İskelet Kası Cinsiyet Proteomik Dimorfizm

Özet

, Izole ve en bol bulunan proteinlerin iskelet kası ifade kimliğini belirlemek için yöntemler ileri düz bir set. Yaklaşık 800 noktalar 10 mg kas iki boyutlu bir jel üzerinde ayırt bu cinsiyete özgü protein ifade belirlenmesi için olanak sağlar. Bu yöntemler çoğu dokularda eşdeğer sonuçlar verecektir.

Özet

Brüt iskelet kas kasılması öncelikle kontraktil proteinlerin görece küçük bir sayı tarafından belirlenir, ancak bu doku da önemli direnç egzersiz ve kullanmama atrofisi hipertrofisi gibi çevresel faktörler ¹ uyarlanabilir. Böylece stresörler (ısı, iskemi, ağır metaller, vb.) ^2,3 şekillenmesi ve uyarlamalar sergiler. , Sözde eksantrik kasılma ⁴ uzatma ederken Hasar kas kas kuvvet tarafından uygulamakla oluşabilir. Kontraktil proteinler gibi exertions hasarlı ve bozulmuş ve / veya resynthesized, tamir edilecek; bu işlevleri kontraktil proteinlerin parçası değildir, ama diğer daha az bol proteinleri hücre. Hasar bu tür ıslah ne katılan proteinlerin alt belirlemek için diferansiyel belirlemek için küresel bir proteom ⁵ egzersiz önce kurulmuş olmalı ve ardından egzersiz sonrasında takipprotein ekspresyonu ve böylece hasarı ve onarım uyarlamalar aday proteinleri vurgulamak. Ayrıca, iskelet kası çalışmaların çoğu türlerin erkek yapılmıştır ve dolayısıyla kadın kas temsilcisi olmayabilir.

Biz bu makalede, erkek ve kadın kas proteinleri tekrarlanabilir açılan ve yüksek çözünürlüklü dijital ^{görüntüleme} 6 takiben iki boyutlu jel elektroforezi ile ayırarak için bir yöntem sunar . Bu gösteren noktalar (ve sonradan tespit proteinler) için bir protokol istatistiksel olarak anlamlı (p <0.05) iki kat artış veya azalma, görünür ya da kontrolü devletin kaybolur. Bunlar daha sonra, eksize tripsin ile sindirilir ve protein tanımlama (LC / MS / MS) ⁵ için kütle spektrometresi (LC / MS) ile birleştiğinde yüksek basınçlı sıvı kromatografisi ile ayrılır. Bu metodoloji (Şekil 1) (karaciğer, beyin, duymak hiç değişiklik ile birçok dokuda kullanılabilirt vb.)

Protokol

1. Örnek hazırlama

1. Başlangıç ​​malzemesi olarak farelerden elde edilen taze, flaş dondurulmuş veya RNAlater ile tedavi edilen doku kullanın. Devam etmeden önce bir Kimwipe ile herhangi bir aşırı koruyucu kurutun.
2. Çevresindeki tüm tendon ve kas fasya çıkarın ve doku doku, iyi kıyılmış veya toz kadar bir soğuk oda (4 ° C) 2 dakika süreyle soğuk cam plakalar üzerine tek kenarlı Jilet ile kıyma. Önceden tartılmış mikrofuge'ye tüp örnek toplayın ve doku ağırlığı belirlemek. Başlangıç ​​materyali olarak en fazla 10 mg doku kullanın.
3. Oda sıcaklığında 1 mg kıyılmış doku başına 45 mcL ekstraksiyon tamponu (8 M üre, 50 mM DTT,% 4 ahbap,% 0.2 taşıyıcı ampholytes 5 / 8, 0.0002% Bromophenol Mavi) ekleyin. Hacmi 350 mcL daha büyükse, başlangıçta 350 mcL ekleyin ve homojenize (adım 1.4), daha sonra sıçramasına en aza indirmek için tampon geri kalanını ekleyin.
4. 15 saniye için doku motorlu havaneli (Kontes Corp) ile yedi kez homojenize4 ° C, iki dakika her homojenizasyon arasındaki buz üzerinde soğutma ile.
5. 4 30 dakika 15.600 xg örnekleri Santrifüj ° C Süpernatantı kaydedin ve hacmini ölçmek. Hücre enkaz pelet atılır.
6. Buz gibi reaktif dereceli aseton (v oranı 3 kat v) süpernatantı proteinlerin çöktürün. 15 saniye vorteksleyin. Pelet formu ve Kontes motor ve polipropilen karıştırma çubukları (BioSpec Remix) ekstraksiyon tamponu ile tekrar süspansiyon 15.600 xg 10 saniye süreyle santrifüj
7. Adım 1.6 tekrarlayın.
8. Ya örneklerin protein konsantrasyonu tahmini ile devam ya da -20 ° C'de saklayın

