שרירי השלד מין Dimorphism מ Proteomics

Summary

קבוצת ישר קדימה שיטות לבודד לקבוע את זהותו של החלבונים הנפוץ ביותר בא לידי ביטוי בשרירי השלד. אודות 800 נקודות הם להבחין על ג'ל דו מימדי של השריר 10 מ"ג; זה מאפשר להגדרה של ביטוי המגדר חלבון ספציפי. שיטות אלה ייתן תוצאות המקבילה רוב הרקמות.

Abstract

התכווצות שרירי השלד הגולמי נקבעת בעיקר על ידי מספר קטן יחסית של חלבונים התכווצות, אך רקמה זו גם וישימה להפליא גורמים סביבתיים כגון ¹ היפרטרופיה על ידי תרגילי התנגדות וניוון של חוסר שימוש. זה ובכך מפגין שיפוץ והתאמות ללחצים (חום, איסכמיה, מתכות כבדות וכו '.) ^2,3. נזק עלול להיגרם לשרירים על ידי כוח השריר מתארך תוך כדי הפעלת, ⁴ שנקרא כיווץ אקסצנטרי. חלבונים התכווצות ניתן נפגע מאמצים כאלה צריכים לתקן, מושפל ו / או resynthesized; פונקציות אלה אינם חלק של חלבונים התכווצות, אך שפע של חלבונים הרבה פחות אחרים בתא. כדי לקבוע מה משנה של חלבונים מעורב שיפור של סוג זה של נזק, proteome גלובלי חייב להיות שהוקמו לפני תרגיל ⁵ ואחר כך המשכתי לאחר התרגיל כדי לקבוע את ההפרשביטוי החלבון ובכך לסמן חלבונים מועמד ההתאמות נזק ותיקון שלה. יתר על כן, רוב המחקרים של שרירי השלד נערכו על הזכר של המין ולכן לא יכול להיות נציג של שריר נשית.

במאמר זה אנו מציגים שיטה להפקת חלבונים מהשרירים reproducibly זכר ונקבה, ומפריד אותם על ידי אלקטרופורזה דו מימדי ג'ל ואחריו ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית ^6. פרוטוקול זה מספק עבור כתמים (חלבונים המזוהים לאחר מכן), כי להראות מובהקות סטטיסטית (p <0.05) כפולה להגדיל או להקטין, להופיע או להיעלם מן המדינה שליטה. אלה נכרת אז מתעכל עם טריפסין ו מופרדים על ידי כרומטוגרפיה נוזלית בלחץ גבוה מצמידים את ספקטרומטר מסה (LC / MS) לזיהוי חלבון (LC / MS / MS) ^5. מתודולוגיה זו (איור 1) ניתן להשתמש ברקמות רבות עם קצת שינוי לא (כבד, מוח, לשמועלא וכו '.).

Protocol

1. לדוגמה הכנה

1. השתמש רקמה טרי, קפוא או פלאש RNAlater שטופלו מעכברים כמו חומר המוצא. כתם הרחק מכל משמר עם עודף Kimwipe לפני שתמשיך.
2. הסר את כל הגיד fascia סביב השריר ואת רקמת בשר טחון עם סכיני גילוח חד פיפיות עבור 2 דקות על צלחות זכוכית קר בחדר קר (4 מעלות צלזיוס) עד הרקמה טחון היטב או אבקתי. איסוף המדגם בצינור טרום שקל microfuge ולקבוע את המשקל של הרקמה. שימוש לא יותר מאשר 10 מ"ג של הרקמה כחומר המוצא שלך.
3. הוסף חוצץ מיצוי μL 45 (8 מ אוריאה, 50 מ"מ DTT, בחורים 4%, ampholytes המוביל 0.2% 5 / 8, 0.0002% bromophenol כחול) לכל רקמות 1 מ"ג טחון, בטמפרטורת החדר. אם נפח גדול מ 350 μL, להוסיף 350 μL בתחילה homogenize (שלב 1.4), ולאחר מכן להוסיף את שאר למאגר כדי למזער את התזה.
4. Homogenize רקמת שבע פעמים עם העלי ממונע (Kontes קורפ) למשך 15 שניות בכל4 ° C, עם שתי דקות קירור על הקרח בין homogenization כל אחד.
5. צנטריפוגה דגימות XG 15,600 במשך 30 דקות 4 ° C. שמור את supernatant ולמדוד את נפחו. פסולת התא גלולה נמחקת.
6. לזרז את החלבונים עם supernatant קר כקרח אצטון מגיב כיתה (3 פעמים v: יחס v). וורטקס צינורות למשך 15 שניות. צנטריפוגה עבור XG 15,600 למשך 10 שניות כדי ליצור כדורי, ו resuspend במאגר מיצוי עם מנוע Kontes ומוטות פוליפרופילן ערבוב (BioSpec Prod)
7. חזור על שלב 1.6.
8. או להמשיך עם הערכה חלבון ריכוז של דגימות או לאחסן אותם ב -20 ° C.

