逆行性蛍光標識は、特定された神経細胞から標的細胞外シングルユニット記録を可能にします<em生体内で&gt;</em

要約

蛍光色素ラベル解剖投影に基づくニューロンの亜集団の逆行性輸送。標識された軸索は、視覚的に対象とすることができます、識別された軸索から細胞外記録を可能にする。この手法は、ニューロンが遺伝子操作を通してラベルまたは 'ブラインド'を使用して分離することが困難であることができない場合に記録が容易アプローチ。

要約

この方法の全体的な目標は、ニューロンの識別集団から単一ユニット応答を記録することです。 生体内では個々のニューロンから電気生理学的記録は、神経回路が自然条件下でどのように機能するか理解するために重要である。伝統的に、これらの記録は記録セルのアイデンティティは記録の開始時は不明である意味、 'ブラインド'行われてきた。細胞のアイデンティティはその後細胞内juxtacellular ^1,2、または緩いパッチ染料の³イオン導入を介して決定することができるが、これらの記録は、機能的に不均一な細胞型と地域の特定のニューロンにあらかじめ対象とすることができません。蛍光タンパク質を視覚的に誘導単一細胞電気生理学^4-6を可能^にする細胞型特異的に発現させることができる。しかし、これらの遺伝のツールが利用できない者である多くのモデル系があります。でも、遺伝的にアクセス可能なモデル系で、目的のプロMOTERが不明であってもよいし、遺伝的に均一なニューロンは、投影パターンを変化させている可能性があります。同様に、ウイルスベクターは、投影ニューロンの特定の亜群^7を標識するために使用されているが、この方法の使用は、毒性およびトランス-シナプス特異性の欠如によって制限される。このように、 生体内で識別される単一のニューロンから記録するために特定のプレビジュアライゼーションを提供する付加的な技術が必要とされている。ターゲットニューロンのプリビジュアライゼーションは、古典的な単細胞レコーディングはしばしば^8-11極めて困難であるため困難な記録条件、特に便利です。迅速かつ選択的に標的と電気生理学的記録を取得するための視覚的な手がかりを提供し、独自の軸索投射に基づいて、特定の脳領域内の細胞の特定のサブセットを標識するためにタングステン針を使用して適用本稿で述べた新しい技術は、蛍光色素の逆行性輸送を使用しています無傷回路withiがで識別ニューロンからNAはCNS脊椎動物。

本手法の最も重要な新規な進歩は非遺伝子アクセス可能なモデル系における特定の細胞型を標的とする蛍光標識の使用である。弱電気魚は目を覚まし、行動動物¹²に神経回路を研究するための優れたモデルシステムである。私たちは弱い電気モルミルス科魚類の前方exterolateral核における "小さなセル"（ELA）によって感覚処理を研究するために、この手法を利用した。 "小細胞は"シナプス前スパイク¹³の到着時間のミリ秒以下の違いを検出するための重要な時間比較器ニューロンであることが仮定されている。しかし、このような緻密なミエリン、巻き込むシナプス、小細胞体としての解剖学的特徴は、それが極めて困難従来の方法^11,14を使用して、これらの細胞から記録するために行った。ここでは、信頼性の高い、堅牢な録音ます特性を考慮し、我々の新しい方法は、選択的に準備の28％にこれらの細胞を標識することを実証electrosensory刺激に対する応答のrization。

プロトコル

1。染料でコーティングされた針を準備

1. 電解160μmの直径のタングステンワイヤー^15をシャープに。ファイナル針先端径は5-50ミクロンの範囲であるべきである。必要な針数は、標識されたされている領域の大きさに依存します。我々は後部exterolateral核（ELP）に3-5注射用5針を用意しました。
2. 実験前の夜は、各針の先端が100μmに2mMのデキストラン共役アレクサフルーア10,000 MW色素の低下（<0.25μL）を配置。
3. 針が先端に集中染料を残して、室温で空気乾燥させ。 4℃で光からそれらを保護するために暗い容器に針を保管してください。

