작은 분자와 유도 Pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 인간의 연결을 Progenitors과 뉴런의 효율 유도

요약

우리는 인간의 연결을 progenitors 및 신경 수리 개발 CNS에의 연결을 세포 유형의 대형 공급 파생을 가능하게 작은 분자와 함께 정의된 조건 하에서 유지 pluripotent 인간 배아 줄기 세포에서 직접 neuroblasts의 유도를위한 프로토콜을 설립했습니다.

초록

수리 또는 손상된 중추 신경계의 재생 (CNS) 구조와 오늘날의 의료 산업에서 회로에 대한 임상 - 적합한 인간의 연결을 세포 소스에 대한 큰 이루어지지 않은 필요가있다. 세포 기반 요법은 CNS 장애에 대한 손실 신경 조직과 기능을 복원하는 큰 약속을 잡아. 그러나, CNS - 파생 신경 줄기 세포에 따라 세포 요법은 공급 제한 및 인한 광범위한 passaging ^1-3 이후 문화와 실패 소성에서 제한된 확장 능력에 임상 설정에 사용하는 데 어려움이 발생했습니다. 일부 이익 결과에도 불구하고, CNS - 파생된 인간의 신경 줄기 세포 (hNSCs)는 내생 세포가 ^1-3 구조로 생산 영양과 neuroprotective 분자를 통해 주로 자신 이외의 연결을 progenies함으로써 치료 효과를 발휘하기 위해 나타납니다. supplyin에 의해 신경 질환의 광범위한 양자 택일로, pluripotent 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 proffer의 치료g 중생 ^1,4-7에 대한 개발 CNS 인간의 연결을 세포 유형의 다양성. 그러나, 원하는 표현형에 효율적이고 예측할 수 pluripotent hESCs의 다양한 차별의 가능성을 채널하는 방법을 개발 연구와 임상 번역 모두에 큰 도전을했습니다. 종래의 접근 방식은 종종 phenotypic 이질과 불안정, 따라서, tumorigenicity ^7-10 높은 위험을 따라 비효율적과 지나치게 혈통 - 노력의 결과로, 자연 배아 계층 분화를 통해 pluripotent 세포의 멀티 혈통 기울기에 의존하고 있습니다. 또한, 정의되지 않은 외국인 / 동물 생물 학적 보조 및 / 또는 일반적으로 격리, 확장, 그리고 hESCs의 분화에 사용되었습니다 모이통는 ^11-13 문제 환자에서 이러한 세포 이식 전문 직접 사용할 수 있습니다. 이러한 장애물을 극복하기 위해, 우리는 필요한 s에 대한 충분한 정의된 문화 시스템의 요소를 해결임상 - 적절한 hESCs의 드 노보 유도를위한 플랫폼으로 제공, hESCs의 epiblast의 pluripotence을 ustaining하고 효과적으로 작은 분자 ¹⁴ (그림 설계도를 참조하시기 바랍니다. 1)에 의해 임상 - 관련 lineages으로 균일하게 같은 hESCs을 지휘. Retinoic 산 (RA)는 모이통 ^{1, 14 일} 유지 undifferentiated hESCs의 분화를 유도의 연결하지 않습니다. 그리고 마우스 ESCs와는 달리, hESC - 차별화 embryoid기구 (EBS)을 치료 것은 약간 뉴런 ^{1, 14, 15의} 낮은 수확량을 증가시킵니다. 그러나, 작은 분자 및 성장 요인의 다양한 상영 후, 우리는 이러한 정의 조건이 더 이상 인간의 연결을 progenitors과에서 뉴런을 생성 neuroblasts로 진행 pluripotent hESCs에서 직접 neuroectoderm의 사양을 유발하는 retinoic 산성 (RA)가 충분한 렌더링 발견 고효율 발전 CNS (그림 2). 우리는 신경의 유도에 대한 조건을 정의세포 기반 치료제에 대한 개발 단계의 스펙트럼에 걸쳐 인간의 연결을 세포의 대형 공급 잘 제어 효율적인 파생을 가능하게 개입 멀티 혈통 embryoid 바디 단계없이 pluripotent hESCs에서 직접 폭발.