2. ריכוז חלבון אמידה

השתמש assay לורי ⁷ או ⁸ assay BCA (פירס), לכוון על 4.5 מ"ג ^-1 מ"ל.

3. Isoelectric התמקדות

1. הסר רצועה ReadyStrip IPG (11 ס"מ, pH 5-8, Bio-Rad)מ -20 ° C ולאפשר לו לאזן ב RT עבור 10-15 דקות.
2. וורטקס המדגם פיפטה 600-800 מיקרוגרם (הנפח הכולל 200 μL) מדגם חלבון בקו ישר בקצה האחורי של ערוץ במגש התייבשות מדגם, והשאיר על 1 ס"מ בכל צד.
3. בעזרת מלקחיים, לקלף את כיסוי הפלסטיק של רצועת IPG ​​- לוודא לטפל רק את הקצוות של רצועת ולהימנע מכל מגע עם הג'ל. הערה סוף הבסיסיים של הרצועה ומקם אותה בצד שמאל של המגש. מניחים את רצועת IPG ​​ג'ל בצד למטה על גבי המדגם, למנוע השמנה בועות מתחת. אפשר אותו רעננותם במשך שעה אחת.
4. שכבת עם שמן מינרלי 2.5 מ"ל (BioRad). מכסים את המגש עם המכסה, ולהשאיר את רעננותם הלילה בטמפרטורת החדר.
5. מניחים נייר פתילה בשני הקצוות של ערוץ מגש התמקדות ורטוב כל אחד עם מים 10 Millipore μL.
6. קח את IPG ​​רצועה ארוכה אנכית למשך כ -10 שניות בריחת הנפט. כתם ב מפלסטיקacking עם Kimwipe.
7. הנח את הצד IPG ג'ל להתפשט ועם סיום בסיסי שמאלה במגש התמקדות. מכסים את רצועת בשמן מינרלי 2.5 מ"ל.
8. מניחים את המגש לתוך התא פושט צורה ולובש צורה IEF (Bio-Rad) תוכנית פרוטוקול 3-צעד (טבלה 1) בטמפרטורת ברירת המחדל של תא 20 ° C, זרם מרבי של 50 μA / רצועה, ואין זמן התייבשות.

   	מתח	זמן	וולט שעות	כבש
   שלב 1	250	20 דקות		שורתי
   שלב 2	8000	2.5 שעות		שורתי
   שלב 3	8000		40,000	מהיר
   סך הכל		6.5 שעות	40,000

   טבלה 1. שלושה שלבים פרוטוקול של התא IEF פושט צורה ולובש צורה של 11 ס"מ IPG רצועות.

9. קח את רצועות IPG ​​מחוץ לתא IEF באמצעות מלקחיים. כתם גיבוי פלסטיק עם Kimwipe ובמקום הג'ל IPG צד רצועה בתוך מגש התייבשות נקי. ניתן לכסות את מגש התייבשות ולעטוף אותו עם ניילון לעטוף חנות ב - 80 ° C או להמשיך.