2。手術のために動物を準備

1. 水槽の水が300ミリグラム/ L MS-222の溶液中に魚を配置することによって全身麻酔を誘発する。
2. 魚や測定フォーク長（尾鰭のフォークに鼻の先端）とボディの深さ（最大背ventraを秤量横断面におけるL距離）。これらの測定は、魚が水浸系顕微鏡対物レンズ（ 図1）の下に配置するのに十分小さい記録チャンバ内に収まるように、表1に示す範囲内に入るべきである。
3. 固定化と電気的に背ボディ筋肉組織に3 mg / mlのflaxedilを100μlを注入することにより、魚を沈黙。
4. タンク水で記録室（ 図1A）を記入してください。室の中心（ 図1）プラットフォーム上で魚腹側を下に置きます。魚の口の中に配置されたピペットチップ（1-2 ml /分）を使用して、100 mg / Lで、MS-222の通気ソリューションを提供します。体（ 図1C）の両側に配置ワックスで固定棒で魚を安定させる。眼の血管と正常なボディカラーで連続血流をチェックして、魚の健康状態を監視します。
5. その長軸に沿ってプラットフォームを回転させplatfのバックエンドを下げる魚の体の残りの部分は沈めたまま魚の頭部の背面の一側は、水の上方に露出するようにORM。キムワイプの小片を乾燥を防ぐために、皮膚の任意の非沈め部に載置されるべきである。

3。手術（ 図2）

ここで説明する基本的な外科的処置は十分に確立し、確実にmormyrids ¹⁶におけるin vivoの録音でブラインドのために使用されます。他のアプリケーションでは、ラベリングと記録するため所望の領域を公開します。目的の細胞の軸索末端を含む領域は、染料でコーティングされた針で到達可能である必要があります。それらの同じ軸索のより近位のセグメントを含む領域は、水浸レンズ（この例では2ミリメートル）の作動距離に対応するために、組織上に十分なスペースを持っている必要があります。

1. Q-ティップを使用して、ヘッドの露出面にリドカイン0.4％溶液を適用します。
2. 手術用メスの刃を使用し、皮膚の矩形部分の周囲をカット。ピンセットを使って長方形を削除します。四角形のサイズは、魚のサイズが調整されますが、約3mm 6.2センチメートル魚（ 図2A）のためのX 5 mmでなければなりません。長方形の横方向のエッジが目の中心に合わせるべきで、長方形の前縁には、目にはただ後方であるべきであり、長方形の内側縁は、魚の正中線のすぐ横にする必要があります。
3. さらに2.5 mm角の非重複面積（ 図2B）を公開する前内側方向にさらさ頭蓋骨地域を展開します。
4. 完全に面（ 図2C）を乾燥させるために余分な組織とキムワイプと強制空冷を削り取るためにメス刃を用いて頭蓋骨の露出面をクリアして、乾燥させます。
5. スーパー接着剤を使用した前内側さらさ頭蓋骨領域に接着剤金属ポストを。接着剤は（ 図2D）完全に乾くまで待ちます。
6. 6.2センチメートル魚のために頭蓋骨、約2mm X 4mmの長方形を削除します。長方形の周囲を薄くする〜0.5ミリメートル直径ボールミルカーバイドチップで歯科用ドリルを使用してください。その後、メスや鉗子使用して、基本的な脳を露出するために長方形の周囲をカットし、それを剥がれ。追加の掘削や小さなハサミで切断が完全にELを（ 図2E）を公開する必要があるかもしれません。筋出血が発生した場合、電気焼灼装置を使用することができる。
7. 硬膜（色素沈着）と春のはさみや針を用い軟膜（クリア）の両方を切り取ると鉗子一対の切り込み部分を除去。 exterolateral核（EL）の前部と後部の部分は、今ではそれぞれELAとELP、（ 図3A）表示されます。

4。近郊の軸索の逆行性標識

1. interesの軸索を含む標的領域の上に染料でコーティングされた針（ステップ1で作成した）とマニピュレータを置き我々の場合ELPにおけるT、。
2. 迅速に組織に針約25μmのを挿入します。すべての染料がオフに来たまで15-30秒待ってから、針を引っ込める。
3. 色素が標的領域全体に分散されるように別の場所にそれぞれを配置し、必要に応じて追加の新鮮な針で繰り返します。我々は準備当たり3-5針を使用していました。
4. ヒックマンのリンゲル液で空洞から余分な染料を洗い流す。
5. 染料の取り込みと輸送のために少なくとも2時間待ちます。

