במקביל, צלחת תזרים לשכת ואת מעגל זרימה רציפה להערכת ובתאים אנדותל תחת מתח זרימה למינרית שאר

Summary

אנחנו המתאר שיטה תאים חסיד נתונים ללחץ הזרימה למינרית גזירה במעגל תזרים סטרילי מתמשך. הדבקה של התאים, מורפולוגיה ניתן ללמוד דרך תא שקוף, דגימות שהתקבלו במעגל לניתוח המטבוליט ותאי שנקטפו לאחר חשיפה גזירה לניסויים עתידיים או תרבות.

Abstract

המטרה הכללית של שיטה זו היא לתאר טכניקה לנושא תאים חסיד לתנאי זרימה למינרית ולהעריך את תגובתם גזירה נוזל לכימות גם מדגיש ^1.

תא הזרימה שלנו לעצב מעגל הזרימה (איור 1) כוללת אזור צפייה שקוף המאפשר בדיקה של הידבקות התא הדמיה של מורפולוגיה תא מיד לפני זרימה (איור 11 א ', ב'), בנקודות זמן שונות במהלך הזרימה (איור 11C) , ואחרי זרימה (איור 11D). ניסויים אלה מומחשים עם חבל הטבור דם האדם הנגזרות ובתאים אנדותל (EPCs) ו חזירי EPCs ^2,3.

שיטה זו היא גם החלים על סוגי תאים אחרים חסיד, למשל בתאי שריר חלק (SMCs) או fibroblasts.

החדר ואת כל החלקים של המעגל הם מעוקרים בקלות עם מעוקר קיטור. בניגוד אחריםבתאי, לדוגמה בתאי microfluidic, מספר גדול של תאים (> 1000000 תלוי בגודל התא) ניתן לשחזר לאחר הניסוי זרימה בתנאים סטריליים עבור תרבית תאים או ניסויים אחרים, כגון ה-DNA או RNA החילוץ, או אימונוהיסטוכימיה (איור 11E), או מיקרוסקופיית אלקטרונים ^5. הלחץ גזירה יכול להיות מותאם על ידי שינוי קצב הזרימה של perfusate, את צמיגות הנוזל, או את גובה ורוחב הערוץ. זה האחרון יכול להפחית את נפח נוזל או צרכי התא תוך הקפדה כי חד מימדי הזרימה נשמרת. אין זה הכרחי למדוד את גובה תא בין הניסויים, שכן גובה קאמרית אינו תלוי בשימוש אטמים, אשר מגדיל מאוד את הקלות של ניסויים מרובים. יתר על כן, תכנון מעגלים בקלות מאפשר איסוף דגימות perfusate עבור ניתוח ו / או כימות של מטבוליטים מופרש על ידי תאים תחת חשיפה נוזל הלחץ גזירה, למשל תחמוצת החנקן (איור 12) ⁶

Protocol

1. אבי האנדותל תא הבידוד

1. לפני כל איסוף של דם אנושי הפריפריה, להגיש פרוטוקול המחקר שלך לדירקטוריון סקירה מוסדיים שלך (IRB), לאחר אישורה, יש לקבל את התורמים בהתנדבות "הסכמה מדעת (אוסף דם היקפיים ובידוד EPC אושרו על ידי IRB אוניברסיטת דיוק ו הוא תוך ציות מלא לדרישות הרגולציה בארה"ב הקשור להגנה על המשתתפים במחקר האדם).
2. כאשר עובדים עם בעלי חיים הנגזרות EPCs, יש פרוטוקול המחקר אושר על ידי טיפול בבעלי חיים מוסדיים שלך השתמש הוועדה (IACUC). כל הניסויים שלנו חזירי אושרו על ידי אוניברסיטת דיוק IACUC ו נערכו בהתאם לסטנדרטים הגבוהים ביותר של טיפול הומני.
3. עבור בידוד של ובתאים אנדותל, לאסוף 50 מ"ל של דם היקפיים באמצעות טכניקה phlebotomy תקן מתורם מתנדב הסכים לתוך שקיות איסוף דם מלא citrat נוגד הקרישהדואר פוספט דקסטרוז ו לדלל את התמיסה 01:01 עם פתרון שנאגרו של האנק מלח (ללא CaCl _2, MgCl _2, MgSO ₄₎ שכבת על כמויות שוות של Histopaque כדי ליצור שכבות מוגדרות היטב.
4. צנטריפוגה (30 דקות, 740 גרם, הגדרת לשבור נמוך) לאסוף את התא mononuclear (MNC) (באפי מעיל) השכבה. Resuspend ולשטוף MNCs x 3 עם פוספט של Dulbecco שנאגרו מלוחים (DPBS) עם סרום 10% שור עוברית (FBS) x 10 דקות, 515 גרם, לפני ציפוי לשתי -12 גם צלחות בינוני מלא צמיחה EPC (MCDB-131 בינוני עם 5 מ"ל של 200 מ"מ L-גלוטמין, 10% FBS ו EGM-2 SingleQuots) בשעה 37 ° C, 5% CO _2.
5. לאט לאט לשנות בינוני כל 24 שעות במשך 7 הימים הראשונים, ולאחר מכן בכל יום אחר. מושבות EPC ניתן לזהות לאחר תקופה ממוצעת של 14 ימים על בסיס מורפולוגיה המרוצף שלהם. לאחר EPCs ב ¼ תרבות לכסות שטח של 12-היטב את פני השטח, להרחיב תאים לאשר זהות EPC עם cytometry זרימה על ידי בדיקת נוכחות סמנים פני השטחCD31 והיעדר CD14, CD45 כפי שתואר לעיל ^6. מבחני אחרים שעלולים להתבצע כוללים מורפולוגיה תא וסימון עם DiI-AC-LDL.
6. על הניסויים המתוארים כאן, להרחיב EPCs מבודד עד שהם ומחוברות כמעט 3 T-75 תרבות צלוחיות תא בינוני EPC ב חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.