2. Protein konsantrasyonu tahmini

Yaklaşık 4,5 mg ml ^-1 amacı; Lowry tahlil ⁷ veya BCA tahlil ⁸ (Pierce) kullanın.

3. Odaklama İzoelektrik

1. ReadyStrip IPG şeridi çıkarın (11 cm, pH 5-8, Bio-Rad)-20 ° C ve 10-15 dakika süreyle RT gelmesini sağlayınız.
2. Vorteks protein örnek örnek örnek rehidrasyon tepsisini bir kanal arka kenarında düz bir çizgide ve pipet 600-800 mg (toplam hacmi 200 mcL), yaklaşık 1 cm bırakarak her iki ucunda.
3. Forseps kullanarak, IPG şerit plastik kapak kalkmasına şerit uçları sadece sap ve jel ile herhangi bir teması önlemek için emin olun. Not ve şerit temel tepsisinin sol tarafındaki pozisyon. Örnek üstünde aşağı IPG şerit jel tarafı yerleştirin, yakalama kabarcıkları altında kaçının. Bir saat rehidrate izin ver.
4. 2.5 mL mineral yağı (BioRad) Overlay. Tepsisi kapağı, kapak ve oda sıcaklığında bir gece rehidrate bırakın.
5. Odaklama tepsi kanalın her iki ucunda bir kağıt fitil yerleştirin ve her biri 10 mcL Millipore su ile ıslak.
6. Şerit IPG çıkarın ve yağ tahliye için yaklaşık 10 saniye dikey olarak tutun. Leke plastik bKimwipe ile acking.
7. IPG şerit jel yan odaklama tepsisinde aşağı ve sola temel sonuna yerleştirin. Şerit 2.5 mL mineral yağı ile kaplayın.
8. Protean IEF hücreli (Bio-Rad) ve program varsayılan 20 hücre sıcaklığında 3 aşamalı bir protokol (Tablo 1) tepsiye yerleştirin ° C, 50 uA / şerit ve rehidrasyon süresi maksimum akım.

   	Gerilim	Zaman	Volt-Saat	Rampa
   Adım 1	250	20 dk.		Doğrusal
   Adım 2	8.000	2.5 saat		Doğrusal
   Adım 3	8.000		40.000	Hızlı
   Toplam		6.5 saat	40.000

   Tablo 1. Üç adım 11 cm şeritler IPG Protean IEF hücre protokolü.

9. IPG şeritler forseps kullanarak IEF hücre dışına çekin. Kimwipe ile plastik desteğini Blot ve IPG şerit jel tarafı, temiz bir rehidrasyon tepsiye yerleştirin. Rehidrasyon tepsi örtüsü ve plastik wrap ve mağaza ile sarın - 80 ° C veya devam edin.