5。近郊の軸索の可視化

1. 直立、固定ステージ落射蛍光顕微鏡の目的の下に、魚と一緒に、記録室を配置します。魚の体が光の浸透を塞ぐように、両方の白と蛍光灯光源は上から来なければなりません。頭蓋骨の空洞上記光ファイバ光源の注意深い配置は十分な明視野画像を可能にします。落射蛍光表示、蛍光フィルター用仕様は、色素の吸収/発光スペクトルと一致する必要があります。
2. 新鮮な水槽の水に呼吸を切り替え、同じ流量を維持する。露出した脳のキャビティ内にアース線を配置し、記録ヘッドステージのグランドに接続する（6.3参照）。
3. 尾の付け根に次の記録一対の電極を配置し、電子オルガンの排紙コマンド（EODC）を監視する差動増幅器と記録装置（ 例えば、オーディオモニタ、オシロスコープ、またはコンピュータ）に接続する。魚が麻酔から回復した後、EODCは魚の状態の指標として用いることができる。
4. 低倍率で見て脳領域のスケーリングされたスケッチを準備します。唯一の高倍率（ 図3D）の下に表示ラベル軸索の正確な位置を特定するためにランドマーク（魚から魚に変更になる場合があります）などの主要な血管を含む。
5. 染料の配置を確認してください。最初のオリエンテーションのために明視野照明と全体の組織を表示（ 図3A）。その後、蛍光灯照明（ 図3B）で表示します。 ELPは、びまん性ラベル（ 図3Bおよび3C）を持つことになります。色素の光力学と光毒性の影響を制限するために蛍光励起を最小限に抑えます。
6. 高倍率下ELAを検索するランドマークとして船舶を使用してください。表面付近のラベル軸索を捜している間蛍光灯で照らす。 （ 図4）。

6。外活動を記録

1. 1ミリメートルOD、フィラメントと0.58ミリメートルIDホウケイ酸ガラスキャピラリーを用いた吸引記録電極を引き出します。理想的なチップサイズは、我々の場合には¹⁷ 0.1〜0.2μmで、ターゲット軸索の直径に依存することになる。我々のアプリケーションの場合は、電極先端の直径は1.5だった±0.4ミクロン（範囲：1.0から2.4μm）を5ミリメートルの細長いシャンクと周囲の密集組織を移動せずにラベルの付いた軸索をアプローチするためである。
2. 電気を埋めるフィルタリングヒックマンのリンゲル液でtrodes。最終的なチップ抵抗は、45.2±38.0MΩ（：16から155MΩレンジ）です。
3. 圧力ポートと電極ホルダに電極を置き、マニピュレータに搭載されたアンプのヘッドステージに接続します。圧力ポートから圧力計とそれぞれ、圧力を監視し、制御するための注射器で終わるT字路への圧力ラインを実行します。
4. アンプヘッドステージとアナログ·デジタル取得装置を接続します。
5. 電極線で30ミリバール外側に圧力で、ラベルの付いた軸索の隣に電極を配置します。イメージングソフトウェアとインターフェイスで接続低照度レベルカメラは、ピペットの配置を視覚化するために使用される。組織表面付近に起動し、軸索に向かって電極を進める。あなたが軸索に近づくと、外向きの圧力が軸索のわずかな、しかし顕著な動きを起こすべきである。
6. 電極が強力な軸索 ​​、（ 図4A、トップ）レコードの横にある間テスト刺激（; 図1A私たちのケースでは、我々は20 MV / cmのの強度で100ミリ秒単相性の正と負の横方向のパルスを使用）を提示しながら電極でのIAL。電気アーティファクトが正しい記録/刺激（ 図4A、ボトム）を確認ものの、活動電位が観察されるべきではない。
7. 電極外側に圧力を解放し、刺激/録音を繰り返します。活動電位は、まだ（ 図4B）が観察されるべきではない。
8. 電極を繰り返し刺激/記録にわずかに（125±25ミリバール）吸引を適用します。活動電位は、現在の刺激（ 図4C）に対応して観察されるべきである。自発的な活動も発生することがあります。活動電位が観察されていない場合は、もう一度わずかな圧力、わずかに電極を移動し、試行吸引電極をクリアし、吸引力を解放します。活動電位が表示されていたら、圧力ラインを閉じます。
9. などを刺激し、記録希望。