4. ג'ל SDS אלקטרופורזה polyacrylamide

1. מעבירים את רצועה (בצד את ג'ל) לתוך מגש 11 ס"מ איזון.
2. הוסף 4 מ"ל של חיץ הפחתה (6 מ אוריאה, 2% SDS, 0.05 מ 'טריס / HCl pH 8.8, גליצרול 20%, DTT 2%) לערוץ ו לאזן את הרצועה במשך 10 דקות עם רעד קל.
3. הסר את חוצץ צמצום, להוסיף 4 מ"ל של חיץ אלקילציה (6 מ אוריאה, 2% SDS, 0.05 מ 'טריס / HCl pH 8.8, גליצרול 20%, 2.5% iodoacetamide) ו לאזן את הרצועה במשך 10 דקות עם רעד קל.
4. יש לשטוף את רצועת IPG ​​על ידי טבילה strip בקצרה חיץ 1 SDS X רץ (25 מ"מ טריס, 192 mM גליצין, 0.1% SDS, pH 8.2).
5. הנח את צד ג 'רצועה עד לצלחת האחורי של 11 ס"מ קריטריון מראש להטיל 10.5% -14% טריס-HCl ג'ל SDS polyacrylamide (Bio-Rad) ולדחוף אותו בעדינות כך שהוא יוצר קשר מלא עם ג'ל SDS; לוודא שאין בועות לכודות בין שני משטחים ג'ל.
6. כיסוי רצועת IPG ​​עם 1 מ"ל של תמיסת agarose מותכת (0.5% agarose, 25 מ"מ טריס, 192 mM גליצין, 0.1% SDS, bromophenol כחול) ולתת agarose לגבש במשך 5 דקות.
7. טען 5 μL של הסמן חלבון 10-225 kDa (USB, P / N: 76740) אל תוך הבאר יחיד כמו סטנדרטים משקל מולקולרי.
8. הפעל את ג'ל SDS חיץ (25 מ"מ טריס, 192 mM גליצין, 0.1% SDS, pH 8.2) בשעה V 200 בטמפרטורת החדר או בחדר קר (4 ° C) באמצעות חזית bromophenol כחול הגירה צבע לפקח על אלקטרופורזה.
9. הסר את הג'ל של השחקנים פלסטיק כתם לילה ידי רועדות בעדינות Coomassie בריליאנט בלוR-250 הכתם (45.5% מתנול, 45.5% dH2O, חומצה אצטית 9.0%, 0.25% Coomassie בריליאנט בלו R-250).
10. לנער את הג'ל בתמיסה 1 Destain (45.5% מתנול, 45.5% DH ₂ O, חומצה אצטית 9.0%) פעמיים במשך 3 שעות כל אחד ב Destain 2 (מתנול 5%, 90% DH ₂ O, חומצה אצטית 5%) למשך הלילה. חנות ג'ל חומצה אצטית 7% לניתוח.

5. ג'ל הדמיה וניתוח

1. צלמו תמונות של ג'לים באמצעות תוכנה אחת כמות תוכנית המפעילה את מערכת הדמיה VersaDoc (BioRad). חתוך את התמונה אזורים אחיד לכל ג'לים בניסוי.
2. טען את התמונות קצוץ על התוכנית 8.0 PDQuest תוכנה ליצירת מערכת הניסוי. עקוב אחר אשף ההתקנה ניסוי להגדיר את הפרמטרים לזיהוי ספוט מקום תואמים ברחבי הג'לים. בדוק לחדד את הנקודה תוצאות ההתאמה באופן ידני במידת הצורך.
3. ביצוע ניתוח כמותי סטטיסטי של ג'לים כדי לזהות כתמי חלבון מתאימים עם twהבדלים משמעותיים סטטיסטית o פי או יותר בביטוי בין שתי הקבוצות ג'ל. יצירת מערכת ניתוח עם אלה כתמים של עניין לחתוך אותם החוצה באמצעות נקודה EXQuest חותך (BioRad) לעיכול טריפסין ו LC-MS מבוססי זיהוי חלבון.

6. In-ג'ל tryptic העיכול

במשך שלב זה פירס שונה ב-Gel Tryptic Digest Kit (# 89871X, פירס) שימוש בפרוטוקול.