4. SDS-poliakrilamid jel elektroforezi

1. Şerit (jel tarafı yukarı) 11 cm dengeleme tepsisine aktarın.
2. Kanala azalma tamponu (6 M üre,% 2 SDS, 0.05 M Tris / HCl, pH 8.8,% 20 gliserol,% 2 DTT) 4 mL ekleyin ve hafif sallayarak 10 dakika için şerit dengeye.
3. Azaltılması tamponu çıkarın, alkilleme tamponu (6 M üre,% 2 SDS, 0.05 M Tris / HCl, pH 8.8,% 20 gliserol,% 2,5 iodoacetamide) 4 mL ekleyin ve hafif sallayarak 10 dakika için şerit dengeye.
4. Stri daldırma IPG şerit durulayın1 X SDS çalışan tampon p kısa bir süre (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, pH 8.2).
5. 11 cm arka plaka üzerine şerit jel yan yatırın Kriter prekast 10.5% -14% Tris-HCl SDS-poliakrilamid jel (Bio-Rad) ve SDS jel ile tam temas edinceye kadar yavaşça itin; iki jel yüzeyler arasında sıkışıp hava kabarcığı emin olun.
6. 1 ml (% 0.5 agaroz, 25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, Bromophenol Mavi) erimiş agaroz çözüm IPG şerit Yerleşimi ve agaroz 5 dakika boyunca katılaşmaya izin.
7. Molekül ağırlığı standartları olarak tek bir kuyunun içine protein marker 5 mcL 10-225 kDa (76.740 USB, P / N) yükleyin.
8. Oda sıcaklığında 200 V veya jel elektroforez izlemek için Bromophenol Mavi boya ön göç kullanarak bir soğuk oda (4 ° C) SDS tamponu (25 mM Tris, 192 mM glisin,% 0.1 SDS, pH 8.2) çalıştırın.
9. Plastik dökme jel çıkarın ve geceleme Coomassie Brillant Blue hafifçe sallayarak lekeR-250 (% 45.5 metanol,% 45.5 dH2O,% 9.0 asetik asit,% 0.25 Coomassie Brillant Blue R-250) leke.
10. 3 saat gecede her bir ve Destain 2 (% 5 metanol,% 90 dH ₂ O,% 5 asetik asit) için jel Destain 1 solüsyonu (% 45.5 metanol,% 45.5 dH ₂ O,% 9.0 asetik asit) iki kez çalkalayın . Analiz için% 7 asetik asit jel saklayın.

5. Jel görüntüleme ve analiz

1. VersaDoc görüntüleme sistemi (BioRad) faaliyet Miktar Bir yazılım programı kullanarak jeller, görüntüler yakalayın. Denemenizi tüm jeller için düzgün görüntü alanları kırpın.
2. Bir deney seti oluşturmak için kırpılmış görüntüleri PDQuest 8.0 yazılım programı yükleyin. Nokta tespiti ve jeller arasında eşleştirme nokta için parametreleri tanımlamak için Deney kurulum sihirbazı izleyin. Kontrol edin ve gerekirse elle sonuçları eşleşen spot rafine.
3. Tw ile eşleşen protein noktaları tespit etmek için jeller nicel ve istatistiksel analiz yapıniki jel grupları arasında ifade o kat veya daha yüksek istatistiksel olarak anlamlı farklılıklar. Bu ilgi çekici noktalar ile bir analiz oluşturun ve tripsin sindirim ve LC-MS-tabanlı protein belirlenmesi için bir EXQuest spot kesici (BioRad) kullanarak bunları kesip.

6. Jel triptik sindirim

Bu adımı modifiye Pierce-Gel Triptik Digest Kit (# 89871X, Pierce) protokolü kullanılır.

