approprié de cellules neuronales humaines pour la réparation ou la régénération du système nerveux endommagé central (SNC) la structure et les circuits dans l'industrie des soins de santé d'aujourd'hui. Des thérapies cellulaires sont très prometteurs pour restaurer le tissu nerveux et la fonction perdue pour les troubles du SNC. Toutefois, les thérapies cellulaires basés sur le SNC dérivées des cellules souches neurales ont rencontré restriction de l'offre et de la difficulté à utiliser dans le cadre clinique en raison de leur capacité d'expansion limitée dans la culture et de la plasticité ne après de longues ^1-3 repiquage. Malgré quelques effets bénéfiques, le CNS dérivées des cellules souches neurales (hNSCs) semblent exercer leurs effets thérapeutiques principalement par leur non-neuronales descendances grâce à la production et trophiques molécules neuroprotectrices pour sauver les cellules endogènes ^1-3. Alternativement, pluripotentes cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) cures proférer pour une large gamme de troubles neurologiques par supplying la diversité des types de cellules neuronales humaines dans le SNC en développement pour la régénération ^1,4-7. Cependant, comment canaliser le potentiel de différenciation des CSEh gamme pluripotentes efficacement et de façon prévisible à un phénotype désiré a été un défi majeur pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique. Les approches classiques s'appuient sur ​​la multi-lignée de cellules pluripotentes inclinaison grâce à la différenciation de germe de la couche spontanée, résultant dans la lignée de l'engagement-inefficace et incontrôlable qui est souvent suivie d'hétérogénéité phénotypique et de l'instabilité, par conséquent, un risque élevé de tumorigénicité ^7-10. En outre, les étrangers non définie / animal suppléments biologiques et / ou des mangeoires qui ont généralement été utilisé pour l'isolation, l'expansion et la différenciation des CSEh peuvent faire usage direct de ces cellules spécialisées greffes chez des patients problématiques ^11-13. Pour surmonter ces obstacles, nous avons résolu les éléments d'un système de culture définies nécessaire et suffisante pour sustaining l'épiblaste pluripotence des CSEh, servant de plateforme de novo dérivation de CSEh cliniquement appropriée et efficace de diriger les CSEh uniforme de telles lignées envers cliniquement pertinente par de petites molécules ¹⁴ (s'il vous plaît voir un schéma de la figure 1.). L'acide rétinoïque (AR) n'induit pas de différenciation neuronale des CSEh indifférenciées maintenu sur les départs ^{1, 14.} Et contrairement CES souris, le traitement des CSEh différenciées corps embryoïdes (EB) n'augmente que faiblement le faible rendement des neurones ^{1, 14, 15.} Cependant, après criblage d'une variété de petites molécules et des facteurs de croissance, nous avons constaté que ces conditions définies rendu l'acide rétinoïque (AR) suffisante pour induire la spécification de neuroectoderme direct de CSEh pluripotentes encore progressé au neuroblastes qui a généré humaine progéniteurs neuronaux et les neurones dans le SNC en développement avec une grande efficacité (Fig. 2). Nous avons défini les conditions d'induction de la neuroexplosions direct de CSEh pluripotentes sans intervention multi-lignée stade de corps embryoïdes, permettant bien contrôlée de dérivation efficace d'une grande quantité de cellules neuronales humaines à travers le spectre des stades de développement à base de cellules thérapeutiques.