프로토콜

1. 솔루션 및 미디어 준비

1. 젤라틴 코팅 솔루션 : 4 0.1 % (W / V) ddH ₂ O, autoclaved에 젤라틴 및 저장 ° C.
2. Matrigel 코팅 솔루션을 제공합니다. 증권 솔루션 : ° C 야간 10 ML 얼음처럼 차가운 DMEM이나 DMEM/F12를 추가, 잘 섞어 나누어지는 1 ML / 소독 조직 문화 후드 아래 튜브, -20에 저장 ° C. 4 느린 해동 Matrigel (10 ML) 작업 솔루션 : 천천히 녹여 4 일 ML Matrigel의 나누어지는 ° C DMEM이나 DMEM/F12를 차게 14 ML에 1-2위한 시간, 전송 및 코팅하기 전에 즉시 소독 조직 문화 후드 아래에 잘 섞는다.
3. 인간 laminin 코팅 솔루션 : 희석 한 ML 인간 laminin 솔루션 얼음처럼 차가운 DMEM 또는 DMEM/F12 함께 (트리스의 0.5 MG / ML -80에서 저장, NaCl을 버퍼 ° C, 1-2 시간 동안 4 ° C에서 느린 해동) 12.5 ML 작업 솔루션 (40 μg / ML) 소독 조직 문화 후드 아래에 바로 코팅하기 전에.
4. 성장 인자의 재고 솔루션 (500 1000X)는 10 μg의 성장 요인을 풀다멸균 버퍼 / ML (0.5 % BSA, 1.0 MM DTT, 10 % 글리세롤, 1XPBS)와 -80에서 50-100 μl / 튜브 aliquots로 저장 ° C.
5. 모든 트랜스 - retinoic 산은 용액 (1000X) 작동 : -80에서 DMSO, aliquots에 저장에서 10 밀리미터를 ° C.
6. HESC 미디어 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (80 %), KO 혈청 교체 (20 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), 가상 불필요한 아미노산 (MNAA, 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의), 필터링 및 4 저장 ° 사용하기 전에 20 NG / ML bFGF와 함께 보충 C,. 또는 정의된 구성 요소 "(KO) 혈청 교체를 내라"대체 : DMEM/F12 또는 KO - DMEM (100 %), L - alanyl - L - gln 또는 L - gln (2 ㎜), MNAA (1X), 가상 필수 아미노산 (MEAA, 1X) 및 β - 메르 캅 토 에탄올 (100 μm의)는, 필터링 및 4 저장 ° bFGF (20 NG / ML), 인간 인슐린 (20 μg / ML), 아스코르비 산 (50 μg /로 보충 C, ML), 인간의 activin (50 NG / ML), 인간 / 알부민 Albumax (10 MG / ML), 그리고 인간의 트랜스페린 (8 μg / ML)을 사용하기 전에.
7. NSC 미디어 : DMEM/F12 (100 %), N - 2 supplemeNT (1X), 헤파린 (8 μg / ML).

2. 플레이트 코팅

1. 와 코트 판 젤라틴 : 시간을 추가하십시오 ML / 물론 6 자 접시에 젤라틴 용액의 2.5 37 ° C 배양기에서 하룻밤 humidified 품어.
2. 코트 laminin과 접시 : 냉기 젤라틴 - 코팅 접시와 젤라틴 제거는, 2.5 ML 추가 / 미리 냉장에 잘 Matrigel 또는 인간의 laminin 코팅 작업 솔루션은 4 ° C 하루에 6 접시와 잘 부화를 gelatinized.