1. Jel fişler destaining çözüm (25 mM amonyum bikarbonat,% 50 asetonitril) 200 mcL ekleyin. Vortex ve 37 ° örnekleri inkübe ° C ile 30 dakika boyunca sallayarak. Çözüm dikkatlice çıkarın ve atın.
2. 6.1 adımı tekrarlayın.
3. Taze hazırlanmış azaltarak tamponu (50 mM Tris [2-carboxyethyl] fosfin, 22.5 mM amonyum bikarbonat), 60 ° C'de 10 dakika jel fişler ve inkübe içeren tüplere 30 mcL ekle
4. Örnekleri soğutmak için izin ver; sonra çıkarın ve indirgeyici tampon atın.
5. Alkilleme tamponu (folyo sarılı tüpler içinde hemen önce hazırlanan 100 mM iodoacetamide, 20 mM amonyum bikarbonat, 30 mcL ekleyin. Oda sıcaklığında 1 saat süreyle karanlıkta örnekleri inkübe edin.
6. Alkilleme tamponu çıkarın ve atın. Her tüp çözüm destaining 200 mcL ekleyerek jel fişler yıkayın. 37 örnekleri ° C'de 15 dakika boyunca.
7. Destaining çözüm çıkartın ve atın ve yıkama tekrarlayın.
8. Jel fişler asetonitril 50 mcL ekleyin ve onları kuru küçültmek için izin oda sıcaklığında 10 dakika inkübe sonra asetonitril dikkatlice çıkarın.
9. Adım 6.8 kez daha tekrarlayın. Jel adet beyaz ve küçük bir bakmak gerekir.
10. Jel parçaları 10 dakika Centrivap Konsantratörü (Labconco Model EX1245) kurumasını bekleyin.
11. 10 mcL aktif tripsin çözeltisi (10 ng / ml tripsin, 25 mM amonyum bikarbonat) eklenerek jel parçaları şişer. 15 m için oda sıcaklığında inkübeinutes.
12. Tüpler 25 mcL sindirim tamponu (25 mM amonyum bikarbonat) ekleyin. Örnekleri sallayarak bir gecede oda sıcaklığında inkübe edin.
13. 10 dakika örnekleri sonikasyon (Branson, banyo sonikatör modeli 2510) ve yeni bir tüp süpernatant çıkarmadan önce onları aşağı doğru döndürün. Süpernatantı kaydedin.
14. Peptidler daha ayıklamak için, titreme 5 dakika boyunca oda sıcaklığında% 0.1 formik asit ve inkübe 10 mcL ekleyin. Örnekleri 10 dakika boyunca sonikasyon süpernatantı toplamak ve adım 6.13 kaydedilir süpernatant ile birleştirmek.

7. Peptid özler Mikro tuzsuzlaştırma

1. Üretici talimatlarına göre PepClean C-18 Spin Kolonlar (ThermoFisher) yardımı ile peptid özleri amonyum bikarbonat ve diğer tuzlar çıkarın.
2. Zehir peptidler 20 mcL% 70 asetonitril ile iki kez, 1 saat ve tekrar süspansiyon için Centrivap Konsantratörü santrifüj kuru örnekleri buharlaşmasıMS analizi için 10 mcL% 0.1 formik asite peptidler.

8. HPLC-coupled kütle spektrometresi tarafından Protein tanımlama

1. PS-DVB Pepswift yekpare bir sütun (Dionex)% 0.2 formik asit peptid karışımı 40 dakika boyunca yüksek bir performans likid kromatografi (HPLC), doğrusal bir 2-50% asetonitril degrade kullanarak ayrı ayrı 5 mcL, bir Nanospray akuple I ucunda 400 nL / dak akış hızında bir iyon tuzağı kütle spektrometresi (LÖA Deca XP Max, Thermo Fisher Scientific) üzerine kaynağıdır.
2. 1400 m / z ve dinamik bir dışlama ile CID MS2 sıralaması için izole edilmesi için 3 en yoğun iyon doruklarına izin - 400 arasında peptid MS1 sinyallerini algılar.
3. Protein tanımlanması için bir statik alkillenmiş sistein modifikasyonu ve fosforilasyon için dinamik değişiklikler (serin, treonin, tirozin), methyla Sequest fare referans veritabanı arama (BioWorks yazılım, Thermo Fisher Scientific) ile peptid sonuçları analizğünü (histidin), oksidasyon (metionin), ADP-ribosylation (arginin) ve N-terminal asetilasyon. Muhafazakar eşleştirme ölçütleri (örneğin, proteinler, Xcorr vs Şarj Devlet filtresi geçen en az 2 peptidler içeren 2 AMU ve 1.00 parçası hoşgörü, peptid hoşgörü uygulayın [z = 1 / x = 1.5, z = 2 / x = 2.00, z = 3 / x = 2.50, z = 4 / x = 3.00 ve p <0.05) ⁵ ve elle emin protein tanımlanması için MS spektrumları incelemek bir olasılık.

