תיוג של פלורסנט מדרדר מאפשר להקלטה ממוקדת חד תאית מיחידת נוירונים שזוהו<em&gt; בvivo</em

Summary

תחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מתייגת תת אוכלוסייה של תאי עצב המבוססים על הקרנת אנטומי. אקסונים שכותרתו יכול להיות ממוקדים מבחינה ויזואלית In vivo, המאפשר הקלטה תאית מהאקסונים שזוהו. טכניקה זו מאפשרת הקלטה כאשר לא יכולים להיות מתויגים הנוירונים באמצעות מניפולציה גנטית או קשים לבודד באמצעות 'עיוורת' In vivo גישות.

Abstract

המטרה הכללית של שיטה זו היא לרשום תגובות-יחידה אחת מאוכלוסייה מזוהות של נוירונים. בקלטות אלקטרו vivo מתא עצב בודדים הם קריטיים להבנה כיצד לתפקד במעגלים עצביים בתנאים טבעיים. באופן מסורתי, ההקלטות הללו כבר בוצעו "עיוורים", כלומר את זהותו של התא אינה ידועה נרשם בתחילת ההקלטה. זהות סלולרית ניתן לקבוע בהמשך דרך ¹ תאי, juxtacellular ² או רופף-תיקון ³ Iontophoresis של צבע, אך ההקלטות אלה לא ניתן מראש ממוקדות לתאי עצב ספציפיים באזורים עם סוגי תאים הטרוגניים תפקודיים. ניתן לבטא חלבוני ניאון באופן ספציפי תא מסוג המתיר electrophysiology תא בודד ^4-6 חזותי המודרך. עם זאת, ישנן מערכות מודל רבות אשר כלים גנטיים אלה אינם זמינים. אפילו במערכות מודל גנטי נגישות, רצוי פרוmoter עשוי להיות ידוע או נוירונים גנטי הומוגניות ייתכן שדפוסים משתנים הקרנה. כמו כן, נעשו שימוש בוקטורים ויראליים לתייג קבוצות מסוימות של נוירונים הקרנה ^7, אך שימוש בשיטה זו היא מוגבלת על ידי רעילות וחוסר הספציפיות טרנס הסינפטי. לפיכך, טכניקות נוספות המציעות ראיה מראש ספציפית כדי להקליט מתא עצב אחד מזוהה in vivo יש צורך. ראיה מראש של נוירון היעד היא שימושית במיוחד עבור תנאי הקלטה מאתגרים, שעבורו הקלטות של תא בודד הקלסיים הן לעתים קרובות קשה ^8-11 להחריד. הטכניקה החדשנית שמתוארת במאמר זה משתמשת בתחבורה מדרדר של צבע פלואורסצנטי מיושמת באמצעות מחטי טונגסטן במהירות ובאופן סלקטיבי לתייג קבוצת משנה ספציפית של תאים בתוך אזור מוח מסוים המבוסס על תחזיות axonal הייחודיות שלהם, ובכך לספק רמז חזותי להשיג קלטות אלקטרו ממוקדות מתא העצב המזוהה במעגל withi ללא פגענה החולייתנים מערכת העצבים המרכזית.

קידום הרומן המשמעותי ביותר של השיטה הוא השימוש בניאון התיוג למקד סוגי תאים מסוימים במערכת מודל שאינו נגישה מבחינה גנטית. דגי חשמל חלש הם מערכת מודל מצוינת לחקר מעגלים עצביים בער, מתנהג בעלי חיים ^12. אנו מנוצלים טכניקה זו כדי ללמוד עיבוד חושי על ידי "תאים קטנים" בגרעין exterolateral הקדמי (ELA) של דגי mormyrid חשמל חלש. "תאים קטנים" הם שערנו להיות נוירונים קומפרטור זמן חשובים לאיתור הבדלי submillisecond בזמני ההגעה של הקוצים presynaptic ^13. עם זאת, תכונות אנטומיות כגון מיאלין הצפוף, סינפסות שוטפות, וגופי תא קטנים עשו את זה קשה מאוד להקליט מהתאים האלה באמצעות שיטות מסורתיות ^{11, 14.} כאן אנו מראים כי השיטה החדשה שלנו באופן סלקטיבי תוויות בתאים אלה ב28% מהכנות, ומאפשרים להקלטות, חזקות ואמינות characterization של תגובות לגירוי electrosensory.

Protocol

1. הכן את מחטי דיי מצופים

1. אלקטרוליטים לחדד ¹⁵ טונגסטן קוטר 160 מיקרומטר תיל. קטרי קצה מחט סופיים צריכים לנוע בין 5-50 מיקרומטר. מספר המחטים הנדרשות תלוי בגודל של האזור שכותרתו. הכנו 5 מחטים במשך 3-5 זריקות לתוך גרעין exterolateral האחורי (ELP).
2. בלילה שלפני הניסוי, מקום טיפה (<0.25 μl) של 2 מ"מ צבע dextran מצומדות אלקסה פלואוריד 10,000 מגה וואט של כל אחד על גבי מחט את דיסטלי 100 מיקרומטר.
3. לאפשר את המחטים לייבוש באוויר בטמפרטורת חדר, והשאיר את הצבע מרוכז בקצה. אחסן את המחטים על 4 מעלות צלזיוס במכל כהה כדי להגן עליהם מפני אור.