3. 정의된 조건 하에서 Undifferentiated hESCs를 Passaging 및 심는

1. hESC의 식민지가 5~7일 나이로 성장할 수 있도록하고, 해부 현미경 (사전 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 소독 후드를 해부 아래에 hESC 문화 플레이트 가져가라.
2. hESC의 식민지가 분할을 선택합니다. Morphologically,이 식민지는 정의된 가장자리 유엔과 함께 일반적으로 약간 불투명한> 75% undifferentiated hESCs (작은 소형 세포), (하지 하얀 쌓여 업 세포가 아닌 명백한 차별화된 세포)가 있어야해부 현미경 derneath. 신중하게 선택한 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지이나 유리 모세관 뽑아 (있을 경우)은 식민지를 둘러싼 차별 fibroblast 계층과 모든 차별화된 부분을 제거합니다. (참고, pluripotent의 hESCs는 해부 현미경으로 백퍼센트 undifferentiated 아르 선호하지만, 그건 확인할 논문 전지하는 것도 어려운 일이지만, 심지어는 최적의 조건 하에서 자발적인 차별을 받다, 과도 단계에 있으며,> 75 % undifferentiated가 일반적으로 통과 지점으로 간주됩니다. 차별화된 세포는 일반적으로 종자되지 않으며 passaging 과정에서 제거 성장 계속)
3. aspirating로 부동 분리된 차별화된 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML 추가 / 20 NG / ML bFGF를 포함하는 잘 신선한 hESC 미디어.
4. 작은 조각으로 undifferentiated hESC의 식민지 잘라하고, 멸균 피펫 팁 또는 모세관 뽑아 유리 분리합니다.
5. 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 1 ML / 함께 20 NG / ML bFGF와 수영장을 포함하는 잘 hESC 미디어와 함께 한 접시를 씻으십시오.
6. 코팅 신선한 접시에서 Matrigel 또는 인간의 laminin 솔루션을 기음. 6 잘 판에 식민지 조각을 포함하는 나누어지는 4 ML / 잘 hESC 미디어. 부드럽게 떨지 않고 배양기에 플레이트를 전송하고 5 % CO ₂ 분위기 humidified 37 ° C 배양기에서 방해없이 식민지 조각의 씨앗이 하룻밤 수 있습니다.

4. Retinoic 산성과 정의 문화 체제에서 hESCs의 신경 유도

1. 시딩 후 3 일에, 접시 각 우물에서 이전 미디어의 대부분을 제거하고 hESC의 식민지 (hESCs가 건조 절대로 용납할) 빠져들 수 있도록 충분한 미디어를 두십시오. 20 NG / ML bFGF와 10 μm의 retinoic 산성을 포함하는 4 ML / 물론 신선한 hESC 미디어로 바꿉니다.
2. 20 NG / ML bFGF와를 포함하는 신선한 hESC 매체와 오래된 미디어를 교체10 μm의 retinoic 산성 매일 다른 하루, 그리고 신경 유도 hESC의 식민지 일 7 또는 8로 성장 수 있습니다. 식민지 내의 모든 세포가 번식에 계속 큰 차별화된 세포 형태 변화를 받아야합니다. 식민지는 하루에 7 또는 8 시까지 번호판을 충당하기 위해 크기가 증가되며, 세포는 식민지의 일부 지역에서 무더기로 쌓이기 시작합니다.

5. 서스펜션 문화의 연결을 계속 차별

1. 멸균 후드를 해부 아래 현미경 (미리 따뜻한 37 단계를 해부 ° C) 해부에 hESC 문화 플레이트를 가져가라. 조심스럽게 식민지 개요 및 P2 멸균 피펫 팁의 가장자리와 식민지를 둘러싼 fibroblast 층 (차별화된 세포 식민지 밖으로 마이 그 레이션)을 제거하거나 유리 모세관 뽑았.
2. aspirating로 부동 분리 fibroblast 세포를 포함하는 기존의 미디어를 제거합니다. 한번 hESC 미디어 (bFGF없이)로 씻으십시오. 3 ML / 물론 신선한 hESC 미디어 (bFGF없이) 추가합니다.
3. 잘라내기 신경 - Induced hESC의 작은 조각으로 식민지, 그리고 멸균 피펫 팁과 분리 또는 유리가 모세 뽑았.
4. 50 ML 원뿔 튜브에서 함께 분리 식민지 조각을 포함하는 미디어 풀. 함께 한 ML / 잘 hESC 미디어 (bFGF 제외) 수영장과 함께 한 접시를 씻으십시오.
5. 나누어지는 4 ML / 음 37 6 잘 ultralow 첨부 플레이트와 부화 식민지 조각을 포함하는 혈청이없는 hESC 미디어 ° C humidified 인큐베이터가 떠있는 세포 클러스터 (neuroblasts)가 4-5일에 대한 양식 수 있습니다.