7。終了および廃棄

1. 必要なすべての録音が完了したらEODCが停止するまで、100 mg / LでMS-222と呼吸に切り替えます。いいえEODCは、少なくとも10分間検出するべきではありません。
2. 制度的なガイドラインと承認された動物のケアのプロトコルに従って魚を廃棄。

8。代表的な結果

私たちの特定のアプリケーションのために、我々は中央の感覚ニューロンによってコーディング刺激を勉強に興味を持っています。標識された軸索から正常に記録が感覚刺激¹⁸に単体応答の分析を可能にする。 図5Aは 、記録チャンバの左右の壁の内側に位置する双極型電極を用いて横electrosensory刺激により誘発される代表的な活動電位を示す。スパイク時間はスパイクラスタプロット（ 図5B）として提示することができる。 25ミリ秒前刺激記録風OWは、自発的な活動の低レベルを示しています。この特定のELA "小細胞"はロングパス刺激持続時間が増加します（ 図5C）として繰り返し当たりスパイクの数を増やし、6 MV / cmで刺激強度で刺激時間に同調されている。平均最初のスパイクレイテンシは4.28±0.16ミリ秒、ELA ¹¹の小さな細胞の予想待ち時間と一致しています。

図1。固定ステージepiflourescent顕微鏡の目的の下に収まることができる記録室の仕様。トップ、サイドとバックビューを示すプレキシガラスから作られた（）へスケール平方記録室。周囲の刺激電極（アスタリスク）のペアのセットは、横方向（赤·黒​​）または縦のどちらか（青 - 黄）刺激を可能にします。中央（オレンジ）、内ゴムライニング穴と隅にプレキシガラスの追加部分、一定の水位を維持し、吸引ピペットを保持しています。チャンバーの底にねじ込まつの垂直ステンレスポスト（緑色）アジャスタブルディスククランプを介して魚を（ライトグレー、Cで詳述）をサポートしているプラットフォームに接続されているステンレス製の支柱（緑色の輪郭）に接続します。室の写真をツースケール図面の下に表示されます（B）円形のプラスチックのディスククランプの個人および組み立てられたビューは垂直ポストにプラットフォームを固定するために使用される。各ディスククランプはねじ締めのためのポストと中心穴用の溝を（緑）があります。溝は互いに直交するように、ディスク·クランプ回転させる。プラットフォームのさらなる垂直および回転運動を防ぐために、ネジ（赤）クランプの場所で記事を締め。場所で魚を保持するために使用されるプレキシガラスプラットフォームの（C）フロントとサイドにスケールのビューが。プラットフォームは、木製DOWEを保持しているパラフィンワックス層（青色）で被覆されている魚をサポートするための場所でLS（黒いバー）。魚をrespiratingためのチューブは、魚の口の中に置かれたピペットチップでプラットフォームと両端の 'ヘッドボード'の穴を通過する。ステンレススチールヘッドのポストは（灰色のバー）360度の回転を可能にボールジョイントを介してプラットフォームに接続します。ステンレス鋼水平支柱（緑）は、プラットフォームのいずれかの端にねじ込まれる。 大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図2。手術の概略は、頭の背面を見下ろし。（A）は 、皮膚の長方形のピース（赤）を除去するために、順番に示されている4つのカットをします（B）前内側方向に追加の長方形の部分を削除するために開口部を拡張皮膚の（緑）、（C）で、残りの脂肪や靭帯をこすり落とす矢印で示したとキムワイプと強制空気で完全に表面を乾燥さとして。（D）接着剤は、ステンレス鋼のポスト、スーパー接着剤を使って頭蓋骨にメスの刃を動かす。でスケールバーは、ADにも適用されます（E）（それぞれELAとELP）、前部と後部exterolateral核を露出させ、骨（青）の長方形の部分を削除するには、順番に示されている4つのカットを作るために歯科用ドリルを使用して、 。 より大きい数字を表示するには、ここをクリックしてください 。

