ניטור פעילות קינאז ו phosphatase דרך מחזור התא על ידי Ratiometric סריג

Summary

סריג מבוססי הכתבים משמשים יותר ויותר לעקוב אחר פעילות קינאז ו phosphatase בתאים חיים. כאן אנו מתארים שיטה כיצד להשתמש סריג מבוססי עיתונאים כדי להעריך את מחזור התא תלויות שינויים זירחון היעד.

Abstract

פורסטר תהודה העברת אנרגיה (סריג) מבוסס לכתבים ¹ לאפשר הערכה של קינאז אנדוגני ופעילויות phosphatase בתאים חיים. בדיקות אלו בדרך כלל מורכבות של וריאנטים של CFP ו YFP, התערב על ידי רצף phosphorylatable ואת תחום phospho מחייב. לאחר זירחון, השינויים בדיקה הקונפורמציה, שתוצאתה שינוי המרחק או נטייה בין CFP ו YFP, מוביל לשינוי סריג יעילות (איור 1). מספר בדיקות פורסמו בעשור האחרון, מעקב אחר יתרת הפעילות של קינאזות ו phosphatases מרובות, כולל כתבים של ² PKA, PKB ^{3, 4} PKC, PKD ^{5, 6} ERK, JNK ^7, CDK ^18, אורורה B ⁹ ו ⁹ Plk1 . בהתחשב עיצוב מודולרי, בדיקות נוספות צפויות לצאת ב ¹⁰ בעתיד הקרוב.

התקדמות דרך מחזור התא מושפע מתח signaling ¹¹ מסלולים. יש לציין, מחזור התא מוסדר באופן שונה במהלך שאנן צמיחה לעומת כאשר התאים הם מחלים מתח ^12. זמן לשגות הדמיה של התאים דרך מחזור התא ולכן מחייב זהירות מיוחדת. זה הופך לבעיה במיוחד כאשר העסקת הדמיה ratiometric, שכן שתי תמונות עם האות גבוה יחס רעש נדרשים לפרש את התוצאות. Ratiometric סריג הדמיה של מחזור התא משתנה תלוי בפעילות קינאז ו phosphatase יש ברובה הוגבלה סעיפים קטנים של מחזור התא ^8,9,13,14.

כאן, אנו דנים בשיטה כדי לפקח על סריג מבוססי בדיקות הדמיה באמצעות ratiometric לאורך מחזור התא האנושי. השיטה מסתמכת על הציוד העומד לרשות חוקרים רבים במדעי החיים ואינו דורש ידע מומחה של מיקרוסקופיה או עיבוד תמונה.

Protocol

1. הצגת בדיקה לתאי

1. Co-transfect תאים עם סריג בדיקה מבוססות לבין פלסמיד המקנה עמידות. בחר שיטת transfection כי הוא יעיל בסוג התא העניין שלך. עבור תאים U2OS, רמת סידן פוספט שיטות transfection לתת תוצאות נאות ^15.
2. בחר תאים אנטיביוטיקה המתאימה לפחות שבעה ימים. זה מעשיר את כמות התאים המבטאים את בדיקה מגביל את כמות התאים עם רמות ביטוי רעיל, או רמות ביטוי חמור להשפיע על מחזור התא.
3. (אופציונלי) בחר עבור שיבוטים יציב.
4. שימוש בתאי קבוע או לחיות, ודא כי הן CFP ו YFP נמצאים בכל התאים ביחס בקירוב.
5. במקרה תאים מסוימים מכילים רק CFP או YFP, רקומבינציה אירעה סביר. רקומבינציה יכולה להתרחש גם במהלך התפתחות חיידקים או אחרי transfection של החללית והוא רשאי במקרה האחרון תלוי באיכות פלסמיד. חזור p פלסמידפיצוי ו linearize הפלסמיד לפני transfection אם הבעיה נמשכת.

