Test clinici e la rimozione del midollo spinale in un modello murino di sclerosi laterale amiotrofica (SLA)

Riepilogo

Un modello murino per la sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una valutazione clinica e comportamentale. Come prerequisito per un'analisi accompagnamento immunoistologico la preparazione del midollo spinale è raffigurato in dettaglio.

Abstract

La sclerosi laterale amiotrofica (SLA) è una malattia neurodegenerativa letale con conseguente progressiva degenerazione dei motoneuroni. Il picco di insorgenza è di circa 60 anni per la malattia sporadica e circa 50 anni per la malattia familiare. Grazie al suo andamento progressivo, il 50% dei pazienti muore entro 30 mesi dall'inizio dei sintomi. Per valutare nuove opzioni di trattamento per questa malattia, modelli murini di SLA genetici sono stati generati sulla base umani mutazioni nel gene familiari SOD, come la (G93A) mutazione SOD1. Aspetti più importanti che devono essere valutati nel modello sono la sopravvivenza globale, decorso clinico e la funzione motoria. Qui, dimostriamo la valutazione clinica, mostrano la conduzione di due test del motore comportamentali e fornire sistemi di punteggio per tutti i parametri quantitativi. Poiché un'analisi approfondita del modello murino ALS di solito richiede un esame immunoistochimica del midollo spinale, abbiamo dimostrato la sua preparazione in dettaglio l'applicazione del farelaminectomia metodo rsal. Esemplari risultati istologici sono dimostrati. La completa applicazione dei metodi di esame descritti negli studi sul modello murino di SLA consentirà al ricercatore di verificare in modo affidabile per future opzioni terapeutiche che possono fornire una base per le sperimentazioni cliniche umane successive.

Protocollo

Gli animali sono stati acquistati da Jackson Laboratory (# 002.726) ^1. Essi sono clinicamente segnato e sottoposto ad un test di funzionamento del motore (rotarod test) e della forza muscolare (appesa prova del filo). Tutti questi test e il successivo abbattimento degli animali al fine di preparare il midollo spinale sono stati eseguiti in accordo molto vicino alle linee guida locali per corretto svolgimento degli esperimenti sugli animali.

1. Punteggio clinico

Oltre alla verifica del peso corporeo per i topi vengono esaminati i segni di deficit motorio con il seguente sistema di quattro punti di punteggio ^2:

4 punti: normale (nessun segno di disfunzione motoria)

3 punti: tremori agli arti posteriori sono evidenti quando sospesa per la coda

2 punti: sono presenti anomalie dell'andatura

1 punto: trascinamento di almeno un arto posteriore

0 punti: simmetricaparalisi, incapacità di destra stessa o perdita del 20% del peso corporeo massimo, in questo caso gli animali vengono sacrificati ed immediatamente l'esperimento viene interrotto

2. Test della funzione motoria e della forza muscolare

Appeso filo

Questo test viene utilizzato per valutare la forza muscolare ^{3, 4.} Tutti gli animali eseguire questo test almeno uno o due giorni dopo la prova rotarod. Ogni mouse è posizionato su una misura coperchio filo con intervalli di 0,8 cm e con cautela capovolto, 60 cm al di sopra un filo di paglia coperto fondo. Dopo l'allenamento per tre volte consecutive di almeno 180 s la latenza a cadere è misurata. Ogni mouse è dato fino a tre tentativi di trattenere il coperchio capovolto per un massimo di 180 s e il più lungo periodo è registrata.

Rotarod test

L'apparato rotarod (Ugo Basile, Comerio, Italia) è stato usato per misurare la coordinazione motoria, l'equilibrio e la capacità di apprendimento motorio ^{3, 4.} Una buona prestazione richiede un alto grado di coordinazione sensomotoria. La macchina deve essere collocato in un ambiente tranquillo e non disturba al fine di evitare stimoli di distrazione per la testati su animali. È costituita da un computer controllato motorizzata di rotazione del mandrino e cinque corsie per cinque topi. Cadute dei topi vengono rilevati automaticamente dalla pressione su una piastra di plastica sul fondo. Dopo l'addestramento per tre volte consecutive di almeno 180 s ad una velocità costante di 15 rpm del tempo per il quale un animale può rimanere sulla canna rotante viene misurata. Ogni animale sottoposto a tre prove e la più lunga latenza senza cadere viene registrato. Il tempo di 180 s è scelto come cut-off time perché la maggior parte delle differenze significative nella coordinazione motoria vengono rilevati in questo lasso di tempo.