図3。 3時間デキストラン共役アレクサフルーア568の注入後の事後exterolateral核における蛍光標識（A）前部と後部exterolateral核は（ELAとELP、それぞれ）上から明視野照明で可視化。注意ELA内広範髄鞘形成はそれにELPからそれを区別する比較的明るい外観を与えることを確認します（B）は 、同じ領域がTRITCフィルターを通して見落射蛍光を用いて可視化した。Bについて（明）と赤のために青使って（C）の合成画像唯一の高倍率（血管の正確な位置の下に表示ラベル軸索の正確な位置を特定するために目印として使用することができ、主要な血管（赤線）を含む、ELAとELPの縮尺図面の（TRITC）（D）例）魚から魚ごとに異なります。点線はELAとELPの境界を示しています（E）サンプル画像はELAで小細胞軸索と細胞体の正常なラベルパターンの範囲を示す5つの異なる調製物からTRITCフィルタを使用して取得しました。

図4。シングルユニットの細胞外記録ラベルの付いた軸索から。正圧下（）記録電極（矢頭）はELA中の標識小細胞軸索（上）に隣接して配置され、100ミリ20 MV / cmの相性に応じてのみエッジアーティファクトを（矢頭）を記録反対陽性、横方形パルス（下）。（B）電極（矢頭）から解放外側への圧力は軸索が電極に向かってわずかに移動させる（上）が、刺激（下）への回答はまだありません。（ C）わずかな負圧が刺激開始に反応して電極に軸索（上部、矢頭）と活動電位を引っ張る（下、アスタリスク）が表示されます。すべての3つのパネルの底部には、刺激の20回の繰り返しに重ね応答である。

図5。この技術を用いて代表的な結果。（5）サンプルトレース0.1ミリ秒6 MV / cmの単相、対陽性、横方形パルス刺激により誘発される活動電位を示す。（B）ラスタープロットは6時間0で刺激を受けた同ユニットは75ミリ秒の記録ウィンドウの20回の繰り返しの間にスパイク倍を示す右側にリストされている期間の範囲でMV / cmの刺激。（C）期間同調曲線は、刺激の繰り返し当たりスパイクとしてラスタに表示応答を定量化。

	質量（g）	フォーク長さ（cm）	ボディー奥行き（センチ）
平均	2.42	6.20	1.14
標準偏差	0.64	0.52	0.18
範囲	1.2から4.0	5.5から8.4	0.9から1.6

表1。最適な体重、魚のための長さと体の深さの範囲である。最適な重量、フォーク長（尾鰭のフォークに鼻の先端）と体深さが（最大背腹横断面の距離）魚に示す記録室にフィットすることができる範囲図1。小さすぎる魚は染料配置が困難なこと、手術を生き残るために、小さなELPを持つことになりにくいかもしれません。大きすぎる魚はELAとELPへのアクセスを減らすことになり、ELAとELPに集中するのに十分近い高電力、水浸対物レンズの低下を防ぐことが、大規模で過剰遠大小脳を持つことになります。

適用部位	染料タイプ	魚試み	ELA内のラベル	ELPでラベル	単位は試み	録音
ELA	アレクサフルーア注射	32	26（81.2パーセント）	19（59.4パーセント）	50	4（8.0％）
ELA	アレクサフルーアは、ろ紙を浸し	1	0	0	0	0
ELA	DMSO中のジ-I	8	6（75.0％）	0	0	0
ELA	ジ-O結晶	5	3（60.0％）	2（40.0％）	9	0
ELP	固体アレクサフルーア結晶	2	0	2（100％）	0	0
ELP	アレクサフルーアコーティングされたタングステン線	43	29（67.4パーセント）	41（95.3％）	119	26（21.8％）