6. 접착제 문화의 연결 표현형의 성숙

1. 50 ML 원뿔 튜브에 함께 떠 neuroblasts를 포함하는 미디어 풀. 5 분 1,400 rpm으로 원심 분리기. 당신이 할 수만큼 기존의 미디어를 대기음하고 VEGF (20 NG / ML), NT - 3 (10 NG / ML) 및 BDNF (10 NG / ML)이있는 신선한 NSC 미디어의 동일한 금액을 추가합니다.
2. 4 ML / 잘 6 잘 접시에 부동 neuroblasts과 나누어지는를 섞어 아래 피펫합니다. neuroblasts 또한 SE 수 있습니다laminin / 콜라겐 (Matrigel) 또는 인간의 laminin polymerized VEGF (20 NG / ML), NT - 3 (10 NG / ML) 및 BDNF (10 NG / ML)가 포함된 혈청 무료 NSC 미디어에서 3 차원 매트릭스에 eded . 37에 접시를 전송 ° C humidified 인큐베이터가 neuroblasts가 밤새 첨부할 수 있습니다.
3. NSC 미디어 포함하는 VEGF (20 NG / ML), NT - 3 (10 NG / ML) 및 BDNF (10 NG / ML) 매일 다른 하루를 교체합니다. neurite 베어링의 연결을 세포와 색소 세포의 광범위한 네트워크는 지속적인 재배 및 시간 수의 증가 2 주 이내에 나타나기 시작하며, 3 개월 이상 지속 될 수 있습니다.

7. 대표 결과 :

Retinoic 산 (RA)는 전용 neuroectodermal의 표현형 (그림 2A)로 pluripotency에서 전환 정의된 문화 시스템에 유지 hESCs을 유발하기에 충분 렌더링됩니다. RA에 undifferentiated hESCs의 노출시, 식민지 내의 모든 세포는 형태 변화를 받게 될 것이다pluripotency - 관련된 마커를 표현 중지 큰 차별 세포로 월 4로 표시하고, 다양한 neuroectoderm - 관련 등 HNK1 같은 마커, AP2, 그리고 TrkC을 (그림 2B) 표현 시작합니다. 이러한 큰 차별 세포가 증식을 계속하고 식민지는 초기의 연결 마커 β - III - tubulin을 (그림 2B) 표현하기 위해 자발적으로 진행, 크기로 증가합니다. 좀 더 성숙 마커의 연결지도 - 2는 세포 (그림 2B) 쌓여있는 식민지 영역에 표시됩니다. neuroectodermal 세포와 분화의 연결의 모양과 일치하는, 티로신 hydroxylase (TH) 유전자 ¹⁶ dopaminergic의 연결을 분화 및 활성화에 연루의 연결을 구체적인 transcriptional 요인 Nurr1은, 핵 (그림 2B)로 이동시키다합니다. 분리된 후, RA - 대우 hESCs는 서스펜션 컬트에 떠있 세포 클러스터 (neuroblasts) 형성신경 분화 과정을 계속 ure. bFGF의 제거시와 neuroblasts가 β - III - tubulin과지도 - 2 - 표현, neurite 혈청 무료 정의 매체 laminin / 콜라겐 polymerized 3 차원 매트릭스의 씨앗을 품고 조직 문화 판 또는 첨부 허용 이후 - 베어링 세포와 색소 세포는 같은 기간 동안 치료하지 않고 hESCs의 자발적인 멀티 혈통 분화에 비해 효율성의 급격한 증가로 나타나기 시작하며, 3 개월 이상 (그림 2C)에 대한 지속 될 수 있습니다.