Protocole

1. Solution et les médias Préparation

1. Solution d'enrobage gélatine: 0,1% (p / v) de gélatine dans ddH ₂ O, à l'autoclave et conserver à 4 ° C.
2. Matrigel solutions de revêtement. Solution mère: le dégel lent Matrigel (10 ml) à 4 ° C pendant la nuit, ajoutez 10 ml glacée DMEM ou DMEM/F12, bien mélanger et aliquote de 1 ml / tube sous le capot de culture de tissus stérilisés, conserver à -20 ° C. Solution de travail: le dégel lent aliquote de 1 ml de Matrigel à 4 ° C pendant 1-2 heures, transfert à 14 ml refroidi DMEM ou DMEM/F12 et bien mélanger sous le capot de culture de tissus stérilisés immédiatement avant revêtement.
3. Homme solution d'enrobage laminine: diluer 1 ml de solution humaine laminine (0,5 mg / ml en tampon Tris NaCl, stocker à -80 ° C, laisser décongeler lentement à 4 ° C pendant 1-2 heures) avec glacée DMEM ou d'DMEM/F12 12,5 ml de solution de travail (40 pg / ml) sous le capot de culture de tissus stérilisés immédiatement avant revêtement.
4. Des solutions de facteur de croissance des stocks (500-1000X): dissoudre facteur de croissance à 10 ug/ Ml dans un tampon stérile (0,5% de BSA, 1,0 mM DTT, 10% glycérol, 1XPBS) et stocker que 50-100 ul / tube aliquotes à -80 ° C.
5. All-trans-rétinoïque solution de travail (1000X): 10 mM dans le DMSO, stocker en aliquots à -80 ° C.
6. Les médias HESC: DMEM/F12 ou KO-DMEM (80%), du sérum de remplacement KO (20%), la L-alanyl-L-Gln-Gln ou L (2 mM), MEM acides aminés non essentiels (MNAA, 1X), et β-mercaptoéthanol (100 uM), filtrée et conserver à 4 ° C, additionné de 20 ng / ml de bFGF avant utilisation. Ou en remplaçant «knock out (KO) le remplacement du sérum" avec des composants définis: DMEM/F12 ou KO-DMEM (100%), la L-alanyl-L-Gln-Gln ou L (2 mM), MNAA (1X), MEM essentielles acides aminés (MEAA, 1X) et β-mercaptoéthanol (100 uM), filtrée et conserver à 4 ° C, complété par le bFGF (20 ng / ml), l'insuline humaine (20 pg / ml), acide ascorbique (50 pg / ml), activine A humaine (50 ng / ml), de l'albumine humaine / Albumax (10 mg / ml), et de la transferrine humaine (8 pg / ml) avant utilisation.
7. NSC médias: DMEM/F12 (100%), N-2 supplement (1X), l'héparine (8 pg / ml).

2. Revêtement Plate

1. Manteau avec plaques de gélatine: ajouter 2,5 ml / puits de solution de gélatine à 6 plaques à puits et incuber une nuit dans un 37 ° C incubateur humidifié.
2. Manteau plaques de laminine: chill plaques enduites de gélatine et de supprimer la gélatine, ajouter 2,5 ml / puits Matrigel ou humains solution d'enrobage laminine travail de pré-réfrigérée gélatinisé plaques 6 puits et incuber à 4 ° C pendant la nuit.

3. Le repiquage et l'ensemencement CSEh indifférenciées dans des conditions définies

1. Autoriser les colonies CSEh poussent à 5-7 jours anciens, et de prendre des plaques de culture des CSEh au microscope à dissection (préchauffer disséquer étape à 37 ° C) sous le capot dissection stérilisés.
2. Sélectionnez les colonies de CSEh à fractionner. Morphologiquement, ces colonies doivent avoir> 75% CSEh indifférenciées (petites cellules compactes), habituellement légèrement opaque (pas blanc-empilées les cellules, pas clairement différenciées des cellules) à bord de l'ONU définitderneath le microscope à dissection. Soigneusement décrire les colonies sélectionnées et enlever la couche de fibroblastes différenciés qui entourent la colonie et toutes les parties différenciées (le cas échéant) de la colonie avec le bord de la P2 pointe de pipette stérile ou tiré capillaire en verre. (S'il vous plaît noter que les CSEh pluripotentes sont à un stade transitoire, subissent une différenciation spontanée même dans des conditions optimales, bien que préférée, il est difficile de déterminer les cellules mémoires sont 100% indifférencié sous le microscope de dissection,> 75% indifférenciées sont généralement considérés comme le point de passage. Le cellules différenciées généralement pas de graines et de continuer à croître, éliminés dans le processus de repiquage)
3. Retirez le vieux médias contenant flottante détachée des cellules différenciées en aspirant. Laver avec les médias de CSEh (sans bFGF) une fois. Ajouter 3 ml / media CSEh bien frais contenant 20 ng / ml de bFGF.
4. Couper les colonies CSEh indifférenciées en petits morceaux, et détacher avec la pointe de pipette stérile ou en verre tiré capillaire.
5. Piscine les médias contenant des pièces détachées colonie ensemble dans un tube conique de 50 ml. Laver la plaque une fois avec 1 ml / media CSEh puits contenant 20 ng / ml de bFGF et mettre en commun.
6. Aspirer le Matrigel ou humains solution de laminine à partir des plaques revêtues frais. Aliquoter 4 médias sur les CSEh ml / puits contenant des morceaux colonie à une plaque à 6 puits. Délicatement le transfert de la plaque de l'incubateur sans secouer et permettre la colonie plantons nuit sans déranger dans un incubateur humidifié 37 ° C avec une atmosphère de 5% de CO _2.