表2。各色素注入法の成功率。各色素注入法の成功率。方法は注射部位及び染料の種類に基づいて分割されている。それぞれの方法については、魚の総数が試みられELAとELPに成功した標識をもたらしたこれらの実験の割合が示されている。ターゲット記録領域が適用部位（太字箱）の反対であることに注意してください。注射部位については、染料取り込みは細胞体と軸索の両方のラベルで成功したと考えられていた。対照的に、記録部位に、標識軸索でのみ製剤が成功した標識実験として計数した。試行単位の総数の成功をもたらした録画これらの単位の割合も示されている。

	＃注射のSiTES	注入あたりの平均量（μL）	注射あたりボリュームの範囲（μL）	平均総注入量（μL）	総注入量の範囲（μL）
ハミルトンとマイクロインジェクター	3または4	0.144	0.091から0.91	0.516	0.378から0.669
ガラスピペットを用いてナノインジェクタ	2から4	0.069（固定）	固定されたボリュームは1-6回注入	0.621	0.414から0.966
ガラスピペットを用いてマイクロインジェクター	2から6	0.093	0.058から0.202	0.360	0.252から0.540

表3。アルミニウムを注入するために使用される3つの方法のそれぞれに適用される染料の量ELA（ 表2から最初の方法）にアレクサフルーアを注入するために使用する3つの方法のそれぞれに適用された染料のELAの数量にEXAフルーア。 ELAへの色素注入のいずれか33ゲージのハミルトン注射針又は引っ張らガラスキャピラリーピペットを用いてナノインジェクタやマイクロインジェクターの両方を行った。我々は、注射部位の数、注入あたりの​​体積と染料噴射の総体積を変化させた。

ディスカッション

一度習得し、この手法は1つが多くのモデル系におけるin vivoでの録音のために個々の軸索を含む識別ニューロンを、ターゲットにできるようになります。さらに、この技術は1つが確実に挑戦インビボ記録方式で行う従来のユニークな解剖学的特徴を有するニューロンのスパイク出力を記録することができる。私たちは、モルミルス科弱電気魚でELA "小さなセル"から録音するために、この技術を利用してきた。 "小さなセル"のチューニング特性を研究するための以前の試みは、挑戦的な記録条件^11、14のために失敗した。類似の解剖学的特徴は、多くの異なる脊椎動物聴覚とelectrosensoryニューロン^8-10から単一のユニットの録音を得るための障壁を作成します。我々のシステムでこれらの課題を克服するために、我々は "小さな細胞が" ELPのプロジェクトそのELAで唯一の細胞であるという事実を利用しました。したがって、ELPに置か色素の逆行輸送は "小さなにELAでラベリング制限セル"細胞体と軸索。軸索の蛍光標識にはアクセスできなくSOMAのにもかかわらず、可能性識別細胞から単一ユニット記録を作り、ラベルの付いた軸索の隣に正確な電極配置を可能にした。私たちは、周囲を巻き込むのシナプス¹¹のため、おそらく、体の録音を試みたが、成功しなかった^、17があるが、体ラベリングは、この技術は、他の細胞型と他の回路の不定記録を標的化するために使用され得ることを示唆してはっきりと見えた。in vivoでの逆行輸送を介してニューロンの蛍光標識は、 インビトロ ^19-21 に標的記録を案内するために使用されている。類似の技術はゼブラフィッシュ脊髄²²で運動ニューロンからin vivoでの録音の対象に使用された。私たちの仕事はラベリングと記録の両方が脳内で生体内で行われているこのアプローチの新規拡大を表し、私たちの方法は、生体内であることを示してい逆行tと共に中枢神経系領域のラベリングレーサーは、同様に選択的な投影ニューロンを持つ他の無傷の回路の研究に拡張することができます。例えば、哺乳類の聴覚処理で、下丘（IC）は、複数の菱脳構造²³からの入力のための重要な中継センターとして機能しています。 ICへの色素の注入が選択的にこれらの核のそれぞれから投影細胞を標識だろう。上丘（SC）は、ビジョン²⁴と同様の機能を提供しています。脊髄調製物が特に良く、この技術に適している、脊髄が容易にアクセスされるように、色素注入は、記録部位から遠くに発生することができ、それは、より詳細な解剖学的情報^25を取得する選択ニューロンの細胞内記録と充填と組み合わせることができる。最後に、管·トレースは複雑な回路^26をマッピングするために、中枢神経系全体で使用されるよく確立された技術である。我々の方法は、wを行われているように、これらの研究に機能情報を追加するために利用することができるネコ視覚野²⁷のi番目のカルシウム感受性の指標。

