בדיקה קלינית הסרת חוט השדרה במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS)

Summary

במודל של עכברים של טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) נבחן קלינית התנהגותית. כתנאי ניתוח immunohistological נלווה להכנת חוט השדרה מתואר בפירוט.

Abstract

טרשת לרוחב amyotrophic (ALS) היא מחלת ניוון עצבים קטלנית והתוצאה היא ניוון הדרגתי של motoneurons. השיא של התפרצות הוא סביב 60 שנה למחלה סדירה סביב 50 שנה למחלה משפחתית. בעקבות הקורס המתקדם שלה, 50% מהחולים מתים תוך 30 חודשים של תחילת הסימפטומים. על מנת להעריך אפשרויות טיפול חדשות למחלה זו, מודלים העכבר הגנטיים של ALS נוצרו על בסיס מוטציות משפחתיות האדם בגן SOD, כמו מוטציה SOD1 (G93A). ההיבטים החשובים ביותר שיש הערכה במודל הם בסך הכל, הישרדות כמובן קלינית בתפקוד המוטורי. הנה, אנחנו מדגימים את הערכה קלינית, להראות ההולכה של שתי בדיקות רכב התנהגותיים ולספק מערכות הבקיע כמותיים על כל הפרמטרים. כי בניתוח מעמיק של המודל העכבר ALS בדרך כלל דורש בדיקה immunohistochemical של חוט השדרה, אנחנו מדגימים את הכנתה בפירוט החלת לעשותlaminectomy rsal השיטה. הממצאים היסטולוגית למופת הם הפגינו. יישום מקיף של שיטות הבדיקה המתואר מחקרים על מודל עכברים של ALS יאפשר חוקר באופן אמין לבחון אפשרויות טיפוליות עתידיות אשר יכול לשמש בסיס ניסויים קליניים בבני אדם אחר כך.

Protocol

בעלי חיים נרכשו מ ג'קסון המעבדה (# 002726) ^1. הם קלעו קלינית נתון הבדיקה של המנוע הפונקציה (rotarod מבחן) ושל כוח השרירים (תלוי במבחן תיל). כל הבדיקות האלה לבין הרג של בעלי חיים מאוחר יותר, על מנת להכין את חוט השדרה בוצעו בהתאם קרוב מאוד ההנחיות מקומיים לניהול נכון של ניסויים בבעלי חיים.

1. ציון קלינית

מלבד הערכה של עכברים משקל הגוף נבחנים סימנים של הגירעון מנוע עם מערכת הנקודה הבאה 4 הבקיע ^2:

4 נקודות: רגילות (שום סימן של חוסר תפקוד המנוע)

3 נקודות: רעד בגפיים האחוריות ניכרים כאשר תנאי בזנבו

2 נקודות: הפרעות בהליכה נוכחים

1 נקודה: גרירה של איבר אחד לפחות האחורית

0 נקודה: סימטרי , שיתוק וחוסר יכולת הזכות עצמה או הפסד של 20% ממשקל הגוף לכל היותר, במקרה זה את בעלי החיים מומתים מיד את הניסוי הסתיים

2. בדיקות של תפקוד מוטורי וכוח שרירים

תלוי חוט

בדיקה זו משמשת להערכת כוח שרירי ^{3, 4.} כל בעלי החיים לבצע את הבדיקה לפחות יום או יומיים לאחר הבדיקה rotarod. כל העכבר ממוקם על המכסה מחוייט עם חוט במרווחים של 0.8 ס"מ ובזהירות התהפך, 60 ס"מ מעל קש מכוסה התחתונה. אחרי האימון במשך שלוש פעמים רצופות של לפחות 180 של חביון ליפול נמדד. עכבר זה ניתנת עד שלושה ניסיונות לקיים על מכסה הפוך לתקופה מקסימלית של 180 וה התקופה הארוכה ביותר נרשם.

Rotarod מבחן

s = "jove_content"> מנגנון rotarod (אוגו באזיל, Comerio, איטליה) שימש למדידת בתיאום המנוע, איזון המנוע יכולת הלמידה ^{3, 4.} ביצועים טובים דורש רמה גבוהה של תיאום הסנסורית. המכשיר צריך להיות ממוקם בסביבה שלווה ולא מטרידה, כדי למנוע גירויים distractive עבור בעל החיים נבדק. הוא מורכב ציר המנוע מונע מבוקרת מחשב מסתובב וחמישה נתיבים חמש עכברים. פולס של העכברים מזוהים אוטומטית על צלחת פלסטיק בחלק התחתון של לחץ. אחרי האימון במשך שלוש פעמים רצופות של של לפחות 180 במהירות קבועה של 15 סל"ד הזמן שבו בעלי חיים יכול להישאר על מוט מסתובב נמדד. כל חיה עוברת שלושה ניסיונות ההשהיה הארוכה ביותר בלי ליפול נרשם. בזמן של 180 נבחר זמן גיזום ', כי רוב הבדלים משמעותיים תיאום מנוע מזוהים במסגרת הזמן הזה.