9 - Temsilcisi Sonuçlar:

Erkek ve kadın unexercised, fare iskelet kası (biceps brachii'nin) ayıklanır ve iki boyutlu harita ⁵ kas karşılaştırmalı proteom (Şekil 2), ilk seviye ayrılır. Bir kez yüksek çözünürlüklü dijital görüntüleme kullanılarak görüntülendi; her birinde yaklaşık 800 protein noktalar tespit edildi. Erkek proteom harita kullanarak bir temel olarak, birçok noktalar kadın proteom bolca değişim olduğu açıktır. Spot şiddetleri protein miktarları değişiklik önlemler (Şekil 3). Iki kat (yukarı ya da aşağı) 'den daha fazla değişim ve protein noktalar kimlikleri istatistiksel olarak anlamlı (p <0.05) n = 5 fare ile amino asit dizi analizi, sıvı kromatografisi-birleştiğinde kütle spektrometresi ile belirlenir. Bu sonuçlar göstermektedir ki kadın şeker enerji metabolizması, enzimler, kreatin kinaz enzim (CK) izoformları, kasları farklı bir enerji arz sistemi bir bolluk azalma göstermektedir. Insan ve hayvanların, hem de dinlenme ve ^aşağıdaki egzersiz 9,10 daha yüksek erkek serum CK düzeyleri ekran, ancak serum CK ^düzeyleri mutlaka 11,12 myofibrillar kesinti miktarı ile ilişkili değildir. Bu cinsiyet dimorfizm fare biceps brachii'nin kas CK hücresel bolluk içinde bir roman finding5 ve fizyolojik olarak farklı serum CK düzeyleri cevap verebilirsiniz.

Şekiller:

g1.jpg "/>
Şekil 1 karşılaştırmalı proteomik protokol genel bir şematik. Numunesinin analiz; ve protein kimlik numune hazırlama protokolü üç gruba ayrılmıştır; Genel protokol durmadan yürütülmektedir, en iyi sonuçları aldı olmasına rağmen protokolleri bu üç grubun her uçları, aynı zamanda makul bir duraklatma yerlerdir.

Şekil 2 dişi fare pazı brachii'nin protein Karşılaştırma erkek pazı brachii'nin aynı noktalar (yeşil çevrelerin o) noktalar. Kadınlarda iki kat daha büyük ya da eşit artış Spotlar daire kırmızı (o) ve iki katına eşit veya daha az düştüğü o mavi (o) daire bulunmaktadır.

Şekil 3 Jel Spot Yoğunluk Analizi: X-ekseni, kadınegzersiz öncesi (kontrol, n = 5), Y-ekseni, 0 sa bir zaman noktasında grup maçı kadın tek (n = 5). Regresyon doğrusu: korelasyon katsayısı = 0,919; eğim = 0,976; önünü = -0,0293. - Kırmızı çizgi mavi çizginin üstünde ve altında iki kat Spotlar + / daha fazla değiştirebilir.