1. הוספת 200 μL של פתרון destaining (25 mM אמוניום ביקרבונט, אצטוניטריל 50%) את המצתים ג'ל. וורטקס ו דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות עם רעד. מוציאים בזהירות וזורקים את הפתרון.
2. חזור על שלב 6.1.
3. הוסף 30 μL של חיץ הפחתת מוכן טרי (50 mM טריס [2-carboxyethyl] phosphine, אמוניום ביקרבונט 22.5 mM) על צינורות המכילים את אטמי ג'ל לדגור על 60 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
4. אפשר דגימות להתקרר, ואז להסיר ולסלק את מאגר צמצום.
5. הוסף 30 μL של חיץ אלקילציה (100 iodoacetamide מ"מ, 20 אמוניום ביקרבונט מ"מ, מוכנים מיד לפני השימוש ב עטוף בנייר אלומיניום צינורות. דגירה דגימות בחושך בטמפרטורת החדר במשך שעה 1.
6. הסר לבטל את החיץ אלקילציה. שטפו את אטמי ג'ל על ידי הוספת 200 μL של destaining פתרון צינור אחד. דגירה דגימות ב 37 מעלות צלזיוס במשך 15 דקות.
7. הסר וזורקים את הפתרון destaining וחזור על לשטוף.
8. הוסף 50 μL של אצטוניטריל את אטמי ג'ל דגירה אותם במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר כדי לאפשר להם להתכווץ יבש, אז בזהירות להסיר את אצטוניטריל.
9. 6.8 חזור על צעד פעם נוספת. חתיכות ג'ל צריך להיראות לבן קטן.
10. אפשר חתיכות ג'ל לייבוש מרוכז Centrivap (Labconco, דגם EX1245) במשך 10 דקות.
11. יופי את חתיכות ג'ל על ידי הוספת 10 μL של פתרון טריפסין פעיל (10 טריפסין ng / μL, אמוניום ביקרבונט 25 mM). דגירה בטמפרטורת החדר למשך 15 מ 'inutes.
12. הוסף 25 חיץ העיכול μL (25 אמוניום ביקרבונט mM) על צינורות. דגירה דגימות בטמפרטורת החדר לילה עם רעד.
13. Sonicate את הדגימות למשך 10 דקות (ברנסון, sonicator אמבטיה דגם 2510) ו ספין אותם לפני הסרת supernatant לצינור טריים. שמור את supernatant.
14. כדי להמשיך לחלץ פפטידים, להוסיף 10 μL של חומצה פורמית 0.1% ו דגירה במשך 5 דקות בטמפרטורת החדר עם רעד. Sonicate את הדגימות למשך 10 דקות, לאסוף את supernatant ולשלב עם supernatant ששמרת בשלב 6.13.

7. Desalting Microscale של תמציות פפטיד

1. הסר אמוניום ביקרבונט ומלחים אחרים תמציות פפטיד בעזרת PepClean C-18 עמודות ספין (ThermoFisher) בהתאם להוראות היצרן.
2. פפטידים Elute פעמיים עם אצטוניטריל 20 70% μL, להתאדות דגימות יבש על ידי צנטריפוגה ב מרוכז Centrivap שעה 1 ו resuspendפפטידים של חומצה פורמית μL 10 0.1% לניתוח MS.

8. חלבון זיהוי על ידי HPLC מצמידים ספקטרומטריית מסה

1. ΜL נפרדת 5 של תערובת הפפטיד על נוזל ביצועים גבוהים כרומטוגרף (HPLC) מעל 40 דקות, באמצעות שיפוע ליניארית אצטוניטריל 2-50% עם חומצה פורמית 0.2% על טור Pepswift PS-DVB מונוליטי (Dionex) מצמידים את Nanospray אני מקור על ספקטרומטר מסה מלכודת יונים (LCQ Deca XP מקס, תרמו פישר סיינטיפיק) בקצב זרימה של 400 דקות / NL בקצה.
2. זיהוי הפפטיד MS1 אותות בין 400-1400 מ '/ z ולאפשר עבור 3 פסגות יון אינטנסיבי ביותר כדי להיות מבודד עבור סידור MS2 ידי CID עם הדרה דינמי.
3. עבור זיהוי חלבונים, לנתח את התוצאות הפפטיד באמצעות חיפוש באתר עכבר Sequest הפניה (BioWorks תוכנה, תרמו פישר סיינטיפיק-) עם שינוי ציסטאין סטטי alkylated ושינויים דינמיים עבור זרחון (סרין, תראונין, טירוזין), methylation (היסטידין), חמצון (מתיונין), ADP-ribosylation (ארגינין), ו - N-מסוף acetylation. החלת קריטריונים תואמים שמרני (לדוגמא, סובלנות פפטיד מוגדר 2 האמו ו 1.00 סובלנות שבר, חלבונים להכיל לפחות 2 פפטידים עובר לעומת מדינת Xcorr טעינת מסנן [z = 1 / x = 1.5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00] ו הסתברות של p <0.05) ⁵ באופן ידני לבדוק את ספקטרום MS לזיהוי חלבון בטוח.