十分に確立されている手術は、信頼性が高く、定期的にin vivoでの録音¹⁶ でブラインドに使用、最小限の出血や動物と生き残るために組織を可能にするため、脳の表面にダメージなしで完了しなければならない。練習すれば、手術と染料アプリケーションが30-45分で完了することができます。我々は成功した準備の67％で、 "小細胞"軸索のラベルが付いた。ほとんどの準備はわずか1または2目に見えるラベル軸索を持っているが、一部は8できるだけ多く持っている。試み119ラベル単位の、私たちは12製剤（ 表2）上に分散26台から単一ユニット記録を得た。従って、データは、25％の全体的な成功率のために標識された軸索を有する製剤の41％から採取した。

染料アプリケーションの重要な側面は、深さをラベリングされています。タングステン線の浅い挿入を洗浄AWという染料になりますAY。浸透が深すぎる場合は、ラベルの付いた軸索は、ターゲティングのために表示されません。さらに、細胞にはいくつかの機械的な損傷が十分に^25、28に取り込まれるように染料のために発生する必要があります。しかし、あまりにも多くの被害は、細胞を殺すでしょう。我々は、他の染料やELP中の標識軸索（ 表3）からの録音とペアELAに染料注入を通じて順行性ラベルなどの他の方法（ 表2）で標識試み。ラベルはそれらが応答しなくなり、体細胞の損傷を持つ細胞に限られていたので、私たちは順行性ラベルが成功しなかったと仮定。さらに、シナプス前端末が邪魔されている可能性があり。これとは対照的に、逆行性標識は、これらの懸念の両方を最小限に抑えます。染料塗布量と位置が検討されて特定の回路に応じて変更することができる。最大のラベルは、我々がコーティングされたタングステン線を使用して達成する最大の色素濃度、で発生します。しかし、デと軸索を標識するそれが進んでいるようにEP予測は、染料は、タングステン針をオフに来るかもしれない。これらのケースでは、圧力注入がより適切であろう。染料の取り込みと輸送は2時間後に注射し、6時間後に注射限り遅く現れる追加ラベル軸索には早くも目に見えるある私達の準備中の標識軸索で、迅速です。従って、標識および記録が生存手術に伴う技術的な問題を排除し、一日で達成することができる。タイミングは、染料の輸送のために必要な距離に応じて、アプリケーションごとに異なります。

もう一つの重要な側面は、電極の配置である。これは、先端の目詰まりを防ぐために、ラベルの付いた軸索のサイトへの組織の近くに入ることが重要です。などELAのよう高密度組織の場合は、記録電極上に長い、細いシャンクは、周囲の組織の過剰な動きを最小限に抑えることができます。成功した記録が最初の試みは、記録が得られるまで、新たな電極を有する繰り返し又はTISS上で達成されていない場合UEは、軸索は、もはや表示された時点に中断されます。しかし、すぐに漂白光毒性を引き起こす可能性蛍光露光、の量を最小限にし、セル^29-31の生理学的特性に影響を及ぼす可能性軸索の横に電極を配置することも重要である。

軸索のセグメントを正常に記録電極に吸引されると、記録が数時間にわたって得ることができる。ユニットは常に1時間未満で失われている場合、抜け軸索を防ぐために、より小さい電極チップを作って検討してください。一方、先端の小さすぎには軸索に詰まり、低い信号対雑音比、または損傷につながる可能性があります。追加の吸引ユニットのスパイク振幅の着実な減少と 'リターン'先端が大きすぎることを示しています。多すぎると吸引軸索に取り返しのつかないダメージを与えることがあります。一つの解決策は、圧力が徐々に0に戻るように空気ラインに小さな漏れを可能にすることである。急速にイコライジング番目電子圧力が軸索を追放することが一時的な相対外側 'プッシュ'になります。