2. Ratiometric ניטור סריג

1. זרעים תאים בתחתית צלחות זכוכית, או תלושי כיסוי הרכבה בתא. ודא כי מנות / תלושי לכסות אינם 1.5 (170 מיקרומטר עבה).
2. הר תאים בינוני צמיחה ללא פנול אדום על מיקרוסקופ epifluorescence ממונע עם בקרת טמפרטורה מוגדר 37 ° C. ודא תקנה pH של התקשורת, או על ידי ה-CO ₂ או באמצעות ה-CO ₂ עצמאית מדיה כגון לייבוביץ-15.
3. פוקוס על תאים באמצעות האור המועבר. אל תסתכל על תאים באמצעות אור ניאון.
4. התחל על ידי רכישת תמונה 12 או 16 ביט באמצעות עירור YFP (YFPex) ו YFP פליטה (YFPem) מסננים מראה dichroic מתאים. השתמש binning מקסימלי זמין עדיין מאפשר רזולוציה subcellular הנדרש. שימוש binning גבוהה כדי להקטין זמן חשיפה או אינטנסיביות חיונית כדי למנוע phototoxicity.
5. ליasure או להעריך את עוצמת רקע הרעש המשוער על ידי מדידת או הערכת ממוצע גס, מינימום ערכי הפיקסלים המרבית באזור נטול תאים. שינוי זמן החשיפה ומסננים צפיפות ניטרלי, כך האות הממוצע בתא הוא כ עוצמת הרקע פלוס חמש עד עשר פעמים את ההבדל בין מקס בעוצמות דקות רקע.
6. ודא כי התמונות לא קרובים להיות רווי. העוצמה המקסימלית של התמונה צריך להיות פחות ממחצית של טווח דינמי (למשל מקסימום 2000 בתמונת 12 ביט), כדי לאפשר ההבדלים בעוצמה כאשר תאים להיכנס מיטוזה.
7. חזור על שלב 2.4-2.6 באמצעות עירור ופליטה CFP מסננים YFP ומראה dichroic מתאים.
8. בחר באזורים מרובים עם תאים transfected, למעט באזורים המשמשים נקודת 2.4-2.7, ולוודא כי העוצמה המקסימלית היא פחות ממחצית הטווח הדינמי בכל התאים.
9. התחל ניסוי זמן לשגות רכישת שתי תמונות כל 45 דקות באמצעות YFPex - YFPem ו CFPex - YFPem קובע הסינון.

3. אימות וייעול התנאים

1. פתח את התמונות רכשה ולנטר את מחזור התא בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה של תאים המבטאים את החללית transfected.
2. השוואת מחזור נמדד זמן תא לנתונים שפורסמו עבור סוג תא בשימוש. לחילופין, סרט untransfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) בכל שעה כדי לקבל תא התייחסות זמני המחזור.
3. במקרה של זמן עד מיטוזה מיטוזה מתאים התייחסות תזמוני מחזור התא, המשך לשלב 4. לחלופין, לרכוש מחדש תמונות באמצעות חשיפה קשה יותר, יותר זמן או נקודות מרובות Z-רמות וחזור על שלב 3.
4. במקרה בזמן מן מיטוזה כדי מיטוזה לא מתאימות התייחסות מחזור תזמוני התא, הסרט transfected תאים באמצעות רכישת תמונה אחת של אור מועבר רק (DIC למשל או שלב בניגוד) כל שעה ואחריו תמונה אחת בסוףהניסוי כדי לזהות תאים transfected.
5. אם התאים transfected עדיין להראות פעמים מחזור התא יותר, חזור על שלב 1 אבל transfect בדיקה פחות או לבחור עבור שיבוטים יציב המכילים כמויות נמוכות מאוד של בדיקה.
6. אם התאים transfected להראות נורמלי מחזור התא פעמים בהעדר אור ניאון, חזור על שלב 2 אבל חשיפה נמוכה יותר על ידי שינוי binning, מסננים צפיפות ניטרלי, זמן חשיפה, זמן בין תמונות.

4. ניתוח סריג

1. הניתוח יכול להתבצע על ידי רוב התוכנות המוקדש במיקרוסקופ. כאן אנו מתארים כיצד לבצע את הניתוח באמצעות ImageJ freeware ( http://rsb.info.nih.gov/ij ) ניצול יחס תוסף פלוס ( http://imagej.nih.gov/ij/plugins/ratio-plus . html ).
2. פתח את התמונות ImageJ. בכל מקרה התמונות שלך הן בפורמט של stac ססגוניותk (למשל DeltaVision), להפריד את הערוצים הנפרדים על ידי הראשון הפיכתם hyperstack: Image-hyperstack מחסנית ל hyperstack ולאחר מכן לפצל אותם ערימות ערוץ אחד באמצעות: Image-hyperstack-להפחית ממדיות
3. הכפלת YFPex - מחסנית YFPem עם 3 באמצעות: Process-Math-הכפל שלב זה הוא אופציונלי, שכן הוא נועד אך ורק כדי להגביר את בהירות הראייה של התמונות על ידי הקפדה יחסי אינם בטווח בין 0 ל -1.
4. ב YFPex - מחסנית YFPem, צייר באזור של עניין (ROI) באזור כי הוא נטול תאים, אבל זה קרוב לתא כדי להימדד. תאים שונים באותה תמונה עשויה לדרוש באזורים שונים, כמו גם הרקע ועוצמת אות הוא בדרך כלל החזק במרכז התמונה.
5. מוסיפים את ההחזר על ההשקעה ROI אל מנהל: Analyze-tools-ROI מנהל.
6. למדוד את העוצמה הממוצעת של ההחזר על ההשקעה הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem: Analyze-מדוד .
7. חזור על timepoints מרובים לוודא כי בעוצמות רקע קרוב לתא עניין דומים לאורך כל הסרט.
8. סט מדידות לכלול בעוצמה מינימלית: Analyze-Set-Min מידות וערך מקס אפור.
9. צייר אזור של אינטרס המכסים את רוב התא ולמדוד את עוצמת מינימלי הן YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. קח את ההבדל בין עוצמת מינימלי נמדד עוצמת הרקע 4.6 ומחלקים אותו על ידי שני. זה מספק הערכה מוצא ערך גזיר.
10. יחס פתוח פלוס. בחר את YFPex - YFPem ואת CFPex - מחסנית YFPem. עבור סריג יחס, בחר CFPex - YFPem כמו מחסנית 1, עבור סריג יחס הפוך בדיקות הדמיה שבו סריג פוחתת יעילות על זירחון, בחר YFPex - YFPem כמו ערימה 1.
11. הכנס את עוצמות רקע נמדד בערכים גזיר.
12. הגדר את קנה המידה של מחסנית יחס וכתוצאה מכך ולהחיל u נראים מתאימיםp טבלה (LUT) כדי לחזות שינויים יחס.