2. הלחץ שאר החישוב

1. אנו ממליצים כי חישובים אלה מבוצעים לפני בייצור קאמרית ערוץ יש הבנה מעמיקה של התנאים שניתן להשיג. חשב את קצב הזרימה של perfusate במעגל שלך מבוסס על גזירה הרצוי מדגיש שיש להחיל את התאים לפי משוואה ¹ 1,

איפה ש הוא שיעור זרימת הרצוי, τ הוא היעד שללשמוע הלחץ משחק בעקיפין על התאים, W הוא רוחב של תא הזרימה, h הוא הגובה של החדר הזרימה, μ הוא צמיגות של perfusate (בינוני זרימה).

2. ערך טיפוסי של צמיגות (μ) עבור שימוש בינוני הוא 0.9 CP (0.009 גרם ס"מ ^-1 s ^-1). שים לב צמיגות ניתן גם העלה באמצעות משקל גבוה dextran מולקולרית, אם רוצים כל כך ^7. ערך טיפוסי של מתח גזירה היעד (τ) היא להשתמש dynes 15 / ² ס"מ, (גזירה אופייני מתח העורקים) או 100 dynes / ² ס"מ, אם העל פיזיולוגיים מתח גזירה היא הרצויה. החדר שלנו בדרך כלל יש רוחב (w) של 1.9 ס"מ וגובה (ח) בטווח של 166-267 מיקרומטר.

3. תא ייצור תזרים

1. חותכים את צלחות העליון והתחתון של התא דואר ממלאי סגסוגת אלומיניום 6061 מלבני עם הממד העליון של 7 x 2 "ממדים והתחתון של 7 x 2 x 0.25" x 0.5.
2. הפסקה את הצלחת העליונה בחלק מרכז 0.125 "עמוק, עוזב 0.950" לכל סוף 1.375 עבור "רחב x 0.3125" מאגר הנוזלים עמוק.
3. מקדחה 1 / 16 "רחב x 0.625" חריצי ארוכה התחתון על מנת לחדור אל המאגר על יבוא ומסתיים יצוא.
4. בסוף כל צלחת העליון, לקדוח במיקום מרכזי 10/32 "מסלולים לאינץ' (TPI) חור עבור פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה צינור לחדור למאגר נוזלים. בצד יבוא, ליצור תקע לצד 10/32 "TPI דרך החור של פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה צינור.
5. שפיד התחתון העליון מזרם הנוזל אל חלון זכוכית לצפייה ב 0.518 מעלות נאות ערבוב של נוזל.
6. גזור חלון שקופיות זכוכית לתוך צלחת תחתית בקו אחד עם חלון לצפייה העליון. באמצעות מלט אקווריום, דבק שקופיות הזכוכית לתוך החדר. אפשר לרפא לפחות 24 שעות.ודא כי חלון הצפייה הפסקה כך 75 x 25 מ"מ x 1 מיקרוסקופ שקופיות זכוכית אשב סומק בחדר.
7. צור ההפסקה עבור טבעת-O סביב החלק התחתון של צלחות העליון והתחתון כאלה שהם במרווחים זה מזה על ידי 0.02 ". הכנס את O-טבעות גומי.
8. מקדחה 10 התאמת 8 / 32 "חורים TPI בתאי העליון והתחתון לשימוש עם 8 / 32" ברגי ראש שטוח.

4. מעגל הרכבה Flow

1. להרכיב את מעגל זרימה כולו תחילה, ואחר כך להמשיך עם העיקור שלה.
2. צרף "קטע של צינורות קשה בקצה אחד של dampener הדופק (דרך 1 / 8" 36 קשר). כדי לסיים את האחר, לצרף קטע 18 "של צינורות רך.
3. מניחים 1 / 8 "מתאם luer זכר בסוף 18" קטע צינור רך, שהוזכר בשלב 4.2. חבר את luer זכר ל 1 / 8 "מתאם luer הנשי. צרף את luer נקבה חדשה 18" צינורות קטע רך.
4. מקדחה שלושה חורים לתוך כובע 250 מ"ל כוס זכוכית על מנת להתאים צינורות. אניnsert 1.5 ", קטע של צינור רך (כמו פתח אוורור) לתוך חור אחד מסתיים ללא צינור רך וקשה דרך 2 חורים אחרים המכסה לבקבוק 250 מ"ל זכוכית (כמאגר) (איור 2). ודא צינורות קשה מגיע התחתון של המאגר (כמו צינורות יצוא מן המאגר).
5. לעקר את החלקים הנ"ל על ידי מעוקר קיטור על 121 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות. בנוסף החיטוי קאמרי זרימה מלאה, 3 x 2 "מקטעים של צינור רך, 1 זכר נקבה 1 1 / 8" מתאם luer, 4 x ½ "ו 6 x 5 / 16" 8-32 ברגים ראש שטוח, 1 פינצטה אחד 75 x 25 מ"מ x 1 כוס שקופית (או משטח אחר הרצוי חומר התא), ו 2 מגבות כירורגית.
6. המקום המגבות זרימה למינרית לתוך מכסה המנוע. מניחים את מעגל זרימה, חדר זרימה, 4 x 4-way והברזים למיניהם, 1 x 1-דרך שסתום, וכל החלקים מעוקרים משלב 4.5 למגרש הזה סטרילי.
7. עכשיו להשתמש בכפפות סטריליות לחבר שני 4-way והברזים למיניהם. המקום כמוסות על יציאות מדגם פתוח.
8. ניתוק מתאמי luer זכר ונקבה מצרף את שני פלחי צינורות הרכה של מעגל זרימת והכנס את והברזים למיניהם מחוברים (איור 3).
9. חבר את צינור רך מוכנס לתוך המאגר כדי מזרק 30 מ"ל ולהסיר את הבוכנה במזרק. מלאו את בקבוק 125 מ"ל של EPC בינוני (איור 4).
10. מקום מסנן מזרק סטרילי לתוך פתח האוורור (איור 4).
11. הזז את המעגל לזרום לתוך חממה humidified על 37 מעלות צלזיוס, 5% CO _2.
12. קלאמפ בצינור הקשיח לתוך הראש רולר המשאבה המצוין לשימוש עם סוג זה של צינור (איור 5). ודא כי הצינור אינו חופף עם המשאבה פסי גלילה גובר. סמן את צינורות איפה זה יוצא ראש משאבה מכל צד עם עט סימון.
13. ודא שכל והברזים למיניהם סגורים לכיוון היציאות המדגם פתוח לאורך מעגל הזרימה. הפעל את המשאבה. בדוק את כיוון הזרימה. Perfusate צריך להזיז frאום המאגר זכוכית דרך צינור קשיח לתוך dampener את הדופק.