2. הכן את בעלי החיים לכירורגיה

1. לגרום להרדמה כללית על ידי הצבת הדגים בתמיסה של 300 מ"ג / ליטר MS-222 במכל מים.
2. שוקל אורך דגים ולמדוד מזלג (קצה החוטם למזלג של סנפיר הזנב) ועומק גוף (מקסימאלי dorso-ventraמרחק L במישור הרוחבי). מדידות אלה צריכים ליפול בתוך הטווחים שצוינו בטבלה 1, כך שהדג מתאים בתוך תא הקלטה קטן מספיק כדי למקם תחת מיקרוסקופ אובייקטיבי מים טבילה (איור 1).
3. לשתק ולהשתיק חשמלי דגים על ידי הזרקה של 100 μl 3 מ"ג / מיליליטר flaxedil לשרירי הגוף הגבי.
4. מלא את תא ההקלטה (איור 1 א) עם המכל מים. מניחים את דגי הגחון בצד למטה על הרציף במרכז החדר (איור 1). לספק פתרון סודה של 100 מ"ג / ליטר MS-222 באמצעות קצה פיפטה הניח בפיו של הדג (1-2 מ"ל / דקה). לייצב את הדגים עם מוטות קבועות בשעווה ממוקמת משני צידי הגוף (איור 1 ג). לפקח על בריאותו של הדג על ידי בדיקה לזרימת דם בכלי הדם רציפה עיני וצבע גוף נורמלי.
5. סובב את הפלטפורמה לאורך הציר הארוך שלה ולהוריד את הקצה האחורי של platfORM, כך שצד אחד של פני השטח הגבי של הראש של הדג חשוף מעל למים ואילו שאר גופו של הדג נותר מתחת למים. חתיכה קטנה של Kimwipe צריכה להיות ממוקמת בכל חלק שאינם שקוע של העור כדי למנוע התייבשות.

3. ניתוח (איור 2)

ההליך כירורגי הבסיסית שתואר כאן הוא מבוסס היטב ובאמינות המשמש לעיוורים בהקלטות vivo בmormyrids ^16. עבור יישומים אחרים, לחשוף את האזורים הרצויים עבור תיוג ורישום. האזור המכיל מסופי האקסון של התאים של עניין חייב להיות נגיש על ידי מחט צבע מצופה. האזור המכיל קטעים הפרוקסימלי יותר של אותם אקסונים חייב להיות מספיק מקום מעל הרקמה כדי להכיל את מרחק העבודה של עדשת מים הטבילה (2 מ"מ במקרה שלנו).

1. החלת פתרון של 0.4% לידוקאין אל פני השטח החשוף של הראש באמצעות Q-טיפ.
2. שימוש בלהב סכין מנתחים, לחתוך את ההיקף של חתיכה מלבנית של עור. הסר את המלבן בעזרת זוג מלקחיים. גודלו של המלבן יהיה בקנה מידה עם גודל דגים, אבל צריך להיות כ 3 מ"מ x 5 מ"מ לדגי 6.2 ס"מ (איור 2 א). הקצה לרוחב של המלבן צריך ליישר עם מרכז העין, בקצה הקדמי של המלבן צריך להיות רק אחורי לעין, והקצה המדיאלי של המלבן צריך להיות בדיוק לרוחב של קו האמצע של הדג.
3. להרחיב את אזור הגולגולת החשוף anteromedially לחשוף שאינם חופף שטח מרובע (איור 2) 2.5 מ"מ נוסף.
4. ברור לחלוטין ולייבש את המשטח החשוף של הגולגולת באמצעות להב סכין המנתחים לגרד ממנו כל רקמה עודפת וKimwipes ואוויר נאלץ לייבש את פני השטח (איור 2 ג).
5. דבק הודעה מתכת לאזור הגולגולת החשוף anteromedial באמצעות דבק סופר. חכה עד שהדבק יבש לחלוטין (איור 2 ד).

6. הסר מלבן של גולגולת, מ"מ X 4 מ"מ כ 2 ס"מ לדג 6.2. השתמש במקדח שיניים עם ~ 0.5 מ"מ קוטר כדור טחנת קרביד קצה כדי לדלל את ההיקף של המלבן. לאחר מכן, בעזרת אזמל ומלקחיים, לחתוך את ההיקף של המלבן ולקלף אותו משם כדי לחשוף את המוח הבסיסי. קידוח נוסף או גזירה במספריים קטנים עשוי להיות נחוץ כדי לחשוף באופן מלא EL (2E איור). אם דימום מתרחש שריר, ניתן להשתמש ביחידת electrocautery.
7. לחתוך גם את הדורה מאטר (פיגמנט) וקרום רך (ברור) באמצעות מספריים באביב או במחט ולהסיר את החלקים לחתוך עם זוג מלקחיים. את החלקים קדמיים ואת אחורי של גרעין exterolateral (EL) נמצאים כעת נראים לעין, וELA ELP, בהתאמה (איור 3 א).