この技術は識別された投射ニューロンからターゲットの記録を得るための主要な利点であるが、色素を注射部位でのすべての種類の細胞によって取り込まれるように、それは、ローカル介在を区別するために有用ではありません。理論的には、別個の注入部位を持つ複数の蛍光体の使用は、この方法を拡張することを可能にすることができる。例えば、単一の対二重標識の比較回路³²の2つの点で二重注射後に投射ニューロンからニューロンを区別するために使用することができる。同様に、逆行性トレーサーはキンカチョウハイボーカルセンター（HVC） ^は32で、最近行われたような二光子イメージングなど他の高度なイメージング技術、と組み合わせることができます。落射蛍光顕微鏡を使用しているとき、我々は唯一の1＆を解決することができたとしても、記録領域は、表面付近のものに限定されているムー、組織の最初の30ミクロンm以内の構造。しかし、この深さは、このような二光子顕微鏡³³又は対物結合面状照明顕微鏡³⁴のような他の顕微鏡技術の使用を介して拡張することができる。相対的にアクセスできないものも含め、 -それはモデル系の様々な多くの異なる回路における単一ニューロンから記録するために使用することができるので、全体として、この技術は、in vivoで神経回路の研究において重要な進歩を表している。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Tricaine Methanesulfonate	Sigma-Aldrich	E10521	MS-222
Gallamine Triethiodide	Sigma-Aldrich	G8134	Flaxedil
Lidocaine Hydrochloride	Sigma-Aldrich	L5647
Hickman’s Ringer Solution	NA	NA	NaCl (6.48 g/l), KCl (0.15 g/l), CaCl2•2H20 (0.29 g/l), MgSO4 (0.12 g/l), NaHCO3 (0.084 g/l), NaH2PO4 (0.06 g/l)
Peristaltic Pump	Gilson or Rainin	Minipulse 3 Model 312; RP-1	10.0 ± 1.0 rpm, Alternatively, a gravity-fed line with a flow-meter
Dissection Microscope	Nikon	SM2645
Super Glue	Super Glue Corporation	SGH2	2g tube
Omni Drill 35	World Precision Instruments	503-598
Ball Mill Carbide Drill Bit #1/4	World Precision Instruments	501860	0.19 DIA (bit diameter = 0.48 mm)
Low Temp Cautery Kit	World Precision Instruments	500391
Manual Micromanipulator	World Precision Instruments	M3301R
Dextran Conjugated Alexa Fluor 568	Invitrogen	D-22912	2mM concentration; 10,000MW The choice of dye wavelength should be selected to match the microscope filter settings
Epifluorescent Microscope	Nikon	E600 FN	A remote focus accessory is helpful for fine focus TRITC filter - or appropriate filter to match focal planes for different dye wavelengths
Low Power Objective	Nikon	93182	CFI Plan Achromat Series, 4X N.A. 0.1, W.D. 30mm
High Power Objective	Nikon	93148	CFI Fluor Series, 40X WI N.A. 0.8, W.D. 2.0 mm
White Light Source	Dolan-Jenner	Model 190	Fiber Optic Illuminator
Fluorescent Light Source	Lumen Dynamics	X-Cite 120Q
Low-light Level Camera	Photometrics	CoolSnap ES
Digital Manometer	Omega Engineering	HHP-201
Motorized Micromanipulator	Sutter Instruments	MP-285
Headstage	Molecular Devices	CV-7B	Axon Instruments
Amplifier	Molecular Devices	MultiClamp 700B	Axon Instruments
Data Acquisition System	Molecular Devices	Digidata 1322A	Axon Instruments
Isolated Pulse Stimulator	A-M Systems	2100
Flaming/Brown Micropipette Puller	Sutter Instruments	P-97	Program settings for our application: Heat: ramp + 1, Pull: ’0’, Velocity: 60, Time: 90 Box filament
Pipette Glass	World Precision Instruments	1B100F-4	Borosilicate capillary glass with filament (1 mm OD, 0.58 mm ID)