5. EPC ניאון תיוג

1. בעוד מעגל זרימה מחמם עד 37 מעלות, להכין את התאים עבור זריעת לשקופית. שים לב תיוג פלורסנט נדרש אם התאים להיות דמיינו על חומרים אטומים, כגון טיטניום (TI).
2. יצירת מלאי 1 mM פתרון של תא כתום Tracker (CTO) על ידי דילול 50 מיקרוגרם CTO אבקה עם 90 μl של sulfoxide דימתיל (DMSO). הקפד מגן זו תערובת של חשיפה לאור (לכבות את האור בזמן שעבד מתחת למכסה המנוע לזרום).
3. יצירת 2 מיקרומטר פתרון העבודה של ה-CTO על ידי דילול של 36 μl פתרון מניות CTO לתוך 18 מ"ל של מדיום MCDB-131 בסרום חינם.
4. יש לשטוף EPCs ב 3 ליד ומחוברות T-75 תרבות צלוחיות עם תא DPBS 10 מ"ל (ללא Ca או Mg).
5. הוסף 6 מ"ל של פתרון ה-CTO 2 מיקרומטר פועלים כל בקבוק. דגירה של 15 דקות בשעה 37 ° C. יש לשטוף את כל הבקבוק x 2 עם 10 מ"ל DPBS (ללא Ca או Mg).
6. הוסף 4 מ"ל של טריפסין על כל בקבוק. לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 3 דקות. לנטרל עם 8 מ"ל של פתרון נטרול טריפסין.
7. שטפי על ידי x 5 דקות צנטריפוגה ב 600g ו resuspend ב 5 מ"ל של מדיום EPC.

6. תא זריעה של השקופית לפני זרימת הרכבה קאמרית

1. שקופית מזכוכית, טיטניום, או חומר אחר יכול לשמש, וכן להחליק את פני השטח ניתן לשנות על ידי ציפוי ספין עם פולימר או הוספת שכבה של מתכת. מניחים את השקופית לתוך כלי סטרילי מלבני ארבע תא תא התרבות (או רקמה להשתמש תרבות שקופיות בקבוק אם משטח קלקר הוא הרצוי). ספירת תאים וזרעי 1.5 x 10 ⁶ תאים לשקופית ב 5 מ"ל של שעה EPC בינוני 6 x אם שכבת תאים ומחוברות הוא הרצוי על תחילתו של זרם (איור 11 א).
2. על מנת לבחון תא הפצת הידבקות תחת לחץ גזירה נוזל, מאפשרים 3 x 10 ⁶ תאים לדבוק רק 15 דקות לפני תחילתו של זרם (זריעה מהירה) ( איור. 11 ב).

7. תא זרימה הרכבה

1. שימוש בכפפות סטריליות, חבר את 2 "קטע צינור רך 1 / 8" מתאם luer הנשי. חבר אחר 2 "קטע צינור רך 1 / 8" מתאם luer זכר.
2. חבר את 2 "צינור רך עם מתאם luer נקבה לנמל יבוא. צרף את 2" צינור רך עם luer זכר ליציאת יצוא. צרף 4-way והברזים למיניהם הן אלה מתאמים luer. חבר את 2 הנותרים "חתיכת צינור רך למחבר בצד יציאת הקרובים את מלכודת בועה לצרף שסתום 1-הדרך (איור 6).
3. בעזרת פינצטה סטרילי, להסיר את השקופית תא זרע מספינת תא התרבות (או אם באמצעות בקבוק שקופיות, להסיר את הבקבוק בשקופית) ולמקם אותו לתוך ההפסקה על הצלחת התחתונה של החדר הזרימה. ודא כי את השקופית ממוקם בצד התא seeded פונה כלפי מעלה.
4. Pipet 10 מ"ל של מדיום EPC חם לשקופית. אפשר המדיום כדי לכסות את שקופיות תא זרימה, בUT לא לשפוך את המדיום מעל טבעת-O על הצלחת התחתונה.
5. מניחים את הצלחת העליונה של החדר תזרים לצלחת התחתונה, ליישר את חורי הברגים. הקפידו לא להכניס בועות אוויר לתוך תא במהלך שלב זה על ידי שמירה על שני לוחות מקבילים.
6. בורג צלחות יחד (אוטומטי המופעל באמצעות סוללה נטענת מהירויות מברג את התהליך הזה).
7. הסר בועות אוויר ממלכודת בועה יבוא על ידי פתיחת שסתום 1-בדרך המצורפת הנמל יבוא בצד מלכודת בועה בעדינות ולשטוף את צינורות יבוא עם המדיום EPC באמצעות מזרק 10 מ"ל. ואז לסגור את הברז הזה ואת כובע זה (איור 7).
8. עכשיו להסיר בועות אוויר מערוץ קאמרית ידי פתיחת נמל יצוא 4-way שסתום ועל ידי שטיפה בעדינות בינוני EPC דרך תא הזרימה, שוב באמצעות מזרק 10 מ"ל. אם הבועות גדולות להישאר, להעלות סוף יצוא של החדר עד זווית של ° 45 (איור 8).
9. שווי כל 4-way חיבורי שסתום ולסגוראותם. הזז את תא לזרום לתוך החממה עם מעגל זרימת התאספו (איור 9).
10. השהה את המשאבה במעגל הזרימה. סגור את המעגל והברזים למיניהם זרימה לכיוון הזרימה כדי למנוע דליפה ולשמור את החלק הפנימי של חדר סטרילי. התחבורה הקאמרית לזרום למכסה המנוע לזרום במעגל זרם. חבר את תא לזרום במעגל זרם. פתח את והברזים למיניהם לכיוון הזרימה. קורות חיים המשאבה תזרים. ודא perfusate זורם בכיוון הנכון. התאם את קצב הזרימה ללחץ גזירה הרצוי.
11. במהלך הניסוי זרימה, חדר זרימת ניתן להסיר מן המעגל לתמונה תאים באמצעות אור או מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כדי לעשות זאת, נתק את תא לזרום במעגל זרם בכל החיבורים שסתום, שסתום. כדי לשמור על סטריליות של החדר, לסגור את המעגל זרימת והברזים למיניהם קאמרית והברזים למיניהם לזרום לכיוון הזרימה כובע כל והברזים למיניהם לפני הסרת מעגל זרימהמן האינקובטור (איור 9).