Tartışmalar

Burada sunulan LC / MS proteomik yöntemi iskelet kas proteom ilk seviye hızlı bir analizi için en güvenilir ve tekrarlanabilir bir protokoldür. Bu makul bir çare bir karşılaştırma için cinsiyet özgüllük sağlar. Düşük bolluk proteinleri, kas örnek bir fraksiyonasyon böylece artan düşük bolluk proteinler, mümkün olduğunca kontraktil proteinler gibi birçok kaldırmak için gerektirecektir. Istenirse proteom profil Terzilik farklı pH aralığında IPG şeritler ve alternatif yüzde degrade jeller ile yapılabilir. Daha hassas floresan lekeleri vardır, ama biz her laboratuar sistem bu lekeler doğrusallık belirlemek öneririz. Protein ekspresyonu daha titiz bir analizi için Dige sistemi (İki Boyutlu Elektroforez sistemi-Jel, GE Healthcare Yaşam Bilimleri) kullanılabilir, ancak bu karmaşıklık düzeyine metodoloji eklese. Ayrıca, burada açıklanan en ani protokolü ile kullanılabilirörtüşen enzimatik parçalarının yanı sıra yüksek saflıkta enzimler kullanılarak oluşturulan olabilir çünkü bir genom gibi herhangi bir kaynaktan gelen bir protein de novo sıralama olarak, sıralı edildiği için normal dokuların sürece, iki boyutlu bir jel üzerinde çözülecektir . tripsin için. Hidrofobik membran ve proteinler için arayan, ancak, biz bu protokolü kullanarak, kalp, karaciğer, böbrek ve beyin dokularında ile iyi sonuçlar vardı, özellikle diğer doku kaynaklarından alınan numuneler, ekstraksiyon yöntemi bazı değişiklikler gerekebilir. Diğer post-translasyonel modifikasyonlar tayf veritabanı arama kriterlerini değiştirerek tespit edilebilir. Özetle, biz makul proteom profil analizi için detaylı bir başlangıç ​​protokolü sundu.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Reaktifi Adı	Tip	Şirket	Katalog numarası	Yorumlar
PepClean C-18 Spin Sütunlar	Sarf	ThermoFisher Bilimsel	PI-89.870
Monolitik Pepswift sütun (100um x 5 cm)	Sarf	Dionex	162348
Kriter pre-cast 10.5% -14% Tris-HCl SDS poliakrilamid jeller	Sarf	BioRad	345-0106
IPG şeritler Readystrip	Sarf	BioRad	PH Değişen aralıkları
Asetik asit	Reaktif	Fisher Scientific	A465-1
Aseton	Reaktif	Pharmco	329000
Asetonitril	Reaktif	Fisher Scientific	A955
Agarose	Reaktif	BioRad	163-2111	Kaplama çözüm
Amonyum bikarbonat	Reaktif	Fluka	40867
Bromofenol mavi	Reaktif	Fisher Scientific	BP114
Bio-Lyte Ampholytes	Reaktif	BioRad		PH Değişen aralıkları
Chaps	Reaktif	USB	13361
Commassie mavi R-250	Reaktif	ThermoFisher Bilimsel	20278
Dithiothreitol (DTT)	Reaktif	USB	15395
Formik asit	Reaktif	ThermoFisher Bilimsel	28905
Gliserin	Reaktif	Sigma-Aldrich	G6279
Glisin	Reaktif	USB	16407
Iodoacetamide	Reaktif	Sigma-Aldrich	I6125
Metanol	Reaktif	Fisher Scientific	A452
Madeni yağ	Reaktif	BioRad	163-2129
Sodyum dodesil sülfat	Reaktif	Sigma-Aldrich	L6026
Tris baz	Reaktif	Sigma-Aldrich	93349
Tris [2-carboexyethyl] fosfin	Reaktif	ThermoFisher Bilimsel	77720
Tripsin Endoproteinase TPCK tedavi, MS notu	Reaktif	Delmek	90055	modifiye
Üre	Reaktif	USB	75826
Su	Reaktif	Burdick & Jackson	365
Centrivap Konsantratörü	Tool	Labconco
Exquest nokta makası	Araç	BioRad
LÖA Deca XP Max iyon tuzağı kütle spektrometresi	Araç	ThermoFisher Bilimsel
Motorlu havaneli	Araç	Kontes Corp
Karıştırma Polipropilen	Araç	BioSpec Üretim
çubuklar
Protean IEF hücre	Araç	BioRad
Sonikatör	Araç	Branson
Surveyor Plus, HPLC sistem	Araç	ThermoFisher Bilimsel
VersaDoc görüntüleme sistem	Araç	BioRad