4. תיוג מדרדר של האקסונים של ריבית

1. מקם מניפולטור עם מחט צבע מצופה (שנעשה בשלב 1) מעל אזור היעד המכיל אקסונים של interesלא, במקרה שלנו ELP.
2. במהירות להכניס את המחט כ -25 מיקרומטר לתוך הרקמה. חכה 15-30 שניות, עד שכל הצבע יש כברת דרך, ולאחר מכן לחזור בו את המחט.
3. חזור עם מחטים טריות נוספות לפי צורך, הצבת כל אחת במקום אחר, כך שהצבע מופץ ברחבי אזור היעד. אנחנו השתמשנו 3-5 מחטים להכנה.
4. יש לשטוף את עודפי צבע מהחלל עם פתרון הצלצול של היקמן.
5. חכה לפחות 2 שעות לספיגת צבע ותחבורה.

5. ויזואליזציה של האקסונים של ריבית

1. מקם את חדר ההקלטה, יחד עם הדגים, מתחת למטרה של מיקרוסקופ זקוף, קבוע שלב epifluorescent. ככל שגופו של הדג חוסם חדירה אור, מקורות אור שניהם לבנים וניאון חייבים לבוא מלמעלה. מיקום זהיר של מקור אור סיב אופטי מעל חלל הגולגולת מאפשר תמונות brightfield משביעות רצון. לצפייה epifluorescence, מסנן הקרינהמפרטים צריכים להתאים את ספקטרום הספיגה / פליטה של ​​הצבע.
2. לעבור לנשימה מיכל מים טריים ולשמור על אותו קצב הזרימה. הנח חוט קרקע בחלל המוח החשוף ולהתחבר לקרקע של headstage ההקלטה (ראה 6.3).
3. הנח זוג אלקטרודות הקלטה ליד בסיס הזנב ולהתחבר למגבר ההפרש ומכשיר הקלטה (למשל מוניטור אודיו, אוסצילוסקופ, או מחשב) כדי לפקח על פקודת שחרור האורגן החשמלית (EODC). לאחר הדגים מתאושש מהרדמה, EODC יכול לשמש כאינדיקציה למצבו של הדג.
4. להכין סקיצה בקנה מידה של האזור במוח שנצפו בהגדלה נמוכה. כולל כלי דם גדולים כציונים דרך (יכול להשתנות מדג לדג) כדי לזהות את מיקומו של האקסונים שכותרת נראים לעין רק בהגדלה גבוהה (איור 3D) המדויק.
5. לאשר את מיקום צבע. ראשון להציג את כולו הרקמה עם brightfield תאורה להתמצאות ( איור 3 א). לאחר מכן להציג עם תאורת ניאון (איור 3). ELP יהיה מפוזר תיוג (איורים 3 ב ו 3 ג). למזער עירור הקרינה כדי להגביל את ההשפעות פוטודינמי וphototoxic של הצבע.
6. השתמש בכולים כציונים דרך לאתר אל"ה בהגדלה גבוהה. להאיר באור ניאון תוך חיפוש האקסון מסומן בקרבת פני השטח. (איור 4).

6. שיא פעילות תאית

1. משוך אלקטרודות הקלטה באמצעות יניקת 1 מ"מ OD, זכוכית 0.58 מזהה מ"מ ורוסיליקט נימים עם נימה. גודל הטיפ אידיאלי יהיה תלוי בקוטר של אקסונים היעד, אשר במקרה שלנו הוא 0.1-0.2 מיקרומטר ^17. לבקשתנו, קטרי קצה האלקטרודה היו 1.5 ± 0.4 מיקרומטר (טווח: 1.0-2.4 מיקרומטר) עם שוק ארוך 5 מ"מ, צר כדי להתקרב אקסונים שכותרתו מבלי להזיז את הרקמה הצפופה שמסביב.
2. מלא electrodes עם מסונן פתרון הצלצול של היקמן. התנגדות הטיפ האחרונה היא 45.2 ± 38.0 MΩ (טווח: 16-155 MΩ).
3. מניחים את האלקטרודה בבעל אלקטרודה עם יציאת לחץ ולחבר אותו למגבר headstage רכוב על מניפולטור. הפעלת קו לחץ מהנמל ללחץ סיום צומת T במד לחץ ומזרק לניטור ושליטה בלחץ, בהתאמה.
4. חבר את headstage למגבר ומכשיר רכישה אנלוגי לדיגיטלי.
5. עם לחץ חיצוני 30 mbar בקו אלקטרודה, למקם את האלקטרודה ליד האקסון שכותרת. מצלמה ברמה נמוכה לאור ממשק עם תוכנת הדמיה משמשת כדי להמחיש מיקום פיפטה. התחל בקרבת פני השטח הרקמות ולקדם את האלקטרודה לכיוון האקסון. ככל שאתה מתקרב לאקסון, ולחץ החיצוני צריך לגרום לתנועה קלה, אך מורגשת של האקסון.
6. בעוד האלקטרודה נמצאת ליד האקסון, (איור 4 א, ​​למעלה) להקליט החזקial באלקטרודה תוך הצגת גירויי בדיקה (במקרה שלנו, השתמשנו ב100 פולסים חיוביים ושליליים monophasic msec רוחביים בעצמה של 20 mV / ס"מ, איור 1 א). פוטנציאל פעולה לא צריך להיות שנצפה, למרות שחפץ חשמלי מאשר הקלטה נכונה / גירוי (איור 4 א, ​​למטה).
7. לשחרר את הלחץ כלפי חוץ באלקטרודה ולחזור על גירוי / הקלטה. פוטנציאל פעולה צריך עדיין לא נצפה (איור 4).
8. החל יניקה קלה (125 ± 25 mbar) לאלקטרודה וגירוי / הקלטה חוזרת. כעת פוטנציאל פעולה יש לשים לב בתגובה לגירוי (איור 4C). פעילות ספונטנית עלולה להתרחש גם. אם פוטנציאל פעולה לא נצפה, לשחרר את היניקה, לנקות את האלקטרודה עם לחץ קל, להעביר את האלקטרודה במקצת, ושאיבת ניסיון שוב. ברגע שפוטנציאל פעולה גלוי, לסגור את קו הלחץ.
9. לגרות ולהקליט כרצוי.