8. Perfusate אוסף מדגם

1. עבור איסוף קל של דגימות perfusate לניתוח, (למשל תחמוצת החנקן סינתזה), הפסקה הראשונה של המשאבה.
2. סגור את שסתום הממוקם קרוב dampener את הדופק. הסר את כיסוי המגן שלו להכניס מזרק גודל קטן, למשל מזרק 3 מ"ל, ליציאת המדגם. שמרו כובע ולוודא שהיא לא תהפוך מזוהמים על ידי הצבת אותו הפוך.
3. סגור את שסתום לכיוון החדר זרימה, שמירה על יציאת מדגם במעגל בכיוון של dampener הדופק פתוח.
4. צייר כמות הרצוי של המדגם, למשל 150 μl, מן המעגל. סגור את שסתום לכיוון הנמל מדגם לפני הסרת מזרק. חנות המדגם perfusate בבקבוקון שכותרתה ולהקפיא ב - 80 ° C (להגדרה תחמוצת החנקן בשלב מאוחר יותר).
5. Recap הנמל מדגם ולהבטיח כי כל והברזים למיניהם פתוחים לפני תחילת הזרימה.

9. נציג תוצאות

באמצעות שיטה זרע מהיר שלנו, אדם דם הנגזרות ובתאים אנדותל ניתן זורעים על גבי שקופיות טיטניום במשך 15 דקות ו לדבוק תחת (עורקים) כוחות פיזיולוגיים גזירה של 15 dynes / ² ס"מ.

כפי שניתן לראות בתרשים 10, EPCs להפיץ תחת השפעת תזרים מ 210 ± 11.4 מיקרומטר ^2, מיד לאחר הזריעה, כדי 657 ± 39.1 מיקרומטר ² אחרי 3 שעות, עד 1152 ± 55.3 מיקרומטר ² לאחר 24 שעות של מתח גזירה נוזל של 15 dynes / ² ס"מ (ההבדל בין הקבוצות הוא מובהק סטטיסטית עם p <0.0001, 1-way ANOVA). במקביל לגידול שטח התא, אשר ניתן הדמיה באמצעות תא שקוף עם מיקרוסקופ או אור או פלורסנט, עגלגלות המחושב לפי משוואה 2 ⁶

/ Files/ftp_upload/3349/3349eq2.jpg "/>

ירד מ 878 x 10 ^-3 ± 5.9 x 10 ^-3, מיד לאחר זריעה, אל 671 x 10 ^-3 ± 19.2 x 10 ^-3 אחרי 3 שעות, עד 526 x 10 ^-3 ± 19.2 x 10 ^-3 לאחר 48 שעות החשיפה של נוזל אותו גזירה מתח (ההבדל בין הקבוצות הוא שוב מובהקות סטטיסטית עם p <0.0001, 1-דרך ANOVA).

איור 11D ממחיש EPCs כי ליישר לכוון לכיוון הזרימה לאחר 48 שעות של מתח גזירה נוזל dynes 15 / ² ס"מ לעומת אוריינטציה אקראי שלהם לאחר תקופה זריעת סטטי של 6 שעות, שמוצג באיור 11 א.

השיטה שלנו מאפשרת גם קבלת דגימות של perfusate בנקודות זמן קבועות מראש עבור ניתוח ו / או כימות של מטבוליטים התא מופרשים. כדוגמה נציג אנו מתארים את production של הניטריט (NO ₂ -) במהלך הניסוי זרימה 48 שעות עם EPCs חזירי באיור 12. אנו נמדדים ישירות את המוצר הזה חמצון העיקרי של תחמוצת החנקן (NO) כסמן פונדקאית עבור NO בדגימות שנאספו בינוני מעגל זרימה בנקודות זמן שונות כדי להיות 12.0 nmol ב 6 שעות, 13.1 nmol ב 12 שעות, 16.3 nmol ב 24 שעות, 24.6 nmol לאחר 48 שעות 1 x 10 ⁶ תאים בבית dynes 15 / ² ס"מ ^6.

באיור 1. סכמטי המציג סקירה של הרכבה זרימת מעגל ולהתנסות לזרום. (א) מעגל זרימה הרכבה ללא תא הזרימה. כלול הנה המאגר, הדופק dampener, צינורות קשיחים, צינורות רכה, 4-way והברזים למיניהם ומתאמים luer מחובר, כמו גם מסנן אוויר. (ב) חיבור קאמרית זרימה דרך קטע צינור קשה בראשו משאבת זרימה. (ג) sertion של השקופית EPC-seeded לתוך צלחת התחתון של החדר זרימה (ד '). השלם הרכבה של המעגל לזרום עם תא זרימה.

