Клинические испытания и удаления спинного мозга у мышей на боковой амиотрофический склероз (ALS)

Резюме

Модель мыши для боковой амиотрофический склероз (БАС) рассматриваются клинические и поведенческие. В качестве предварительного условия для сопровождающих immunohistological анализ подготовки спинного мозга изображен в деталях.

Аннотация

Боковой амиотрофический склероз (БАС) является фатальным нейродегенеративные расстройства в результате прогрессирующей дегенерации мотонейронов. Пик начала около 60 лет спорадических заболеваний и около 50 лет семейной болезни. Благодаря прогрессивной Конечно, 50% пациентов умирают в течение 30 месяцев с момента появления симптомов. Для того чтобы оценить новые методы лечения этого заболевания, генетические модели мышей ALS были получены на основе семейного человека мутации в гене СОД, такие как SOD1 (G93A) мутации. Наиболее важные аспекты, которые должны быть оценены в модели общей выживаемости, клинического течения и двигательные функции. Здесь мы показываем, клинической оценки показывают, проведение двух поведенческих тестов двигатель и дать количественную системы скоринга для всех параметров. Потому что в глубине анализа модели мышей ALS обычно требуется иммуногистохимическое исследование спинного мозга, мы демонстрируем свою подготовку в подробности применения этогоРСАЛ метод ламинэктомия. Примерные результаты гистологического исследования демонстрируют. Комплексное применение методов исследования изображены в исследованиях на мышах БАС позволит исследователю надежно проверить будущих терапевтических вариантов, которые могут служить основой для последующего клинические испытания на человеке.

протокол

Животные были приобретены в Jackson Laboratory (# 002726) ^1. Они забили и клинически испытания на моторной функции (rotarod тест) и мышечной силы (висящие провода теста). Все эти испытания и позже убийства животных для того, чтобы подготовить спинного мозга были выполнены в очень тесном соответствии с местными руководящими принципами для надлежащего проведения экспериментов на животных.

1. Оценка клинических

Помимо оценки для мышей массой тела рассматриваются признаки дефицита двигатель со следующими 4-балльной системе баллов ^2:

4 балла: нормальный (не знаком моторной дисфункции)

3 балла: задние конечности толчки становятся очевидными, когда приостановлены за хвост

2 балла: походка нарушения присутствуют

1 балл: перетаскивание по крайней мере одной задней конечности

0 баллов: симметричныйпаралич, неспособность право сам или потеря 20% от максимального веса, в этом случае животные сразу усыпляют и эксперимент заканчивается

2. Испытания моторной функции и мышечная сила

Висячие провода

Этот тест используется для оценки мышечной силы ^{3, 4.} Все животные выполнить этот тест по крайней мере один или два дня после того, как тест rotarod. Каждая мышь находится на заказ провод крышки с интервалом в 0,8 см и осторожно перевернулся, 60 см покрыты соломой дно. После тренировки три раза подряд, по крайней мере 180 с задержкой падать измеряется. Каждая мышь дается до трех попыток провести на перевернутую крышку на срок до 180 сек и дольше сохраняются.

Rotarod испытаний

аппарат rotarod (Ugo Basile, Комерио, Италия) был использован для измерения координации движений, баланса и двигательной способности к обучению ^{3, 4.} Хорошая производительность требует высокой степени координации сенсомоторных. Машина должна быть помещена в спокойной и не тревожные окружающей среды, чтобы избежать отвлекающего стимулов для испытуемого животного. Он состоит из управляемых компьютером с приводом от двигателя вращающихся шпинделей и пять полос движения в течение пяти мышей. Водопад мышей обнаруживаются автоматически давление на пластиковую пластину на дне. После тренировки три раза подряд, по крайней мере 180 с постоянной скоростью 15 оборотов в минуту времени, на которое животное может оставаться на вращающийся стержень измеряется. Каждое животное проходит три испытания и самая длинная задержка, не впадая записывается. Время 180 с выбрано время отключения, потому что большинство существенные различия в координации движений обнаружены в этот период времени.