7. סיום וסילוק

1. ברגע שכל הקלטות רצויות מלאות, לעבור לנשימה עם 100 מ"ג / ליטר MS-222 עד EODC הפסיק. לא EODC צריך להיות מזוהה במשך 10 דקות לפחות.
2. השלך את הדגים על פי הנחיות מוסדיות ופרוטוקולי טיפול בבעלי חיים מאושרים.

8. נציג תוצאות

עבור היישום המסוים שלנו, אנו מעוניינים בלימוד גירוי קידוד על ידי עצב סנסורי מרכזי. הקלטות מוצלחות מהאקסונים שכותרתו תאפשר ניתוח של תגובות-יחידה אחת לגירוי חושי ^18. 5A איור מראה פוטנציאל פעולה המייצג עורר על ידי גירוי electrosensory רוחבי באמצעות אלקטרודות דו קוטביים הנמצאות בחלק הפנימי של הקירות ימני והשמאליים של תא ההקלטה. יכולות להיות מוצגות פעמים ספייק כעלילת סריקה ספייק (איור 5). רוח הקלטה מראש גירוי אלפיות 25אוו מראה את הרמה הנמוכה של פעילות ספונטנית. ELA זה בפרט "תא קטן" הוא ארוך לעבור מכוון משך גירוי בעוצמת גירוי של 6 ס"מ MV /, הגדלת מספר הקוצים בחזרות עם עליית משך גירוי (איור 5 ג). ספייק הראשון ממוצע ההשהיה היא 4.28 ± 0.16 אלפיות השניים, עולים בקנה אחד עם ההשהיה הצפויה לתאים קטנים ^ב11 ELA.

איור 1. מפרטים לחדר הקלטה שיכול להתאים מתחת למטרה של מיקרוסקופ epiflourescent קבוע שלבים. () תא הקלטת כיכר כדי בקנה מידה העשויים מפרספקס מראה נוף עליון, לוואי ובחזרה. סטים מותאמים של אלקטרודות גירוי (כוכביות) בפריפריה יאפשר לאף אחד רוחבי (אדום שחור) או גירוי אורך (כחול, צהוב). פיסה נוספת של פרספקס בפינה, עם חור גומי מרופד במרכז (כתום),מחזיק פיפטה יניקה ששומרת על מפלס מים קבוע. שתי הודעות נירוסטה אנכיות מוברגת לתוך החלק התחתון של החדר (ירוק מוצק) להתחבר להודעות נירוסטה (מתווה ירוקה) מחוברות לפלטפורמה תומכת דגים (בצבע אפור בהיר, המפורטים בC) באמצעות מהדק דיסק מתכווננות. תצלום של החדר מוצג להלן הציור לקנה המידה. (ב ') נוף ואישיות המורכב של מלחציים דיסק הפלסטיק העגולים המשמש לאבטחת פלטפורמה להודעות האנכיות. לכל אחד יש מהדק דיסק חריץ (ירוק) להודעה וחור במרכז לבורג ההידוק. מהדק דיסק הוא מסובב כך החריצים הם ניצבים זה לזה. הידוק הבורג (אדום) מהדק את ההודעות במקום כדי למנוע עוד יותר אנכי ותנועה סיבובית של הפלטפורמה. (ג) לנוף בקנה מידה של צד קדמי ואת פלטפורמת פרספקס משמשת כדי להחזיק את הדגים במקום. הפלטפורמה היא מצופה בשכבת שעוות פרפין (כחול) שמחזיקה dowe עץLS (פסים שחורים) במקום לתמוך בדגים. צינורות להנשמת הדגים עוברים דרך חור ב'ראש המיטה 'של הפלטפורמה ומסתיימת בקצה פיפטה הניח בפיו של הדג. הודעה ראש נירוסטה (פס אפור) מתחברת לפלטפורמה באמצעות כדור משותף המאפשרים סיבוב של 360 מעלות. הודעות אופקיות מנירוסטה (ירוק) הם מוברגים לתוך הקצה אחד של הפלטפורמה. לחצו כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 2. סקירה סכמטי של ניתוח מסתכלת למטה על פני השטח הגבי של הראש. () הפוך ארבעה חתכים, לפי הסדר שצוין, כדי להסיר את חתיכה מלבנית של עור (אדום). (ב ') להאריך את פתיחת anteromedially להסיר חתיכה מלבנית נוספת של העור (ירוק). (ג) אל תגרד את כל שומן או רצועות שנותר על ידינע להב סכין המנתחים כפי שמצוין על ידי החץ ולייבש את המשטח לחלוטין עם Kimwipes ואוויר דחוס. (ד) דבק הודעה נירוסטה לגולגולת באמצעות דבק סופר. בר סולם במתייחס לספירה. (ה) השתמש במקדח שיניים כדי להפוך את ארבעה חתכים, לפי הסדר שצוין, כדי להסיר את חתיכה מלבנית של עצם (כחול), חושף את גרעיני exterolateral הקדמי ואחוריים (ELA וELP, בהתאמה) . לחץ כאן לצפייה בדמות גדולה.