באיור 2. הזרימה במעגל התאספו לחלוטין עבור עיקור.

באיור 3. מעגל זרימה Assembled לאחר עיקור עם והברזים למיניהם כלל.

איור 4. מילוי המאגר זכוכית עם 125 מ"ל של מדיום EPC.

איור 5. תזרים מעגל הידק לתוך הראש את המשאבה תזרים לפני הכניסה לתא לזרום.

jpg "/>
איור 6. הרכבה למעלה צלחת קאמרית.

איור 7. בפלאשינג את מלכודת בועה עם המדיום EPC כדי להסיר בועות יבוא מהצד של החדר.

איור 8. בפלאשינג את החדר עם המדיום EPC כדי להסיר בועות משקופית ועל הצד יצוא של החדר.

איור 9. לחלוטין התאספו במעגל לזרום עם תא זרימה מוכנס במהלך הניסוי זרימה.

איור 10. אזור EPC (ב מיקרומטר ²⁾ מגבירה במשך זמן הניסוי לזרום.

files/ftp_upload/3349/3349fig11.jpg "/>
איור 11. (א) התמונה של מיקרוסקופ אור HUCB EPCs seeded לשקופית פיברונקטין זכוכית מצופה x 6 שעות לפני זרימת בהגדלה של 100 x. (ב) HUCB EPCs שכותרתו עם CTO ומהיר seeded לשקופית טי x 15 דקות לפני זרימה, דמיינו עם מיקרוסקופ פלואורסצנטי בהגדלה של 100 x. (ג) להחליק אותו עם טי EPCs HUCB כמו תחת (ב), אחרי 3 שעות של זרימה ב 100 dynes / ² ס"מ ו - הדמיה באמצעות תא שקוף בהגדלה של 100 x. הערה כיוון התפשטות של תאים אבל עדיין אקראיים אחרי 3 שעות של זרימה. (ד) להחליק אותו טי, עכשיו לאחר 48 שעות של חשיפה תזרים בהגדלה של 100 x. EPCs מסומנים עם CTO ו גרעיני תאים מגואלות Hoechst צבע (כחול) לאחר זרימה. שים את יישור התאים כיוון הזרימה. (ה) EPCs חזירי להשוואה על טי לאחר 48 שעות של זרימה dynes 15 / ס"מ ^{2 של חשיפה ללחץ גזירה. גבולות התא הוכתמו אנטי PECAM כתם (ירוק) ו - גרעינים עם Sytox חומצה אורנג' גרעין הכתם. הערה יישור של תאים לתוך כיוון הזרימה.}

גרף איור 12. מתארת ​​NO ייצור EPCs חזירי במהלך 48 שעות של זרימה. המוצר העיקרי של חמצון NO, ניטריט (NO ₂ -), נמדדה כסמן פונדקאית עבור NO ממדגמים בינוני שנאספו בנקודות זמן שונות במהלך הזרימה.

איור 13. תא זרימה מורכב ממלאי סגסוגת אלומיניום 6061 מלבנית, עם החלק העליון (A) להיות 0.5 "x 2" x 7 "ואת החלק התחתון (B) 0.25" x 2 "x 7" בממד. העליון הואמהוקצע בחלק התחתון פני השטח שלו קשר O-Ring על 0.45 "על מנת להבטיח את שטיחות לאיטום. החלק העליון הוא השקוע בחלק במרכזו כדי 0.125", מה שמשאיר 0.95 "סוף לכל תמורת 0.3125" המאגר x "1.375 נוזל. המאגר סעיף למעלה הוא מושחל 3/8-24 TPI ו - 0.25 "עמוק לקבל הליכי תקעים נירוסטה. מכונות מדידה 1 / 16 "x 0.625" היו במכונה לתוך התחתון כי לחדור אל המאגר. תקע צד יבוא יש 10/32 "דרך החור של פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה צינור לצרף שסתום. בסוף כל יחידה יש ​​במיקום מרכזי מושחל 10/32 TPI של 0.25 "חלק עמוק פוליפרופילן 1 / 8" עקיצה הצינור סוף 0.45 "x 2". מסתיים להשתמש .07 "חור מהחלק התחתון של הנושאים דרך לחדור אל המאגר. התחתון של החלק העליון יש אזור מחודדות 0.6875" רחב, 0.518 מעלות ממרכז חריץ LH למרחק של 1.460 ". זה להתחדד תערובות לאזור שטוח 0.6875 "רחב x 0.0118" עמוק 0.590 "מסוף גלאסs (או משטח אחר, כגון שקופית טיטניום) בהפסקה. שטוח זה חייב להיות מיושר עם זכוכית (או משטח אחר, כגון טיטניום שקופיות) אחת את השקופית מותקן. להתחדד ושטוח הם מלוטשים. המשטח של השקופית היא 0.0118 "הפסקה מפני השטח התחתון. .0118" ההפסקה ממשיכה חריץ המאגר בקצה RH. O-Ring היא הפסקה לגמרי סביב חריצי והחלק עוזב 0.020 "של המשטח המקורי בין חריץ טבעת O והחלק. חלקו העליון ויחידות התחתונה הם קדחו חורים עשר. בחלק העליון יש חורים אישור עבור 8 / 32 TPI המשוקעים שטוח הברגים בראש. המקטע התחתון יש חורים להציב תואמים את החורים העליון הם הליכי 8 / 32 TPI. יחידת התחתון יש זכוכית שקופה שקופית חלון שטוף הפסקה עם משטח הממוקם מעל השקופית משטח זכוכית תא (או מחליק טיטניום). היחידה יש חריץ O-Ring הכולל חריצי ביחידה העליונה עם רוחב לעזוב 0.04 "של המשטח המקורי בין שקופיות התחתון ואת חריץ פנימי O-Ring. O-rinGS אדומות סיליקון AS568A, מספר דש 044 עבור החלק העליון 046 עבור בחלק התחתון.