9. נציג תוצאות:

זכר ונקבה אינם יודעים תנועה, שרירי השלד Murine (brachii שריר הזרוע) הופק ומופרד לתוך דו מימדי המפה ^5, את הרמה הראשונה של השריר השוואתית proteome (איור 2). לאחר דמיינו באמצעות ברזולוציה גבוהה הדמיה דיגיטלית; על 800 נקודות חלבון התגלו כל אחד. השימוש במפת proteome זכר כבסיס, ברור כי ישנם כתמים רבים לשנות בשפע proteome הנשי. עוצמות במקום הם צעדים של שינוי בכמויות חלבון (איור 3). זהויות של כתמים חלבון לשנות יותר כפולה (למעלה או למטה) והם משמעותיים מבחינה סטטיסטית (p <0.05) עם n = 5 עכברים, נקבעים על ידי ניתוח רצף חומצות אמיניות באמצעות ספקטרומטריית כרומטוגרפיה נוזלית מצמידים המונית. תוצאות אלו מראות כי נשים להפגין ירידה שפע האנרגיה אנזימים במטבוליזם הסוכר ועל האנזים קריאטין קינאז (CK) isoforms, אנרגיה שונה אספקת מערכת השרירים. שני בני אדם ובעלי חיים גבוהה יותר להציג זכר בסרום רמות CK במנוחה התרגיל הבא ^9,10, אך רמות CK בדם לא בהכרח תואמים עם כמות של שיבוש myofibrillar ^11,12. זה dimorphism מין בשפע הסלולר של CK בשריר שרירי Murine brachii הוא רומן finding5 ועלול התשובה שונה פיזיולוגית רמות CK בדם.

דמויות:

g1.jpg "/>
באיור 1. סכמטית הכוללת של הפרוטוקול עבור proteomics השוואתי. הפרוטוקול מחולק לשלוש קבוצות: הכנת המדגם: ניתוח מדגם וכן, זיהוי חלבונים. הקצוות של כל אלה שלוש קבוצות של פרוטוקולים גם במקומות השהיית סביר, אם כי את התוצאות הטובות ביותר הם צבר אם פרוטוקול הכולל מתבצעת מבלי לעצור.

באיור 2. השוואה של חלבון שרירי הנשי Murine brachii כתמים יחסית נקודות זהה brachii שריר הזרוע הגברית (ירוק חוגים o). כתמים כי עלה גדול או שווה ל כפול אצל נקבות הם הקיפו אדום (טו) ואלה ירדו פחות או שווה ל כפולה הם הקיפו כחול (טו).

איור 3 ספוט ג'ל אינטנסיביות ניתוח:. ציר ה-X, נקבהלפני פעילות גופנית (שליטה, n = 5); ציר Y, ​​יחיד נקבה התקף 0 הקבוצה נקודה hr זמן (n = 5). קו רגרסיה: מקדם המתאם = 0.919; מדרון = 0.976; ליירט = -0.0293. נקודות מעל לקו האדום מתחת לקו הכחול לשנות יותר מ + / - כפולה.