3. Preparazione Spinal Cord

1. Gli animali vengono uccisi da CO ₂ insufflazione in conformità con le linee guida locali e sono immediatamente perfusi transcardiaca con soluzione PBS seguita da una soluzione di paraformaldeide al 4%.
2. Per preparare il midollo spinale del mouse sacrificato, l'animale viene posto su un tavolo operatorio e le quattro arti sono fissati sul lato in modo da esporre il lato posteriore del mouse.
3. A breve lavaggio con una soluzione di etanolo al 70% pulisce il sito della dissezione e appiattisce il mantello.
4. Poi della cute con un bisturi affilato nella linea mediana. Al fine di facilitare il taglio della pelle viene tesa su entrambi i lati. Se i muscoli delle gambe deve essere pronto, la loro pelle deve inoltre essere inciso.
5. Dopo l'incisione cutanea è completata, viene tirato da parte con una pinzetta per esporre la fascia sottostante superficiale del corpo.
6. La muscolatura del collo e il legamento nucale devono essere rimossi e sono carefully preparato. Fare attenzione a non incidere profondamente e di lesione del midollo spinale. I muscoli delle spalle possono anche essere rimosse per esporre meglio la colonna vertebrale.
7. Poi i muscoli paravertebrali vengono rimossi dalla intera colonna vertebrale.
8. Per aprire i laminectomie colonna vertebrale diversi devono essere eseguiti. Si dovrebbe iniziare dalla parte superiore craniale nel sito del atlanto-occipitale.
9. E 'più facile togliere la fissazione dei due arti superiori e tirare troppo il collo per essere meglio in grado di eseguire la laminectomia delle vertebre prima. Questi sono tirato via senza toccare il esposta midollo spinale cervicale.
10. Più vertebre vengono rimossi prima sezionare i archi vertebrali su entrambi i lati con forbici angolate e quindi tirando i processi dorsali. Rimanenti parti laterali delle vertebre dovrebbe essere rimosso per facilitare la successiva rimozione completa del midollo spinale.
11. Un punto di riferimento anatomico della spina lombarel è il cavo di intumescenza che è presente anche nel midollo spinale cervicale.
12. Dopo aver finito la laminectomia del midollo spinale intera, fare in modo che anche voi transetto tutte le radici ventrali e rilasciare il midollo spinale dalla dura madre delle meningi.
13. Poi il midollo spinale cervicale è tagliato cranialmente e si inizia a rimuovere il midollo spinale.
14. Infine, il midollo spinale è anche tagliato alla distale cauda equina, per essere completamente rilasciato.
15. In definitiva, il midollo spinale viene posto in una soluzione postfixating (ad esempio paraformaldeide 4%) per una notte e può essere ulteriormente lavorato. Di solito cryosection il midollo spinale per prepararlo per l'analisi immunoistologico.

4. Risultati rappresentativi

La tecnica di preparazione del midollo spinale rappresenta il focus di questo articolo video. Si tratta di un prerequisito essenziale per il sezionamento dei tessuti in seguito e, infine, per l'analisi immunoistologico di spinal cavo sezioni. Come esempio di un risultato finale, uno workup immunoistochimica della regione corno anteriore del midollo spinale lombare topo di tipo selvatico (wt) e di un transgene SOD G93A (tg) topo è dimostrata. Neuroni motore può essere identificato con un primario anticorpo anti-ChAT e successiva marcatura fluorescente con un anticorpo secondario Cy3. Inoltre, una contro-colorazione nucleare con DAPI (4,6-Diamidino-2-fenilindolo) è stato eseguito (Figura 1).

Figura 1. Microfotografie fluorescenti visualizzando il immunorivelazione dei motoneuroni con anticorpi anti-ChAT (rosso) e nuclei cellulari anti-macchia DAPI (blu) a livello lombare corno midollo spinale anteriore del mouse di un tipo selvatico (WT) (a sinistra) e di uno SOD G93A transgenico (tg) (a destra) del mouse all'età di 130 giorni. Scale bar: 40 micron.

Poiché l'analisi immunoistochimica dii topi SOD G93A non è lo scopo primario di questo articolo si prega di consultare la pubblicazione originale in cui questi topi transgenici sono stati caratterizzati e quelli più recenti che studiano approcci terapeutici per la consultazione ^{1, 5, 6.} Se gli effetti terapeutici è modulata al livello immunoistologico chiaramente definito algoritmi di valutazione quantitativa deve essere applicato supportato da un software stereological (si veda per esempio ^7).

Discussione

Il (G93A) modello murino SOD1 genetico è un modello animale valido per studiare il corso della malattia del motoneurone perdita progressiva paragonabile umana sclerosi amiotrofica laterale ^8. Una varietà di paradigmi di trattamenti diversi sono stati valutati in questo modello e rappresentano una base per la successiva prova in studi clinici umani ^8-10. Per poter rilevare differenze significative in uno studio sperimentale di trattamento in questi topi, è di importanza eminente includere almeno ...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Fabbricante	Informazioni per l'ordinazione
Test comportamentale
Rota-Rod per il Mice	Ugo Basile, Comerio, Italia	# 47600
Hanging dispositivo a filo	Su misura
Preparazione Spinal Cord
Operation Table Spia di funzionamento Guanti di protezione
"Iris" Forbici, angolato a lato	Strumenti Scienza Belle, Heidelberg, Germania	14063-09
Cohan-Vännäs Forbici primavera, diritte	Strumenti Scienza Belle, Heidelberg, Germania	15000-10
Micro pinza	Hammacher, Solingen, Germania	HWC 111-10
Scalpel "präzisa plus"	Dahlhausen, Köln, Germania	11.000.00.510, figura 10