Discussion

מעגל זרימת שלנו קאמרית תזרים לאפשר לנו נושא תאים חסיד, EPCs למשל, מדגיש גזירה מוגדר נוזל. מאז העליון והתחתון הם קאמרית הדבקה שקוף, תא ומורפולוגיה ניתן להעריך גם בזמן אמת, דרך חדר עצמו, או לאחר ניסוי זרימה של פירוק התא זרימה. בשלב זה, התאים ניתן לקצור בתנאים סטריליים או מחדש מצופה, או לאיסוף DNA או RNA שלהם, וכו ', לצורך ניתוח נוסף.

כדי להשיג זרימה למינרית, העיצוב של החדר חייב להיות כזה כי כמה תנאים מתקיימים.

ראשית, חייבת להיות זרימה למינרית, אשר ניתן לאמת באמצעות חישוב מספר ריינולדס שלה (Re), שהוא היחס בין כוחות האינרציה לכוחות צמיג. (אם צמיג כוחות שולטים, Re קטן הזרימה היא למינרית או "מפותחת" - בדרך כלל Re <2300.אם שולטים כוחות אינרציה, הזרימה הופכת יותר ויותר מקרי עד שהוא סוערים, כמו במקרה של Re> 4000.) אנחנו יכולים לחשב מחדש לפי משוואה 3 ^8,

איפה ρ היא צפיפות הנוזל, ש הוא שיעור הזרימה, μ הוא צמיגות, W ו-H הם רוחב וגובה של החדר, בהתאמה, ו-D _h הוא קוטר הידראולי, מוגדר על פי המשוואה 4 ^8,

מספר ריינולדס של לשכות שלושת זרימה, עם גבהים הנעים בין 166-267 מיקרומטר, טווח 13.9-34.6 ברמות ספיקה גalculated להשיג מתח גזירה של 15 dynes / ² ס"מ. ברמות ספיקה מחושב עבור מתח גזירה של 100 dynes / ² ס"מ, מספר ריינולדס החדרים נע בין 90.4-234. כל אלה מספרים ריינולדס נמוכים בהרבה 2300 לפגוש את הקריטריון זרימה למינרית.

שנית, עבור שדה המהירות ואת הלחץ גזירה להיות עצמאיים של המרחק לאורך ערוץ הזרימה (כלומר מפותחת), המרחק בין כניסת הנוזל להחליק חייב להיות יותר אורך הכניסה, _ה L. זה יכול להיות מרוצה על ידי חישוב אורך הכניסה, על פי משוואת 5 ^9.

עבור הערכים שצוינו לעיל, את משך הכניסה נע 0.01-0.25 ס"מ.

שלישית, על מנת להבטיח כי מהירות ומתח גזירה בכיוון לרוחב לא להשתנותמשמעותית מן הערך עבור זרימת חד ממדיות ערוץ (pH Δ / 2L), את היחס H / W חייב להיות הרבה פחות 1. עבור מתח גזירה הממוצע תחת קיר דו מימדי התנאים תזרים להיות 95% הלחץ גזירה הקיר תחת זרימה חד ממדי, H / W צריך להיות שווה ל 0.10, ועל הלחץ גזירה תחת קיר דו מימדי התנאים תזרים להיות 97.5% מן הלחץ גזירה הקיר תחת זרימה חד ממדי, H / W צריך להיות שווה ל 0.05. עם מידות של החדר מעוצב שלנו תזרים 1.7 ס"מ רוחב ו - 166-267 מיקרומטר גובה, קריטריונים אלה מרוצים.

הלחץ ישתנה רק כיוון הזרימה אם לא יהיו הדרגתיים הלחץ לרוחב בכניסה. זה יכול להיות הוערכה באמצעות צבעים או חלקיקים בנתיב הזרימה. יתר על כן, בניסויים זרימה קבועה, dampener דופק מוכנס במעגל הזרימה. Dampener הדופק מוציא את רוב pulsatility הנגרמת על ידי המשאבה רולר במעגל, ומאפשר לנו הנחה משוער של זרימה קבועה. ראוי לציין, dampener הדופק מנוצל צריך להיות תואם עם המשאבה צינורות המשמשים במעגל, כך שהוא יכול לחסל ביעילות פעימות בזרימת פלט עבור תדרים ספציפי של המשאבה הרים. בהפגנה שלנו L / S Masterflex הדופק dampener משיג זרימה למינרית כאשר נעשה שימוש בקו פריקה עם משאבת כל Masterflex L / S הסדרה (0-600 RPMs) ו-I / P 26 צינורות. עבור זרימת pulsatile, משאבה לתכנות יכול לשמש כדי ליצור צורות גל שונים.

עבור זרימת pulsatile, משאבה לתכנות יכול לשמש כדי ליצור צורות גל שונים.

יתר על כן, המעגל תוכנן כך דגימות של perfusate יכול בקלות להיות שנאספו בנקודות זמן שונות מבלי לסכן זיהום של תאים או בינוני לזרום. בדוגמה שלנו, ריכוז של NO ₂ - נמדדה על ידי chemiluminescence עםAnalyzer ionics / זיוורס תחמוצת החנקן (נועה 280, מכשירים זיוורס, Boulder, CO) כפי שתואר קודם לכן ^10. Reductant לניתוח הניטריט היה יודיד אשלגן חומצה אצטית (חומצה אצטית 14.5 M ו 0.05 M KI), אשר יש פוטנציאל הפחתת להמיר הניטריט ל NO אך אינה מספיקה כדי לצמצם כל תחמוצות חנקן גבוהה יותר כגון ניטראט ולכן הוא יחסית ספציפית עבור הניטריט. הניטריט סך המיוצר חושבה כתוצר של ריכוז הפיק את סך היקף המעגל תוך התאמת נפח איבד תוך נטילת דגימות ^6.