4. L'induction neurale des CSEh sous Système culture définie par l'acide rétinoïque

1. Au jour 3 après le semis, enlever la plupart des vieux médias de chaque puits de la plaque et laisser les médias suffisamment pour permettre des colonies de CSEh à être submergée (CSEh jamais permettre à sécher). Remplacez-le par 4 ml / media CSEh bien frais contenant 20 ng / ml de bFGF et 10 uM d'acide rétinoïque.
2. Remplacer les vieux médias avec les médias CSEh frais contenant 20 ng / ml de bFGF et de10 l'acide rétinoïque uM tous les autres jours, et permettre à des colonies de CSEh neuronaux induits par jour passera à 7 ou 8. Toutes les cellules au sein de la colonie va subir des modifications morphologiques de grandes cellules différenciées qui continueront à se multiplier. Les colonies va augmenter en taille pour couvrir la plaque par jour, 7 ou 8, et les cellules commencent à s'accumuler dans certaines zones des colonies.

5. Poursuivant la différenciation neuronale en culture en suspension

1. Prenez la plaque de culture des CSEh à disséquer au microscope (préchauffer disséquer étape à 37 ° C) sous le capot dissection stérilisés. Soigneusement aperçu des colonies et de supprimer la couche de fibroblastes entourant la colonie (les cellules différenciées ont émigré hors de la colonie) avec le bord de la pointe de la pipette stérile ou P2 tiré capillaire en verre.
2. Retirez le vieux médias contenant des cellules de fibroblastes flottante détachée par aspiration. Laver avec les médias de CSEh (sans bFGF) une fois. Ajouter 3 ml / media CSEh bien frais (sans bFGF).
3. Coupez les neurones i-colonies de CSEh nduced en petits morceaux, et détacher avec la pointe de pipette stérile ou tiré capillaire en verre.
4. Piscine les médias contenant des pièces détachées colonie ensemble dans un tube conique de 50 ml. Laver la plaque une fois avec 1 ml / media CSEh bien (sans bFGF) et la piscine ensemble.
5. Aliquoter 4 ml / puits des médias CSEh sans sérum contenant des morceaux colonie à une plaque à 6 puits ultra attachement et incuber dans un 37 ° C incubateur humidifié pour permettre aux grappes flottantes cellulaires (neuroblastes) pour former pendant 4-5 jours.

6. Maturation phénotype neuronal dans la culture adhésif

1. Piscine le support contenant les neuroblastes flottante ensemble dans un tube conique de 50 ml. Centrifuger à 1400 rpm pendant 5 min. Aspirer le vieux médias autant que vous le pouvez et ajouter la même quantité de frais NSC supports contenant du VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), et le BDNF (10 ng / ml).
2. Pipeter haut et en bas pour mélanger les neuroblastes flottants et aliquote de 4 ml / puits de plaques 6 puits. Les neuroblastes peut aussi être soiEDED dans un polymérisée laminine / collagène (Matrigel) ou humaine laminine trois dimensions de matrice dans les médias NSC sans sérum contenant du VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), et le BDNF (10 ng / ml) . Transférer les plaques à un 37 ° C incubateur humidifié pour permettre aux neuroblastes pour attacher la nuit.
3. Remplacer NSC supports contenant du VEGF (20 ng / ml), NT-3 (10 ng / ml), et le BDNF (10 ng / ml) tous les autres jours. De vastes réseaux de neurites portant les cellules neuronales et les cellules pigmentées va commencer à apparaître dans les 2 semaines de culture continue et d'augmenter en nombre avec le temps, et peut être maintenu pendant plus de 3 mois.