Discussion

LC / MS proteomics השיטה המוצגת כאן הוא פרוטוקול אמין ביותר לשחזור לניתוח מהיר של הרמה הראשונה של proteome שרירי השלד. זה מאפשר השוואה אמצעי סביר הספציפיות המינים. שפע חלבונים נמוכה ידרוש חלוקה של המדגם שרירים כדי להסיר כמה שיותר את החלבונים כויץ ככל האפשר, ובכך להגדיל את שפע חלבונים נמוך. חייטות פרופיל proteome יכול להיות מושלם עם רצועות שונות בטווח pH IPG ו חלופי צבע ג'ל אחוז אם תרצה בכך. הכתמים ניאון רגיש עוד קיים, אך אנו ממליצים כי כל מעבדה לקבוע את הליניאריות של כתמים אלה במערכת שלך. לצורך ניתוח קפדני יותר של ביטוי החלבון מערכת DIGE (דו מימדי ב-ג'ל אלקטרופורזה המערכת, GE Healthcare מדעי החיים) יכול לשמש אך זה אינו מוסיף לרמת המורכבות למתודולוגיה. יתר על כן, פרוטוקול המתואר במסמך ניתן להשתמש עם ani ביותרmal הרקמות אשר כבר רצף הגנום, כמו גם רצף דה נובו של חלבון מכל מקור שהוא, כל עוד זה ניתן לפתור על ג'ל דו מימדי, שכן שברי האנזימטית חופפים ניתן להפיק באמצעות אנזימים טוהר גבוהה בנוסף כדי טריפסין. דוגמאות ממקורות רקמות אחרות עשויות לדרוש שינויים המתודולוגיה מיצוי, במיוחד אם מחפשים חלבונים בממברנה ו הידרופובי, לעומת זאת, היו לנו תוצאות טובות באמצעות פרוטוקול זה עם לב, כבד, כליות ורקמות במוח. אחרים שלאחר translational שינויים עשויים להיות מזוהים על ידי שינוי בבסיס הנתונים מסה ספקטרום קריטריון החיפוש. לסיכום, הצגנו פרוטוקול ראשוני מפורט סביר לניתוח פרופיל proteome.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם מגיב	סוג	חברה	מספר קטלוגי	תגובות
PepClean C-18 Spin עמודות	מתכלים	ThermoFisher מדעי	PI-89870
מונוליטי Pepswift עמודה (100um x 5 ס"מ)	מתכלים	Dionex	162348
קריטריון מראש יצוק 10.5% -14% טריס HCl-SDS polyacrylamide ג'לים	מתכלים	BioRad	345-0106
Readystrip רצועות IPG	מתכלים	BioRad	משתנה ה-pH טווחי
חומצה אצטית	מגיב	פישר סיינטיפיק	A465-1
אצטון	מגיב	Pharmco	329000
אצטוניטריל	מגיב	פישר סיינטיפיק	A955
garose	מגיב	BioRad	163-2111	כיסוי פתרון
אמוניום ביקרבונט	מגיב	Fluka	40867
Bromophenol כחול	מגיב	פישר סיינטיפיק	BP114
Bio-Lyte Ampholytes	מגיב	BioRad		משתנה ה-pH טווחי
בחורים	מגיב	USB	13361
Commassie כחול R-250	מגיב	ThermoFisher מדעי	20278
Dithiothreitol (DTT)	מגיב	USB	15395
חומצה פורמית	מגיב	ThermoFisher מדעי	28905
גליצרול	מגיב	Sigma-Aldrich	G6279
גליצין	מגיב	USB	16407
Iodoacetamide	מגיב	Sigma-Aldrich	I6125
מתנול	מגיב	פישר סיינטיפיק	A452
שמן מינרלי	מגיב	BioRad	163-2129
Dodecyl נתרן גופרתי	מגיב	Sigma-Aldrich	L6026
טריס בסיס	מגיב	Sigma-Aldrich	93349
טריס [2-carboexyethyl] phosphine	מגיב	ThermoFisher מדעי	77720
טריפסין Endoproteinase, TPCK מטופלים, MS כיתה	מגיב	לנקב	90055	שונה
דשן	מגיב	USB	75826
מים	מגיב	Burdick & ג'קסון	365
Centrivap מרוכז	Tool	Labconco
Exquest חותך נקודה	כלי	BioRad
LCQ Deca XP מקס יון ספקטרומטר מסה מלכודת	כלי	ThermoFisher מדעי
ממונע העלי	כלי	Kontes קורפ
פוליפרופילן בחישה	כלי	BioSpec Prod
מוטות
פושט צורה ולובש צורה תא IEF	כלי	BioRad
Sonicator	כלי	ברנסון
המודד פלוס HPLC מערכת	כלי	ThermoFisher מדעי
VersaDoc הדמיה מערכת	כלי	BioRad