השלבים הבאים הם קריטיים עבור ביצוע מוצלח של ניסויים זרימה:

1. רצוי למנוע היווצרות בועה במהלך הזרימה הגדרת, מאז בועות יש פוטנציאל לקרוע תאים מפני השטח שלהם. זה יכול להימנע על ידי מטפלת בעת ביצוע החלק העליון של החדר לזרום על החלק התחתון, שהוא הטוב ביותרלהשיג על ידי שמירה הן מקבילות זו לזו והורדת העליון על התחתון בתנועה אחת ללא הסתגלות. בעשותו כן, בועות אוויר קטנות רשאי להיות נוכח ו / או צף ערוץ זרימה, תופנה לתוך מלכודות בועה על צד אחר של דיור האלומיניום.
2. חשוב להבטיח כי צינורות יצוא של המאגר מגיע לתחתית של המאגר. אחרת, האוויר עלול להישאב לתוך הצינור שמוביל מן המאגר אל תא אם רמת perfusate נופל מעט למטה בסוף צינורות.
3. החוקר צריך להיות מוכר עם כיוון הזרימה את המשאבה כך המשאבה אינה פועלת בטעות על תחילתו של זרימה, אשר תביא האוויר נשאב לתוך המעגל קאמרית בכיוון ההפוך.
4. כדי למנוע היווצרות קצף (עקב חלבונים מפוגל הכלול נסיוב), אנו ממליצים להקטין את צינורות שמובילה מחדר למאגר כדי סנטימטר אחד בערך מעל perfusate רמה בתוך המאגר. עם זאת, שמירה על אותה מעל לרמה בינונית זרימה מאפשר לך לאמת לזרום לתוך המאגר במהלך הניסוי.
5. כאשר הברגה החלקים קאמרית ביחד, חשוב להבין היטב הדיור ביד אחת בזמן הפעלת מברג חשמלי עם היד השנייה. שים לב, את ההצעה של מברג חשמלי תתורגם מומנט אשר יש פוטנציאל 'להשליך את החדר סביב "פעם היא להדק את הבורג.
6. כדי למנוע גלי הלחץ להרכיב במעגל והסרת תאים מעל פני השטח שלהם, להבטיח כי כל והברזים למיניהם פתוחים לפני תחילת הזרימה.
7. במיוחד ללימודי תזרים לטווח ארוך (> 48 שעות) מומלץ להשתמש בצינור יותר וגמיש יותר להיות מוכנס לתוך ראש המשאבה כדי למנוע שבירה של צינורות.
8. יתכן כי צינורות "נודד" בתוך הראש את המשאבה עקב התעללות מותאם לשיניים ראש המשאבה. לכן אנו ממליצים הקדשת תשומת לב כיצד באמבטיהing מאובטח בראש המשאבה וסימון כל קצה הצינורית עם עט סימון כזה כי אתה יכול בקלות להבחין אם בצינור הוא "משך" או וחילצה במהלך הניסוי.
9. תמיד לבדוק היטב כל המחבר היחיד של המעגל קאמרית לפני תחילת זלוף על מנת למנוע דליפה של perfusate במהלך ניסוי בשל חיבור לקוי. זה חשוב במיוחד עבור מחברים יבוא ו יצוא של dampeners הדופק!
10. זכור להגביל את החשיפה לאור, אם אתה משתמש תוויות ניאון.

מגבלה אפשרית של תא תזרים שלנו היא כי גובה נקבע על ידי גובה של ערוץ במכונה לתוך האלומיניום. עם זאת, יש את היתרון של אין צורך לבדוק ולהתאים את גובה של הערוץ לפני כל ניסוי, ולכן מפשט את החישובים מתח גזירה רק על ידי התאמת תזרים המשאבה לערך הרצוי. בהתאם למטרות המחקר שלך, זה יכול להיות רצוילהגביר את הלחץ גזירה מבלי להגדיל את מהירות המשאבה. במקרה זה אנו ממליצים להגדיל את צמיגות של perfusate, למשל הוספת dextran ל ¹¹ בינוני.

מגבלה אפשרית של מעגל הזרימה הוא נפח גדול של שימוש בינוני, אשר יכול להיות בעייתי כאשר מנסים לכמת ריכוזים קטנים מאוד של תאים מטבוליטים. אמנם לא מוצג כאן, ניתן להפחית באופן משמעותי את היקף מעגל באמצעות מאגר קטן dampener הדופק ירידה אורך הצינור וקוטרו.

בנוסף, ישנם מספר מערכות זמינים מסחרית אחרת, שניתן להשתמש בהם כדי להחיל גזירה הלחץ נוזל התאים בתרבית. Microfluidic מערכות מבוססות, כגון מערכת BioFlux מ Fluxion, לאפשר ניתוח סימולטני של תאים שונים ערוצי זרימה microfluidic עמוסה פתרון לתוך צלחות גם מתנהג כמו קלט פלט עבור מאגרים אלו ערוצי ^12,13,14. עם זאת, אלה ואחרים מיקרומערכות fluidic אינם תואמים שקופיות מיקרוסקופ סטנדרטיים אינם מאפשרים התאוששות של מספר גדול מספיק של תאים עבור ניסויים נוספים, כגון RT-PCR או כתם המערבי. יתר על כן, הם פחות ידידותי למשתמש, בעלות מינימלית של 40,000 $ ויכול להגיע סך של יותר מ -100,000 דולר, תלוי בציוד אביזר.

שתי מערכות macrofluidic זמינים הבינלאומי Flexcell Corporation, Streamer Flexcell ומערכות FlexFlow, שימשו בהצלחה מחקר בתאי האנדותל ^15,16,17, האדם תאים annulus ¹⁸ ו - ¹⁹ fibroblasts בתנאים זרימת הנוזל. מערכת שלישית, זמין דרך GlycoTech, נוצל כדי ללמוד הידבקות תאים סרטניים ²⁰ ו הידבקות ליקוציט ²¹ עד monolayers אנדותל.