7. Les résultats représentatifs:

L'acide rétinoïque (AR) est rendue suffisante pour induire CSEh maintenu dans le système de culture définies à la transition de la pluripotence exclusivement à un phénotype neuroectodermique (figure 2A). Lors de l'exposition des CSEh indifférenciées de la PR, toutes les cellules à l'intérieur de la colonie va subir des modifications morphologiques augrandes cellules différenciées qui cessent d'exprimer pluripotence associée marqueurs, comme indiqué par Oct-4, et commencer à exprimer diverses neuroectoderme associée marqueurs, tels que HNK1, AP2, et TrkC (figure 2B). Ces grandes cellules différenciées continueront à se multiplier et les colonies va augmenter en taille, de procéder spontanément à exprimer les marqueurs précoces neuronaux β-III-tubuline (figure 2B). Le marqueur plus mature neuronale MAP-2 va commencer à apparaître dans les zones des colonies où les cellules se sont entassés (figure 2B). Coïncidant avec l'apparition des cellules neuroectodermiques et la différenciation neuronale, la neuronale facteur spécifique de transcription Nurr1, impliqué dans la différenciation neuronale dopaminergique et l'activation de la tyrosine hydroxylase (TH) du gène ^16, sera une translocation vers le noyau (figure 2B). Après détaché, l'AR-CSEh seront traités sous forme flottante amas cellulaires (neuroblastes) dans un culte de suspensionUre de poursuivre le processus de différenciation neuronale. Lors du retrait de bFGF et après avoir permis les neuroblastes à joindre à une plaque de culture de tissus ou ensemencées dans un polymérisée laminine / collagène en 3 dimensions de matrice dans un milieu sans sérum défini, β-III-tubuline et de Carte-2-exprimer, neurites portant les cellules et les cellules pigmentées va commencer à apparaître avec une augmentation drastique de l'efficacité par rapport aux lignées multiples spontanées différenciation des CSEh sans traitement au cours de la même période, et peut être maintenu pendant plus de 3 mois (figure 2C).

Figure 1 Un schéma de bien contrôlée par induction efficace de cellules souches pluripotentes humaines exclusivement à une lignée particulière cliniquement pertinente par simple mise à disposition de petites molécules.

Figure 2 acide rétinoïque induit la spécification neurale et la progression de la lignée neuronale directe de la pluripotence dans des conditions définies. (A) Schéma montrant la ligne de temps du protocole de différenciation neuronale dirigé des CSEh. (B) Lors de l'exposition des CSEh indifférenciées à l'acide rétinoïque (AR) en vertu du système de culture définis, différenciés grande Oct-4 (rouge) des cellules négatives au sein de la colonie a commencé à émerger, par rapport à la maquette traités (DMSO) CSEh que le contrôle . RA-induite des cellules différenciées Oct-4-négatives ont commencé à exprimer HNK-1 (rouge), AP2 (rouge), TrkC (vert), puis β-III-tubuline (rouge), compatible avec neuroectodermique différenciation précoce. Ces cellules ont continué à mûrir finalement exprimant le marqueur neuronal Carte-2 (vert), généralement dans des zones où les cellules commencent à s'entasser. Coïncidant avec l'apparition des cellules neuroectodermiques et la différenciation neuronale, la neuronaux spécifiques facteur transcriptionnel Nurr1 (vert), impliqué dansdopaminergiques différenciation neuronale et l'activation de la tyrosine hydroxylase (TH) gène, une translocation vers le noyau. Toutes les cellules sont représentées par coloration DAPI de leurs noyaux (bleu). (C) traitement de la PR induit la différenciation vers un lignage neuronal avec une grande efficacité évaluée par de vastes réseaux de neurites portant des cellules exprimant β-III-tubuline (rouge) et la carte-2 (vert, montré dans une matrice en 3 dimensions). Les flèches indiquent les cellules pigmentées typiques de ceux dans le SNC. Toutes les cellules sont représentées par coloration DAPI de leurs noyaux (bleu) dans les encarts. Barres d'échelle: 0,1 mm.

Discussion

Un des défis majeurs pour les deux étude sur le développement et la traduction clinique a été la manière de canaliser le potentiel de différenciation éventail de cellules souches humaines pluripotentes à un phénotype désiré de manière efficace et prévisible. Bien que ces cellules peuvent se différencier spontanément in vitro en cellules de toutes les couches de germe en passant par une phase globale multi-lignée, seule une petite fraction des cellules poursuivre une lignée de ^1,4 donnée. Dans ces agrégats CSEh dérivées, l'apparition simultanée d'une quantité importante de types de cellules largement divergentes indésirables qui peuvent résider dans les trois feuillets embryonnaires fait souvent l'émergence de phénotypes souhaités non seulement inefficace, mais incontrôlables et peu fiables aussi bien. Bien que les lignées cardiaques et neuronaux ont été tirés dans les rapports précédents, cependant, l'inefficacité dans la production des cellules spécialisées par le biais de germe de couche-induction de cellules pluripotentes et le risque élevé de tumorigénicité suivantes transplantation ont entravé autre traduction clinique.