איור 3. ניאון תיוג בגרעין exterolateral האחורי 3 שעות לאחר הזרקה של dextran מצומדות אלקסה פלואוריד 568. () גרעיני exterolateral הקדמי ואחוריים (ELA וELP, בהתאמה) דמיינו עם תאורה בשדה בהירה מלמעלה. פתקשmyelination הנרחב בתוך ELA נותן לו מראה בהיר יחסית, שמבדיל אותו מELP. (ב) אותו האזור דמיין באמצעות epifluorescence נצפה מבעד למסנן TRITC. (ג) שימוש בתמונה ממוזגת כחולה ל( brightfield) ואדום לB (TRITC). (ד ') דוגמה של ציור מוקטן של אלה וELP כולל כלי דם גדולים (קווים אדומים) שניתן להשתמש בם כציוני דרך לזהות את המיקום המדויק של אקסונים כותרת הנראים לעין רק בהגדלה גבוהה (מיקום המדויק של כלי דם משתנה מדג לדג). קו מקווקו מציין את הגבול בין ELA וELP. (ה) תמונות לדוגמה שנרכשה באמצעות מסנן TRITC מ5 תכשירים שונים הממחישים מגוון של דפוסי תיוג מוצלחים של האקסונים של תאים קטנים וsomas בELA.

איור 4. הקלטה תאית יחידה אחתמהאקסון שכותרת. () אלקטרודה הקלטה (ראש חץ) בלחץ חיובי ממוקמת סמוך האקסון תא קטן שכותרתו בELA (למעלה) רושם רק חפץ קצה (ראשי חץ) בתגובה ל100 msec / 20 ס"מ mV monophasic, נגדי חיובי, דופק כיכר רוחבי (תחתון). (ב ') משחרר לחץ החוצה מאלקטרודה (ראש חץ) גורם האקסון לנוע מעט לכיוון האלקטרודה (למעלה), אבל עדיין אין תגובות לגירוי (תחתון). ( ג) לחץ שלילי קל מושך את האקסון לאלקטרודה (ראש בראש החץ,) ופוטנציאלי פעולה בתגובה להופעת גירוי עכשיו גלויים (תחתון, כוכבית). חלקים תחתונים של כל שלושת הפנלים הם תגובות מעולפות עד 20 חזרות של הגירוי.

איור 5. נציג תוצאות שימוש בטכניקה זו. (א) 5 לדוגמה עקבותמראה פוטנציאל פעולה מעורר על ידי 0.1 msec / 6 ס"מ mV monophasic, נגדי חיובי, גירוי דופק כיכר רוחבי. (ב) סריקה עלילה מראה פעמים ספייק במהלך 20 חזרות של 75 אלפיות שני חלון הקלטה לאותה יחידת מגורה בשלב 0 עם 6 גירויי MV / ס"מ במגוון הרחב של המשכים מופיעים בצד ימין.) ג (עקומת כוונון משך כימות תגובות המוצגות בסריקה כקוצים להחזרת גירוי.

	מסה (ז)	אורך מזלג (ס"מ)	עומק גוף (ס"מ)
ממוצע	2.42	6.20	1.14
סטיית תקן	0.64	0.52	0.18
רכס	1.2-4.0	5.5-8.4	0.9-1.6

טבלת מס '1. אופטימלימשקל, אורך ועומק טווחי גוף לדגים. משקל אופטימלי, אורך מזלג (טיפ של חוטם למזלג של סנפיר הזנב) וגוף עומק (מרחק dorso-הגחון מקסימאלי במישור הרוחבי) נע מאפשר דגים שיתאימו בתא ההקלטה המאויר ב איור 1. דגים כי הם קטנים מדי עשויים להיות פחות סיכוי לשרוד את הניתוח ולא יהיה לי ELP קטן, מה שהופך את מיקום צבע מאתגר. דגים כי הם גדולים מדי יהיו לי המוח הקטן גדול, מעל לכת שיצמצם את הגישה לELA וELP ועלול למנוע הפחתה של כוח, מטרה קרובה מספיק כדי להתמקד בELA וELP הגבוה מים טבילה.