המערכת מאפשרת Streamer כמה שקופיות להתנהל לפי אותם התנאים הלחץ גזירה בבת אחת, אך חסר חלון צפייה - בניגוד שלנועיצוב - אינו מאפשר הדמיה בזמן אמת של תאים תחת זרם.

מערכת FlexFlow יש חלון הצפייה, אבל דורש מיקרוסקופ זקוף, אשר לא יכול להיות מיקרוסקופ רגיל בשימוש ברוב המעבדות. יתר על כן, מערכת FlexFlow דורש להחליק התא מצופה לכסות להיות הפוך כאשר מציבים לתוך תא הזרימה. זה מונע ויזואליזציה של תאים פלורסנט על משטח אטום, כגון זכוכית מצופה טיטניום, בו אנו מדגימים במחקר שלנו. לבסוף, תלושי לכסות המתמחה צריך לרכוש במיוחד עבור מערכת FlexFlow, אשר בטווח רב אלף דולר את המחיר, בדומה למערכת Streamer Flexcell.

GlycoTech מציעה עגולים ומלבניים, במקביל צלחת לתאי זרימה, אשר באופן משמעותי פחות יקר, אבל מיוצרים אקריליק יצוק כי לא יכול להיות נוח כמו תא גזע autoclaved שלנו. ראוי לציין, חדרי תזרים אחרים תוארו להיות autoclavableנראה מעשי כי הם דורשים עדשות מיקרוסקופיות מיוחדות ^22,23. מערכת GlycoTech מנצל אטמי סיליקון גומי התערבה בין צלחות העליון והתחתון, אשר ישתנה עם עובי השימוש החוזר ולכן שינוי גובה תא לאורך זמן (היצרן ממליץ על רכישת חדשים אחרי כל עשר משתמש). החדר שלנו אלומיניום עם המובנה O-טבעות מאפשר התנגדות מוחלטת של צלחות העליון והתחתון ומבטיח גובה תא מתמיד בין הניסויים. לבסוף, משאבות ואקום נחוצים כדי להשיג חותם דליפה הוכחה בעיצובים קאמרית רבים לזרום, כולל בתאי GlycoTech, אשר אינם נחוצים בעיצוב שלנו.

בעוד לא מוצג כאן, תא הזרימה יכולה להיות כל הזמן תחת מיקרוסקופ במהלך הניסוי תזרים כולו הדמיה בזמן אמת של הידבקות התא ו / או התנהגות. אם זה רצוי, מומלץ להשתמש מנורות חימום או כרית מחוממת תחת חדר כדי לשמור על טמפרטורה perfusate ב 37 ° C. פרווהשם, המשאבה רולר ניתן להחליף משאבת מזרק, אם לא 'recirculation "או של תאים או מטבוליטים או סמים או סוכנים investigational הוא הרצוי ^24.

אפשר גם לזרום תאים שכותרתו שונה על תאים חסיד, טסיות פלורסנט למשל על שכבה של EPCs ומחוברות (באמצעות assay טסיות שתואר על ידי Achneck et al. ^6,25) כדי להעריך את התא אל התא אינטראקציה תחת לחץ גזירה נוזל. תא הזרימה שלנו משלב תכונות של ערך אחרים לתאי תזרים זמין, כגון יציאת דגימה perfusate וחלון הצפייה יש יתרון חשוב של תאימות עם מיקרוסקופ או הפוך או ישר. זה autoclavable מלא ומאפשר ניסויים חוזרים ונשנים בגובה קאמרית קבוע וללא צורך של משאבות ואקום כדי להשיג חותם leakproof.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מוצרים / ריאגנטים	חברה	מוצר #
10 מ"ל מזרק	קול בן הזוג Instrument ושות	07940-12
1-Way Stopcoks	קול בן הזוג Instrument ושות	30600-00
30 מ"ל מזרק	BD רפואי	309650
4-Way והברזים למיניהם	קול בן הזוג Instrument ושות	30600-04
סגסוגת אלומיניום	N / A	6061
תרבית תאים מנות (4-היטב, מלבנית)	Thermo Scientific; Nunc	267061
תא כתום Tracker	Invitrogen	C34551
DMSO	מחקר אורגניקס	2162D
DPBS (-/-)	Invitrogen	14190-144
EGM-2 Singlequots	Lonza	CC-4176
מתאם Luer נקבה	קול בן הזוג Instrument ושות	Si-45500-04
פיברונקטין	סיגמא	F0895-2MG
בקבוק זכוכית (250 מ"ל) עם שווי	קול בן הזוג Instrument ושות	34594-24
קשה Tubing	קול בן הזוג Instrument ושות	06508-16
HBSS	סיגמא	H8264-500ml
Histopaque	סיגמא	H8889-500ml
Hoechst כתמים פתרון	סיגמא	H6024
Hyclone FBS	Thermo Scientific	SH30071.01
L-גלוטמין	Lonza	17-605E
מתאם Luer זכר	קול בן הזוג Instrument ושות	EW-45505-04
MCDB-131, 1X בינוני	Cellgro	15-100-CV
פוליפרופילן צנרת דוקרני	קול בן הזוג Instrument ושות	06365-90
O-טבעות	N / A	AS568A
Pulse-Dampener	קול בן הזוג Instrument ושות	07596-20
Pump-Drive (Masterflex L / S מהירות משתנה כונן הכלכלה)	קול בן הזוג Instrument ושות	7524-40
Pump-Head (Masterflex ראש קל משאבה Load)	קול בן הזוג Instrument ושות	07518-60
שקופית	קול בן הזוג Instrument ושות	48500-00
Soft Tubing	קול בן הזוג Instrument ושות	96400-16
מזרק מסנן	קול בן הזוג Instrument ושות	02915-12
Sytox חומצות גרעין כתם כתום	Invitrogen	S-11368
טריפסין EDTA	Lonza	CC-5012
טריפסין נטרול פתרון	Lonza	CC-5002