그림 1은 독점적으로 작은 분자의 간단한 규정에 의한 특정 임상 - 관련 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 잘 제어 효율 유도의 개략도.

그림 2 Retinoic 산은 신경 혈통 사양 및 정의 조건 pluripotency를 직접 진행의 연결을 유도. (A) 도식은 hESCs의 감독의 연결을 분화의 프로토콜 시간 라인 묘사. (B) 정의된 문화 시스템에서 retinoic 산성 (RA)에 undifferentiated hESCs의 노출되면, 대형은 월 4 차별화된 식민지 이내 (적색) 부정적인 세포는 컨트롤과 같은 모의 - 대우 (DMSO) hESCs에 비해 등장하기 시작 . RA - 유발 차별 월 4 부정적인 세포가 표현 HNK - 1 (빨간색), AP2 (적색), TrkC (녹색) 시작 후 초기 neuroectodermal 차별과 β - III - tubulin (적색), 일관성. 이러한 세포는 궁극적으로 일반적으로 세포가 무더기로 쌓이기 시작 부분에있는 마커의 연결지도 - 2 (녹색)를 표현하는 성숙 계속. neuroectodermal 세포와 분화의 연결의 모양과 일치에의 연결을 특정 transcriptional 요인 Nurr1 (녹색), 연루dopaminergic의 연결을 분화와 티로신 hydroxylase (TH) 유전자의 활성화는 핵에 translocated. 모든 세포들은 핵의 DAPI의 얼룩 (파란색)으로 표시됩니다. β - III - tubulin (적색) 및지도 - 2 (3 - dimentional 매트릭스에 표시된 녹색) 표현 neurite - 베어링 세포의 광범위한 네트워크에 의한 평가로 (C) RA 치료는 높은 효율의 연결 혈통으로 차별을 유도. 화살표 CNS 이들의 전형적인 색소 세포를 나타냅니다. 모든 세포는 insets에서 핵의 DAPI의 얼룩 (파란색)으로 표시됩니다. 스케일 바 : 0.1 mm.

토론

발달 연구와 임상 번역 모두의 주요 과제 중 하나는 효율적이고 예측할 원하는 표현형에 pluripotent 인간 줄기 세포의 광범위한 차별 잠재력을 채널로하는 방법되었습니다. 이러한 세포가 여러 혈통 골재 단계를 통해 이동하여 모든 세균 레이어의 세포로 체외에서 자발적으로 구별 수 있지만, 세포의 작은 파편만이 주어진 계보 (Lineage) ^1,4을 추구. 그 hESC - 파생 집계에서 삼배 배아 레이어에있는 수 광범위하게 분기하는 원치 않는 세포 유형의 상당한 금액의 동시 모습은 종종 비효율뿐만 아니라 원하는 phenotypes의 출현을 만드는,하지만 통제하고 신뢰할 수뿐만 아니라. 심장과 신경 lineages는 이전 보고서에서 파생되어 있지만, 그러나, pluripotent 세포의 세균 레이어 유도 및 tumorigenicity의 높은 위험을 통해 전문적인 세포를 생성하는 비효율이 transplantatio에 따라n은 추가 임상 번역을 방해했습니다.