אתר יישום	סוג הצבע	דגים ניסו	תווית בELA	תווית בELP	יחידות ניסו	הקלטות
EL	אלקסה פלואוריד הזרקה	32	26 (81.2%)	19 (59.4%)	50	4 (8.0%)
ELA	אלקסה פלואוריד ספוג נייר סינון	1	0	0	0	0
ELA	Di-ב DMSO	8	6 (75.0%)	0	0	0
ELA	גבישי Di-O	5	3 (60.0%)	2 (40.0%)	9	0
ELP	גבישים מוצקים Alexa פלואוריד	2	0	2 (100%)	0	0
ELP	אלקסה פלואוריד חוטי טונגסטן מצופים	43	29 (67.4%)	41 (95.3%)	119	26 (21.8%)

טבלת 2. שיעורי הצלחה לכל שיטת הזרקת צבע. שיעורי הצלחה לכל שיטת הזרקת צבע. שיטות נחלקות מבוססות על הזריקה וסוג הצבע. לכל שיטה, המספר הכולל של דגים וניסה את אחוז הניסויים אלה שהביאו לתיוג מוצלח בELA וELP מוצג. שימו לב שאזור ההקלטה ממוקד הוא ההפך מאתר היישום (תיבות מודגשות). לאתר ההזרקה, ספיגת צבע שנחשבה מוצלחת עם התיוג של שני somas ואקסונים. לעומת זאת, באתר ההקלטה, הכנות רק עם אקסונים שכותרתו נספרות כתיוג ניסויים מוצלחים. המספר הכולל של יחידות ניסיונות ואחוז של יחידות אלה שהביאו להקלטות מוצלחות גם מוצגים.

	# של ההזרקה siTES	נפח ממוצע להזרקה (μl)	מגוון של כרכים להזרקה (μl)	נפח הזרקה כולל ממוצע (μl)	מגוון רחב של נפחי הזרקה כולל (μl)
Microinjector עם המילטון	3 או 4	0.144	0.091-.91	0.516	0.378-0.669
Nanoinjector עם זכוכית פיפטה	4 - 2	0.069 (קבוע)	נפח קבוע הזריק 1-6 פעמים	0.621	0.414-0.966
Microinjector עם זכוכית פיפטה	2 - 6	0.093	0.058-0.202	0.360	0.252-0.540

לוח 3. כמויות של צבע מיושמות לכל אחת משלוש השיטות המשמשות להזרמת אלexa פלואוריד לכמויות ELA של צבע המיושמות לכל אחת משלוש השיטות המשמשות להזרמת אלקסה פלואוריד לELA (שיטה ראשונה מטבלה 2). זריקת צבע לתוך ELA בוצעה עם שני nanoinjector וmicroinjector או באמצעות מחט 33 מד המילטון מזרק או טפטפת משך נימי זכוכית. אנחנו מגוונים במספר אתרי הזרקה, הנפח לכל זריקה והנפח הכולל של הזרקת צבע.