3. Спинной Подготовка кабеля

1. Животные погибают от CO ₂ вдувания в соответствии с местными руководящими принципами и сразу перфузии transcardially с PBS решение следуют 4% параформальдегид решение.
2. Для того, чтобы подготовить спинного мозга мыши жертву животное помещается на операционный стол и четыре конечности крепятся на стороне для того, чтобы подвергать обратной стороне мыши.
3. Короткая стирка с 70% раствором этанола очищает место рассечения и выравнивает шерсть.
4. Тогда кожи вырезается острым скальпелем в средней линии. В целях облегчения резки кожа растягивается в обе стороны. Если мышцы ног должны быть подготовлены, их кожа также должны быть врезаны.
5. После рассечения кожи завершен, он отодвинул с пинцетом, чтобы выставить основной поверхностной фасции тела.
6. Мускулатура шеи и затылочной связки должны быть удалены и околоrefully подготовлены. Будьте осторожны, чтобы не надрезать глубоко и повреждение спинного мозга. Плечевые мышцы могут быть удалены для того, чтобы лучше выявить позвоночника.
7. Тогда паравертебральные мышцы отделяются от всего позвоночного столба.
8. Для того чтобы открыть позвоночника несколько laminectomies должны быть выполнены. Надо начинать с верхней части черепной на месте атланто-затылочного сустава.
9. Легче всего снять фиксацию двух верхних конечностей и затягивать на шее, чтобы иметь больше возможностей для выполнения ламинэктомии первого позвонка. Они отстранилась, не прикасаясь к воздействию шейного отдела спинного мозга.
10. Более позвонки удаляются по первому, пересекающих позвоночной арки с обеих сторон с угловыми ножницами, а затем тянет на спине процессов. Оставшиеся боковые части позвонков должны быть удалены, чтобы облегчить позже полного удаления спинного мозга.
11. Анатомический ориентир поясничного расщеплениел шнур припухлость, который также присутствует в шейном отделе спинного мозга.
12. После окончания ламинэктомия всего спинного мозга, убедитесь, что вы также секут все вентральных корешков и освободить спинной мозг из мозговой оболочки мозговых оболочек.
13. Тогда шейного отдела спинного мозга режется краниально и вы начнете удалять спинной мозг.
14. Наконец, спинной мозг также сократить на дистальном конского хвоста, чтобы быть полностью освобожден.
15. В конечном счете, спинной мозг помещают в postfixating решения (например, 4% параформальдегид) в течение ночи и могут быть в дальнейшем обработаны. Мы обычно cryosection спинного мозга, чтобы подготовить его для immunohistological анализа.

4. Представитель Результаты

Методика подготовки спинной шнур представляет основное внимание в этом видео статьи. Это является необходимым условием для последующего срезов тканей и в конечном итоге immunohistological анализа расщеплениеразделы л мозга. В качестве примера конечный результат, иммуногистохимическое обследование в передней части рога мыши поясничного спинного мозга дикого типа (WT) и СОД G93A трансгена (ТГ) мыши продемонстрировали. Моторные нейроны могут быть идентифицированы с главным анти-ЧАТ антител и последующее флуоресцентные маркировки со средним Cy3 антител. Кроме того, ответного ядерного пятно DAPI (4,6-диамидино-2-фенилиндола) была выполнена (рис. 1).

Рисунок 1. Флуоресцентные микрофотографии визуализации иммунодетекции мотонейронов с анти-ЧАТ антител (красный) и клеточных ядер по борьбе с пятном на DAPI (синий) у мышей поясничного спинного мозга передних рогов дикого типа (WT) (слева) и SOD трансгенных G93A (ТГ) (справа) мыши в возрасте 130 дней. Шкала бар: 40 мкм.

Как иммуногистохимического анализаSOD G93A мышей не является основной рамки данной статьи можно найти в оригинальной публикации, в которых эти трансгенных мышей были характерны и более поздние, которые изучают терапевтических подходов для дальнейшего использования ^{1, 5, 6.} Если терапевтический эффект должен быть дифференцированы по уровню immunohistological четко определены количественные алгоритмы оценки должны быть применены при поддержке стереологического программное обеспечение (см., например, ^7).

Обсуждение

SOD1 (G93A) генетические модели мышей является ценным животной модели для изучения течения заболевания от прогрессирующей потерей мотонейронов сравнима с человеческой боковым амиотрофическим склерозом ^8. Различных парадигм лечения были оценены в этой модели и представляют собой о?...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
	Производитель	Информация для заказа
Поведенческие тестирования
Rota-Rod для мышей	Ugo Basile, Комерио, Италия	# 47600
Висячие провод устройства	Изготовленный на заказ
Спинной Подготовка кабеля
Операционном столе Индикатор работы Защитные перчатки
"Ирис" Ножницы, под углом в сторону	Средства изобразительных наук, Гейдельберг, Германия	14063-09
Коэн-Vannas Весна Ножницы, прямые	Средства изобразительных наук, Гейдельберг, Германия	15000-10
Micro щипцы	Hammacher, Золинген, Германия	HWC 111-10
Скальпель "präzisa плюс"	Dahlhausen, Кельн, Германия	11.000.00.510, фиг.10