hESC 라인은 초기 성장 체포 마우스 배아 섬유아 세포 (MEFs) ⁴ 파생된 및 공동 문화 유지했다. 여러 인간 피더, 피더 - 무료 및 화학적 - 조제 문화 시스템 hESCs ^11-13을 위해 개발되었습니다지만 필요하고 인간 pluripotent 세포의 자기 갱신을 유지에 충분한 요소가 미해결 상태로 유지됩니다. 이러한 외인성 피더 세포 및 생물 학적 시약은 마스크 반면에 발달 신호에 응답하는 pluripotent 세포의 능력을 undifferentiated hESCs의 장기적인 안정 성장을 유지할 수 있도록 도와주십시오. 성실 확장 및 관리할 수있는 직접적인 차별을 허용하는 정의 biologics 무료 문화 시스템에 undifferentiated hESCs을 유지하는 것은 자신의 치료 유틸리티와 가능성의 열쇠 중 하나입니다. RA는 이전에 보고된 condit 이하 유지 undifferentiated hESCs의의 연결을 분화를 유도하기 위해 충분한 아니었외인성 피더 세포를 포함하는 이온. 신경 lineages는 RA와 hESC - 차별화된 멀티 혈통 집계를 (embryoid 기관) 치료, hESC의 차별화에 상대적으로 초기 단계에 나타납니다 있지만 약간 뉴런 ^{1, 14, 15의} 낮은 수확량을 증가했습니다. 특정 혈통에 인간의 pluripotent 줄기 세포의 일정한 변환을 달성하기 위해, 우리는 임상 - 관련 혈통 특정에 독점적으로 pluripotent의 hESCs의 잘 제어 효율 유도 조건을 식별하는 undifferentiated hESCs의 확산을 할려고 수있는 정의된 문화 시스템을 채용 작은 분자의 단순한 제공 (그림 1, 그림. 2). 미래 연구는 재생 요법에 대한 임상 - 관련 lineages를 파생하면 hESC의 pluripotent 운명의 작은 분자 중재 직접 제어 및 모듈 레이션을위한 방법을 포장 수있는, 대안으로 인간 CNS 개발 유전 및 epigenetic 조절 분자를 보여줄 것입니다. RA 치료, 1-5없이%의 hESCs는 뉴런 ^{1, 14, 15으로} 자발적인 차별을 받아야합니다. RA 치료와 함께, 우리는 인간의 배아 발달 ¹⁴ 에뮬레이트 수도 과정에서 정의하는 문화에 따라 유지 hESCs에서> 95% 배아의 연결 progenitors과 뉴런을 생성할 수있게되었습니다. 최근 유전자를 결정 알려진 신경 운명은 0.5-8 % ^{17, 18까지} 낮은 효율 성인 신경 progenitors과 뉴런에 마우스 섬유아 세포를 transdifferentiate하는 데 사용되었습니다. 그러나, 다시 프로그램 체세포 역사적으로 비정상적인 유전자 발현 및 장애 치료 유틸리티를 ^19-21로 가속 노화와 관련된되었습니다. 마지막으로, 우리가 여기 설립 프로토콜, 내부 세포 덩어리 (ICM) 또는 인간 blastocyst ⁴ epiblast에서 파생된 pluripotent hESCs로 제한됩니다는 morula 이전에서 파생 동물 - 기원 ESCs, ESCs (8 등 다른 pluripotent 세포에 적용되지 않을 수도 있습니다 세포) 단계 배아 ^22, 그리고 인형도 만들고icially 다시 프로그램 세포 ^23.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	댓글 (옵션)
젤라틴	시그마	G1890
Matrigel	bioscience BD	356,231	성장 요인은 감소
인간 laminin	시그마	L6274
모든 트랜스 - Retinoic 산	시그마	R2625
DMEM/F12	Invitrogen	10565018
DMEM	Invitrogen	31053036
DMEM - KO	Invitrogen	10829018
노크 아웃 혈청 대체	Invitrogen	10828028
가상 불필요한 아미노산 솔루션 (MNAA, 100X)	Invitrogen	11140050
가상미노 산 솔루션 (MEAA, 100X)	Invitrogen	11130050
β - 메르 캅 토 에탄올	Invitrogen	21985023
Albumax	Invitrogen	11020021
아스코르비 산	시그마	A4403
인간 트랜스페린	시그마	T8158
인간 bFGF	PeproTech	AF - 100 - 18B
인간 인슐린	Invitrogen	12585014
인간 activin	PeproTech	120 14E
인간 BDNF	PeproTech	AF - 450-02
인간 VEGF	PeproTech	AF - 100-20
인간 NT - 3	PeproTech	450-03
헤파린	시그마	H5284
N - 2 보충제 (100X)	Invitrogen	17502048
6 잘 ultralow 첨부 플레이트	코닝	3471
6 - 잘 플레이트	코닝	3516