5. נציג תוצאות

Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. איור 3 מציג ניסוי באמצעות הגדרות phototoxicity מינימלי כמתואר בסעיף 2. שים לב כי זוהי תוצאה ראשונית נציג וכי התנאים חשיפה או הזמן בין דמויות יכולות להיות משונות כדי להגדיל את יחס אות לרעש או רזולוציה טמפורלית. איור 3D מראה כי רוב התאים המבטאים את החללית להתרבות עם זמן מחזור של תא בין 20 ל 25 שעות, המציין את התנאים הדמיה רמות הביטוי של החללית אינם משפיעים על תזמון מחזור התא. למרות שיש רעש רב, את המגמה של הגדלת הפעילות Plk1 G2 ו peaking ב מיטוזה ¹⁴ נראה בבירור (איור 3A). עיבוד הנתונים הגולמיים, כאן על ידי מתכוון סינון כפי שהוצגו רשם גלים (איור 3B), או כימות של ra הפוך הממוצע טיו (תאנה 3C) יכול לשפר את הבהירות.

באיור 1. עקרון בדיקה סריג מבוסס לפקח פעילות קינאז ו phosphatase. שני fluorophores, בדרך כלל CFP (כחול) YFP (ירוק), מחוברים על ידי תחום phospho מחייבים (כתום) רצף phosphorylatable (צהוב). (אדום) זירחון מתווכת מחייב תחום phospho מחייב, ובכך גרימת שינוי קונפורמציה החללית. השינוי בתוצאות קונפורמציה הבדל במרחק או נטייה בין שני fluorophores, אשר משפיע על היעילות בין סריג CFP ו YFP. סריג ניתן דמיינו ידי CFP מרגש וניטור YFP פליטה (קווים מקווקווים).

באיור 2. המתאר סכמטי של הליך ניסיוני.

p_upload/3410/3410fig3.jpg "/>
באיור 3. Plk1 הפעילות הגלויה הראשונה בגרעין בשלב ופסגות G2 במהלך מיטוזה. תאים U2OS להביע סריג מבוססי ניטור בדיקה Plk1 פעילות ^9,14 צולמו במשך 60 שעות באמצעות מערכת דימות Spectris DeltaVision מצויד מטרה 20x 0.7 אוויר NA ומנורת כספית. תנאי ההדמיה נבחרו כדי לגרום phototoxicity מינימלי, כפי שמתואר בסעיף 2, באמצעות binning 4x ומסננים צפיפות ניטרלי כי 99% בלוק של האור הנכנס. צבע, מצג שווא של יחס הפוך סריג, בעקבות תא אחד באמצעות 4 חטיבות. ב ', רשם גלים של התא מוצג לאחר החלת מסנן מתכוון. C, כימות של יחס הפוך סריג של התא מוצג א 'ד', כניסה mitotic מצטברת של 50 סריג, בדיקה תאים להביע, כולל חטיבות של לתאי הבת.

Discussion

ניטור סריג לאורך מחזור התא דורש השיקולים הם קריטיים פחות כאשר מעריכים לטווח קצר תגובות לגירויים חיצוניים. ראשית, התקדמות מחזור התא בקלות מוטרד איתות מתח, המחייב phototoxicity היא למינימום. שנית, כל הכתבים עלולה להשפיע על תהליכים תאיים על ידי titrating החוצה קינאזות, phosphatases או ת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
מגיב	מספר קטלוגי	חברה
ליבוביץ L-15, לא פנול אדום	21083-027	GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות
DMEM + Glutamax-I	31966	GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות
עוברית שור סרום (FBS)	SV30160.03	HyClone
0.05% טריפסין EDTA	SH30236.01	HyClone
פניצילין, סטרפטומיצין	SV30010	HyClone
DPBS	14287	GIBCO, על ידי החיים טכנולוגיות
Puromycin	P8833	Sigma-Aldrich