Les lignées de CSEh ont été dérivées d'abord et maintenus en co-culture avec la croissance des fibroblastes embryonnaires de souris arrêtés (FAE) ^4. Bien que plusieurs d'alimentation humaine, alimentation-libres et des systèmes de culture chimiquement formulés ont été développés pour les CSEh ^11-13, les éléments nécessaires et suffisants pour soutenir l'auto-renouvellement des cellules pluripotentes humaines restent non résolus. Ces cellules nourricières exogènes et réactifs biologiques aident à maintenir la croissance stable à long terme des CSEh indifférenciées alors le masque de la capacité des cellules pluripotentes à réagir aux signaux du développement. Maintenir CSEh indifférenciées dans un système de culture biologiques sans définie qui permet l'expansion fidèle et contrôlables différentiation directe est l'une des clés de leur utilité thérapeutique et potentiels. RA n'a pas été suffisante pour induire la différenciation neuronale des CSEh indifférenciées maintenu sous condit précédemment rapportéions contenant des cellules nourricières exogènes. Bien que les lignées neurales apparaître à un stade relativement précoce de la différenciation des CSEh, traitant de CSEh différenciées multi-lignée agrégats (corps embryoïdes) atteints de PR que légèrement augmenté le faible rendement des neurones ^{1, 14, 15.} Afin d'atteindre uniformément conversion des cellules souches pluripotentes humaines d'une lignée particulière, nous avons employé un système de culture définies capable d'assurer la prolifération des CSEh indifférenciées d'identifier les conditions pour bien contrôlée par induction efficace de CSEh pluripotentes exclusivement à une lignée particulière cliniquement pertinentes par simple mise à disposition de petites molécules (Fig. 1, Fig. 2). Des études futures révèlent molécules contrôle génétique et épigénétique dans le développement du système nerveux central humain comme des alternatives, qui peuvent ouvrir la voie à de petites molécules à médiation contrôle direct et la modulation du destin pluripotentes CSEh lors de la dérivation des lignées cliniquement pertinentes pour les thérapies régénératrices. Sans traitement RA, 1-5CSEh% va subir une différenciation spontanée en neurones ^{1, 14, 15.} Avec traitement de la PR, nous avons été en mesure de générer> 95% d'embryons progéniteurs neuronaux et les neurones à partir de CSEh maintenu sous une culture de définir dans un processus qui pourrait émuler le développement embryonnaire humain ^14. Récemment, connue neural sort déterminant les gènes ont été utilisés pour transdifférencier fibroblastes de souris adultes en progéniteurs neuronaux et les neurones avec une faible efficacité allant de 0,5 à 8% ^{17, 18.} Toutefois, reprogrammées cellules somatiques ont été historiquement associée à l'expression des gènes anormaux et de la sénescence accélérée avec une utilité thérapeutique déficience ^19-21. Enfin, le protocole, nous avons établi ici est limitée à CSEh pluripotentes dérivées de la masse cellulaire interne (MCI) ou épiblaste de l'humain blastocyste ^4, ne s'appliquent pas à d'autres cellules pluripotentes, y compris les animaux provenaient des CES, les CES issus de précédentes morula (huit cellules) au stade embryons ²² et artifcellules reprogrammées icially ^23.

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Nom du réactif	Société	Numéro de catalogue	Commentaires (optionnel)
Gélatine	Sigma	G1890
Matrigel	BD Bioscience	356231	Facteur de croissance réduite
Homme laminine	Sigma	L6274
tout-trans-rétinoïque	Sigma	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM-KO	Invitrogen	10829018
Knock-out de remplacement du sérum	Invitrogen	10828028
MEM solution d'acide aminé non essentiel (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
MEM uneMino acides solution (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β-mercaptoéthanol	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
L'acide ascorbique	Sigma	A4403
Transferrine humaine	Sigma	T8158
BFGF humain	PeproTech	AF-100-18B
L'insuline humaine	Invitrogen	12585014
Homme activine A	PeproTech	120-14E
Human BDNF	PeproTech	AF-450-02
VEGF humain	PeproTech	AF-100-20
Human NT-3	PeproTech	450-03
Héparine	Sigma	H5284
N-2 supplément (100X)	Invitrogen	17502048
6-même plaque de fixation ultra	Corning	3471
6-même la plaque	Corning	3516