3. חוט השדרה הכנה

1. בעלי חיים נהרגים על ידי הפחה ₂ CO בהתאם להנחיות המקומיות ושהם perfused מיד transcardially פתרון PBS ואחריו פתרון paraformaldehyde 4%.
2. על מנת להכין את חוט השדרה של העכבר הקריב, חיה ממוקם על שולחן הניתוח ואת ארבעת הגפיים קבועים בצד כדי לחשוף את הצד האחורי של העכבר.
3. כביסה קצר עם פתרון אתנול 70% מנקה את האתר של דיסקציה ומשטחת את המעיל שיער.
4. לאחר מכן העור חקוק באיזמל חד של הקו החציוני. על מנת להקל על חיתוך העור נמתח על שני הצדדים. אם שרירי הרגליים יהיה מוכן, העור שלהם גם להיות חקוק.
5. לאחר חיתוך העור הושלמה, הוא הסיט עם זוג פינצטה לחשוף fascia השטחית הבסיסית של הגוף.
6. שרירי הצוואר רצועה עורפית צריך להסיר והם CAמוכן refully. היזהר שלא לחתוך את חבל הטבור עמוק פגיעה בעמוד השדרה. שרירי הכתף ניתן גם להסיר על מנת לחשוף טוב יותר את עמוד השדרה.
7. אז השרירים paravertebral יוסרו עמוד השדרה כולו.
8. על מנת לפתוח את laminectomies עמוד השדרה כמה צריך להתבצע. יש להתחיל מהחלק העליון גולגולתי באתר של מפרק atlanto-העורפית.
9. זה הכי קל להסיר את קיבוע של שתי גפיים עליונות ו להתמתח יתר על המידה את הצוואר כדי להיות מסוגל יותר לבצע את laminectomy חוליות 1. אלה התרחקה בלי לגעת בחוט השדרה חשוף צוואר הרחם.
10. חוליות יותר יוסרו על ידי 1 חוצים את קשתות בחוליות בשני הצדדים עם מספריים בזווית ואז מושך את התהליכים הגב. חלקים לרוחב הנותרים של החוליות יש להסיר כדי להקל מאוחר יותר הסרה מלאה של חוט השדרה.
11. ציון דרך האנטומי של שדרה מותניכבל אני הוא עבוי כי נוכחת גם חוט השדרה הצווארי.
12. כשסיים laminectomy של חוט השדרה כולו, ודא כי אתה גם transect כל השורשים הגחון ולשחרר את חוט השדרה של מאטר דורה של קרומי המוח את.
13. אז חוט השדרה הצווארי הוא חתך cranially ואתה מתחיל להסיר את חוט השדרה.
14. לבסוף חוט השדרה הוא חתך גם דיסטלי cauda-equina להשתחרר לחלוטין.
15. בסופו של דבר, חוט השדרה ממוקמת בפתרון postfixating (paraformaldehyde למשל 4%) במשך הלילה יכול להיות מעובד יותר. בדרך כלל אנחנו cryosection חוט השדרה להכין אותו לניתוח immunohistological.

4. נציג תוצאות

הטכניקה של הכנת חוט השדרה מהווה את המוקד של מאמר זה וידאו. זהו תנאי הכרחי חתך ברקמת מאוחר יותר, ובסופו של דבר לניתוח immunohistological של ספינהחוט וסעד חלקים. כדוגמה התוצאה הסופית, הבדיקות immunohistochemical האזור הקרן הקדמית של חוט השדרה המותני של העכבר wildtype (WT) של SOD G93A transgene (TG) העכבר באה לידי ביטוי. הנוירונים המוטוריים ניתן לזהות נוגדנים נגד דברו הראשי וסימון ניאון לאחר מכן עם נוגדנים Cy3 משני. בנוסף, גרעיני נגד כתם עם DAPI (4,6-diamidino-2-phenylindole) שבוצעה (איור 1).

באיור 1. Photomicrographs פלורסנט חזותי immunodetection של motoneurons עם נוגדן אנטי דברו (אדום) ואת גרעין הסלולר נגד כתם ידי DAPI (כחול) קרן חוט השדרה המותני העכבר הקדמי של wildtype (ט) (משמאל) ושל SOD G93A מהונדס (TG) (מימין) העכבר בגיל 130 ימים. סרגל קנה מידה: 40 מיקרומטר.

כמו ניתוח immunohistochemical שלאת SOD בעכברים G93A אינו היקף העיקרי של מאמר זה יש לפנות את הפרסום המקורי, שבו אלה העכברים הטרנסגניים אופיינו ואת אלה האחרונים יותר, ללמוד גישות טיפוליות לעיון נוסף ^{1, 5, 6.} אם השפעות טיפוליות יהיו מובחנים ברמה immunohistological מוגדר אלגוריתמים הערכה כמותית יש להחיל נתמך על ידי תוכנת stereological (לדוגמה לראות ^7).

Discussion

המודל (G93A) SOD1 העכבר הגנטי הוא מודל בעל חיים בעל ערך לחקור את מהלך המחלה של אובדן motoneuron מתקדמת להשוות טרשת האנושי לרוחב amyotrophic ^8. מגוון של פרדיגמות טיפול שונות הוערכו במודל זה ולייצג הבסיס לאחר מכן לבצע בדיקה קלינית ^8-10 מחקרים בבני אדם. כדי להיות מסוגל לזהות ה?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
	יצרן	הזמנת מידע
ההתנהגות בדיקה
רוטה-Rod של עכברים	אוגו באזיל, Comerio, איטליה	# 47600
תלוי במכשיר תיל	מחוייט
חוט השדרה הכנה
מבצע טבלה מבצע מנורה כפפות מגן
"איריס" מספריים, מוטה הצידה	מדע כלים עדינים, היידלברג, גרמניה	14063-09
כוהן-Vannas אביב מספריים, ישרים	מדע כלים עדינים, היידלברג, גרמניה	15000-10
מיקרו מלקחיים	Hammacher, Solingen, גרמניה	HWC 111-10
אזמל "präzisa פלוס"	Dahlhausen, קלן, גרמניה	11.000.00.510, איור 10