Discussion

ברגע ששולט, טכניקה זו תאפשר אחד למקד נוירונים שזוהו, לרבות אקסונים בודדים, עבור בהקלטות vivo במערכות מודל רבות. בנוסף, טכניקה זו מאפשרת להקליט פלט ספייק מנוירונים עם מאפיינים אנטומיים ייחודיים ההופכים מסורתית בשיטות הקלטת vivo מאתגרות באופן מהימן. יש לנו מנוצלים בטכניקה זו כדי להקליט מ" תאים קטנים "אלה, בדגי חשמל חלש mormyrid. הניסיונות קודמים כדי ללמוד את מאפייני הכוונון של "תאים קטנים" לא צלחו בשל תנאים מאתגרים הקלטה ^{11, 14.} תכונות אנטומיות דומות ליצור חסמים להשגת הקלטות יחידה אחת מחוליות רבות שמיעתי שונה ^ו8-10 נוירונים electrosensory. כדי להתגבר על האתגרים אלה במערכת שלנו, אנו ניצל את העובדה כי "תאים קטנים" הם התאים היחידים בELA כי פרויקט לELP. לפיכך, תחבורה מדרדר של צבע להציב ELP מגבילה תיוג בELA ל" קטןsomas התא "ואקסונים. תיוג ניאון של אקסונים אפשרו מיקום האלקטרודה מדויק ליד אקסונים שכותרתו, ביצוע הקלטות יחידה אחת מחוליות מזוהות אפשריות למרות somas נגיש. אנחנו ניסינו הקלטות גופניות, אבל לא הצליח, ככל הנראה בשל את הסינפסות שיבלעו ¹¹ שמסביב ^{, 17.} עם זאת, סומטי התיוג היה נראה בבירור שמראה כי טכניקה זו יכולה לשמש יעד הקלטות הסומטיים בסוגי תאים אחרים ומעגלים אחרים. תיוג פלורסנט של הנוירונים באמצעות תחבורה מדרדר in vivo שימש במשך מנחה הקלטות ממוקדות במבחנה ^19-21 . טכניקה דומה שימש לממוקד בהקלטות vivo מהנוירונים מוטוריים בחוט השדרה ²² דג הזברה. העבודה שלנו מייצגת התרחבות רומן של גישה זו, שבה גם תיוג וההקלטה נעשים in vivo בתוך המוח. השיטה שלנו מוכיחה כי in vivo תיוג של אזורים במערכת העצבים המרכזית עם לא מדרדרניתן להרחיב רוכב לחקר מעגלים שלמים אחרים עם נוירונים הקרנה דומה סלקטיבית. לדוגמה, בעיבוד שמיעתי יונקים, colliculus הנחות (IC) משמש כמרכז חשוב לממסר תשומות ממבנים מרובים rhombencephalic ^23. זריקת צבע לתוך IC הייתי סלקטיבי לתייג תאי הקרנה מכל אחד מגרעינים אלו. Colliculus מעולה (SC) משרת פונקציה דומה לחזון ^24. הכנות בעמוד השדרה מתאימות במיוחד גם לטכניקה זו, כפי שניתן לגשת בקלות בחוט השדרה, הזרקת צבע יכולה להתרחש רחוק מהאתר של ההקלטה, וזה יכול להיות בשילוב עם הקלטה תאית ומילוי של נוירונים בחרו לרכוש מידע אנטומי מפורט יותר ^25. לבסוף, בדרכי-Tracing הוא טכניקה מבוססת היטב בשימוש לאורך מערכת העצבים המרכזית כדי למפות מעגלים מורכבים ^26. יכולה להיות מנוצל השיטה שלנו להוסיף מידע פונקציונלי למחקרים הללו כפי שנעשה wמדדים בסידן רגיש ith בקליפת ראיית חתול ^27.

הניתוח, אשר הוא מבוסס היטב, אמין, ומשמש באופן קבוע לעיוורים in vivo הקלטות ^16, יש להשלים עם דימום מינימאלי ולא נגרם נזק לפני השטח של המוח כדי לאפשר לבעלי החיים ורקמות על מנת לשרוד. בעזרת תרגול, ניתן להשלים את יישום הניתוח ולצבוע ב30-45 דקות. אנחנו שכותרתו "קטנים האקסונים תא" בהצלחה ב67% מההכנות. רוב ההכנות רק 1 או 2 אקסונים שכותרת נראים לעין, אבל כמה יש רבות כמו 8. מיחידות 119 שכותרתו ניסו, השגנו הקלטות-יחידה אחת מ -26 יחידות שחולקו מעל 12 הכנות (טבלה 2). לפיכך, הנתונים נאספו מ -41% מתכשירי האקסונים שכותרת לשיעור הצלחה כולל של 28%.

ההיבט הקריטי של יישום לצבוע תיוג עומק. החדרה רדודה של חוט טונגסטן תגרום לצבע להיות דהוי AWאיי. עם זאת, אם החדירה היא עמוקה מדי, האקסונים שכותרתו לא יהיו גלויים למיקוד. יתר על כן, כמה נזק מכאני לתא חייב להתרחש לצבע שיש לנקוט במידה מספקת עד ^{25, 28.} עם זאת, נזק רב מדי יהרוג את התאים. אנחנו ניסינו תיוג עם צבעים אחרים ושיטות אחרות (טבלה 2), כוללים תיוג אנטרוגדית באמצעות הזרקת צבע לתוך ELA יחד עם הקלטה מהאקסונים שבכותרת ELP (לוח 3). אנו משערים כי תיוג אנטרוגדית לא היה מוצלח בגלל התיוג היה מוגבל לתאים עם נזק גופני, מה שהופך אותם להגיב. בנוסף, מסופים מראש סינפטיים ייתכן שיפריעו לו. בניגוד לכך, תיוג מדרדר ממזער את שני חששות אלה. הכמות והמיקום של יישום צבע יכולים להיות שונה בהתאם למעגל המסוים הנלמד. תיוג מקסימאלי מתרחש עם ריכוז הצבע הגדול ביותר, שהשגנו באמצעות חוטי טונגסטן מצופים. עם זאת, לתיוג אקסונים עם דהתחזיות EP, צבע עלולה לרדת מחט טונגסטן כפי שהוא מתקדם. במקרים אלה, הזרקה בלחץ תהיה מתאימה יותר. ספיגה והובלת דאי הן מהיר, עם אקסונים שכותרתו בהכנה שלנו להיות גלוי מוקדם ככל 2 שעות לאחר ההזרקה ואקסונים נוספים שכותרתו מופיעים מאוחר ככל 6 שעות לאחר ההזרקה. לכן, יכולים להיות מושלם תיוג וההקלטה ביום אחד, ומבטלים קשיים טכניים הקשורים לניתוח הישרדות. עיתוי ישתנה עבור כל יישום בהתאם למרחק הנדרש להובלת צבע.

עוד היבט קריטי הוא מיקום האלקטרודה. חשוב להיכנס לרקמות קרובים לאתר של האקסון שכותרתו כדי למנוע סתימה של הקצה. לרקמה צפופה כמו בELA, שוק ארוך, דק על האלקטרודה ההקלטה ממזער תנועה עודפת של רקמה הסובבת. אם הקלטה מוצלחת לא תושג בניסיון הראשון, חזרו עם אלקטרודות טריות עד הקלטה מתקבלת או TissUE מופר לנקודה שבה האקסון הוא כבר לא נראה לעין. עם זאת, חשוב גם למקם את האלקטרודה ליד האקסון במהירות כדי לצמצם את כמות חשיפת ניאון, אשר יכול לגרום phototoxicity, הלבנת ועשויה להשפיע על תכונות פיסיולוגיות של תא ^29-31.

ברגע שקטע של האקסון הוא שואב בהצלחה לאלקטרודה ההקלטה, ניתן להשיג הקלטות במשך כמה שעות. אם יחידות הולכות לאיבוד באופן עקבי בפחות משעה 1, לשקול ביצוע טיפים אלקטרודה קטנים יותר כדי למנוע את האקסון ממחליק החוצה. מצד השני, קטנה מדי מקצה עלול לגרום לסתימה, אות לרעש, או נזק נמוך לאקסון. ירידה מתמדת בספייק משרעת ו'השיבה 'של יחידה עם יניקה נוספת היא אינדיקציה לכך שהטיפ הוא גדול מדי. יותר מדי יניקה עלולה לגרום לניזק בלתי הפיך לאקסון. פתרון אחד הוא לאפשר דליפה קטנה בקו האוויר ולכן הלחץ לאט חוזר לאפס. מהירות השוואת הלחץ דואר יגרום "לדחוף" ביחס כלפי חוץ חולף שעלולים לגרש את האקסון.

למרות שטכניקה זו מהווה יתרון גדול עבור השגת הקלטות מתא עצב הקרנה ממוקדות שזוהה, זה לא יהיה שימושי להבחנה interneurons המקומי, כצבע יהיה תפוס על ידי כל סוגי התאים באזור ההזרקה. תיאורטית, השימוש בfluorophores מרובים עם אתרי הזרקה נפרדים עשוי לאפשר לשיטה זו יש להרחיב. לדוגמה, השוואה של יחיד לעומת כפול תיוג יכולה לשמש כדי להבדיל interneurons מנוירונים ההקרנה הבאים זריקות כפולות בשתי נקודות במעגל ^32. כמו כן, ניתן לשלב קליעים נותבים מדרדר עם טכניקות הדמיה מתקדמות אחרות, כגון הדמיה שני פוטונים, כפי שנעשה לאחרונה בזברה פינק גבוה ווקאלית המרכז (HVC) ^32. כמו כן, אזורי רישום מוגבלים לאלה קרובים לפני השטח בעת שימוש במיקרוסקופי epifluorescence, כפי שהיינו רק מסוגל לפתור 1 μ מבנים מ 'בתוך 30 מיקרומטר הראשון של רקמה. עם זאת, עומק זו ניתן יהיה להרחיב באמצעות השימוש בשיטות מיקרוסקופיה אחרות, כגון שני פוטונים במיקרוסקופ ³³ או אובייקטיבי מצמידי מיקרוסקופיה תאורת מישורי ^34. בסך הכל, בטכניקה זו מייצגת התקדמות חשובה בחקר מעגלים העצביים in vivo, כי זה יכול לשמש כדי להקליט מתא עצב בודד במעגלים שונים רבים במגוון רחב של מערכות מודל - כולל אלה שאינם נגישים באופן יחסי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine Methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Gallamine Triethiodide	Sigma-Aldrich	G8134	Flaxedil
Lidocaine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647
Hickman’s Ringer Solution	NA	NA	NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)
Peristaltic Pump	Gilson or Rainin	Minipulse 3 Model 312; RP-1	10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter
Dissection Microscope	Nikon	SM2645
Super Glue	Super Glue Corporation	SGH2	2g tube
Omni Drill 35	World Precision Instruments	503-598
Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4	World Precision Instruments	501860	0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm)
Low Temp Cautery Kit	World Precision Instruments	500391
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Dextran Conjugated Alexa Fluor 568	Invitrogen	D-22912	2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings
Epifluorescent Microscope	Nikon	E600 FN	A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths
Low Power Objective	Nikon	93182	CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm
High Power Objective	Nikon	93148	CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm
White Light Source	Dolan-Jenner	Model 190	Fiber Optic Illuminator
Fluorescent Light Source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q
Low-light Level Camera	Photometrics	CoolSnap ES
Digital Manometer	Omega Engineering	HHP-201
Motorized Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Headstage	Molecular Devices	CV-7B	Axon Instruments
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	Axon Instruments
Data Acquisition System	Molecular Devices	Digidata 1322A	Axon Instruments
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament
Pipette Glass	World Precision Instruments	1B100F-4	Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID)