JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Protocol
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מאמר זה מתאר את השינוי הגנטי של unicellular אצה ימית Ostreococcus tauri על ידי electroporation. זה האורגניזם האיקריוטים הוא פלטפורמה מודל יעיל צמחים גבוהים יותר, possesing המורכבות גנומית הסלולר הקטינה באופן משמעותי ולהיות מקובל בקלות לתרבות הן התא וביולוגיה כימית.

Abstract

בעיות נפוצות פוגע ההתקדמות המהירה במדעי הצמח כולל רקמות הסלולר, והמורכבות האורגניזם כולו, בעיקר רמה גבוהה של יתירות גנומית להשפיע על הגנטיקה פשוטים צמחים גבוהים יותר. אורגניזם מודל הרומן Ostreococcus tauri הוא הקטן ביותר החופשי חי eukaryote הידוע עד כה, ו בעל גודל הגנום הקטינה באופן משמעותי את המורכבות ואת 1,2 הסלולר, באה לידי ביטוי על ידי נוכחות של רק אחד רוב האברונים (mitochondrion, הכלורופלסט, מחסנית Golgi) לכל התא, גנום המכיל רק ~~~HEAD=NNS 8000 גנים. יתר על כן, השילוב של unicellularity והתרבות קל מספק פלטפורמה מקובל גישות וביולוגיה כימית. לאחרונה, Ostreococcus כבר מצליחים ללמוד המנגנונים הבסיסיים העומדים בבסיס מדידת זמן היממה 3-6. תוצאות של אורגניזם מודל זה השפיעו לא רק מדע הצמח, אלא גם בביולוגיה של יונקים 7. דוגמה זו מדגישה עד כמה ניסויים מהירהeukaryote פשוט משושלת ירוק יכול להאיץ מחקר באורגניזמים מורכבים יותר על ידי יצירת השערות לבדוק בדיקה בשיטות אפשרי מבחינה טכנית רק רקע זה של מורכבות מופחתת. ידיעת הגנום ואת האפשרות לשנות את הגנים הם כלים חיוניים כל מין המודל. גנומי 1, Transcriptomic 8, ומידע proteomic 9 על מין זה הוא זמין בחינם, בעוד השיטות שפורסמו בעבר 6,10 גנטית להפוך Ostreococcus ידועים במעבדות ספורות בעולם.

במאמר זה, את שיטות ניסיוניות גנטית להפוך את יצור דגם הרומן עם ביטוי יתר לבנות באמצעות electroporation מתוארים בפירוט רב, כמו גם את שיטת הכללת תאים טרנספורמציה של אחוז agarose נמוכה על מנת לאפשר בחירה של קווים ששינו שמקורם אחד הפך התא. בעקבות יישום מוצלח של Ostreococcus למחקר היממה, ההתעניינות הגוברת Ostreococcus ניתן לצפות תחומי מחקר מגוונים בתוך ומחוץ מדעי הצמח, כולל בתחומים ביוטכנולוגיים. חוקרים מגוון רחב של מדעים ביולוגיים ורפואיים שעובדים על הביוכימיים המשתמרים לשקול מחקר ב רודף Ostreococcus, ללא המורכבות גנומית האורגניזם המינים מודל גדולים יותר.

Protocol

1. הכנת חומר אצות

  1. תאים בתרבית Ostreococcus הם מי ים מלאכותיים (ASW). מלחי ים (בדרך כלל כ -40 גרם לליטר) הם מומסים במים deionised למליחות של 30 ppt, כפי שנמדד באמצעות מד מליחות. אמצעי העשרה 11,12, יסודות קורט מתכות וויטמינים נוספים, כמתואר בטבלה 1-3. התקשורת היא אז פילטר עיקור באמצעות כמה 0.22 מיקרומטר הסינון.
  2. לצורך תחזוקה, תאים של מתח Ostreococcus OTTH95 הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים ו גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור הירח הכחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 ° C. התאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם מזועזעים אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה.
  3. לשינוי זה, 50 מ"ל של תאים נדרשים על התא דהnsity של 20-30 x 10 6 מ"ל -1, שאמור להיות מושג לאחר 5-7 ימים culturing המשנה. צפיפות התאים axeny משוער ניתן לקבוע באמצעות אחת cytometry זרימה או haemocytometer לפחות הגדלה של X40.

2. Electroporation

  1. הכן את ה-DNA לשינוי. לשינוי זה, 5 מיקרוגרם של ה-DNA, טהור פלסמיד linearised נדרש בריכוז של 1 מיקרוגרם / μl במים deionised סטרילית. כדי להשיג את ה-DNA, החוקרים ממליצים להשתמש midi Qiagen ערכת הכנה, אם כי שיטות אחרות יכול לעבוד באותה מידה. לעכל את המוצר עם האנזים החותך ב עמוד השדרה של וקטור פעם, אבל לא transgene או הגן הבחירה. יתר על כן לטהר ולרכז את ה-DNA ליניארי שהתקבל על ידי משקעים אתנול, ו resuspend המוצר בהיקף המתאים מים באיכות גבוהה deionised סטרילית.
  2. הכינו צינורות microcentrifuge המכילים DNA 5 מיקרוגרם לשינוי זה. Controאני עם ה-DNA לא נחוץ כל שורה בתא להשתנות. זכור את הצינורות על קרח, יחד עם קובט electroporation 2 מ"מ לשינוי זה.
  3. להכין 2.2 מ"ל של חיץ resuspension לכל שינוי. ממיסים סורביטול לפתרון M 1 ב DDH 2 O, מוסיף 0.1% חומצה pluronic F68 ו-מסנן לעקר.
  4. הוספת חומצה pluronic F68, לריכוז סופי של 0.1% אל התאים, ועל גלולה אותם במשך 10 דקות בכל 8000x גרם ב 10 ° C בצינור 50 מ"ל עם תחתית בצורת חרוט. מיד resuspend התאים מ"ל 1 של חיץ resuspension ידי pipetting למעלה ולמטה, ולהעביר את הצינור microfuge. ספין למטה במשך 10 דקות ב 8000 XG ב 10 ° C, עובד מהר, חזור על שלב זה לשטוף פעם נוספת.
  5. עם קצה גזירה, resuspend כל גלולה האחרון μl 40 מאגר resuspension. הוסף 40 μl של תאים resuspended אל צינור ה-DNA של כל linearised על קרח, לערבב בעדינות ולהעביר את קובט electroporation.
  6. שים את קובט על electropנאום המכונה. לשנות את ההגדרות כדי kV 6 ס"מ -1, 600 Ω, ו 25 μF. Electroporate התאים.
  7. דגירה התאים electoporated ב cuvettes את בטמפרטורת החדר למשך 10 דקות, ולהשתמש זמן להכין את תרבות צלוחיות רקמות. לתייג אותם להוסיף 30 מ"ל של ASW טרי זה. קח 1 מ"ל מתוך בקבוק אחד ובעדינות להוסיף אותו קובט המקביל. דגירה של 2 דקות בעדינות להסיר את ASW, עכשיו המכיל כדורית של תאים בעדינות ולאט לאט פיפטה ישירות ASW בבקבוק התרבות.
  8. התאים בדרך כלל להישאר כדורית. יש להיזהר לא ללחוץ או להפריע את התאים מצטברים ברגע זה. אפשר התאים להתאושש בחממה למשך 1-2 שעות, resuspend מכן על ידי רועדת על צלוחיות. בשלב זה, התאים צריכים resuspend בחופשיות גושים לא צריך להיות גלוי. השאירו את התרבויות לשחזר לילה בחממה.

3. הכללה של תאים בצלחות במצע חצי מוצק

    למחרת, החיטוי פתרון של 2.1% נקודת התכה נמוכה agarose ב DDH 2 O בבקבוק המכיל מוט ערבוב. שמור מותכת על 65-90 מעלות צלזיוס בכוס גדולה יותר המכילה מים על stirrer חימום מגנטי. לשינוי זה להכין 8 צלחות פטרי (בקוטר 55 מ"מ) ו -8 צינורות x 15 מ"ל כל אחת מכילה 9 מ"ל של ASW, בתוספת מבחר הנדרש. אם אתה משתמש Nourseothricin או G418, השתמש 2 מ"ג / מ"ל.
  1. אוספים את התאים השתנו מן החממה. עבודה flowhood סטרילית, הוסף 1 מ"ל של רותחים LMP agarose כדי מ"ל 9 באחד הצינורות. סגור את הצינור, ומערבבים על ידי היפוך. לאחר מכן הוסף 0.5 מ"ל של תאים שהפכו זה עתה, לערבב במהירות ולשפוך לתוך הצלחת. חזור על תהליך זה עם 7 צינורות הנותרים, ואז להמשיך בקבוק השינוי הבא.
  2. השאירו הצלחות לפתוח בשכונה זרימת במשך שעה, על agarose להגדיר. ואז לסגור את הצלחות ולהעבירם רבועים מנות גדולות פטרי, אשר תקיים 4 צלחות כל אחת. לאטום את השנינות צלחות מרובעH parafilm. לציין כי הצלחות לא יקבע לחלוטין, וכתוצאה מכך, ג'ל הוא שברירי מאוד. יש להיזהר לא לשבור את הג'ל במהלך הטיפול בו הצלחות. מניחים את כל צלחות מרובעות בחממה.

4. מבחר המושבות טרנספורמציה

  1. מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים על הצלחות שינוי, אך לא על צלחות שהפכו מדומים. לקחת מושבות להשתמש פיפטה 200 μl עם חתוכים טיפים. שעליך לעשות הוא לבחור מושבות בחינם ולמצוץ את המושבה הירוקה. יש להיזהר שלא לכלול תאים מן המושבות השכנות.
  2. להעביר את התאים 2 מ"ל של מדיום נוזל המכיל את הבחירה, בצלחת בארות 24. בעת שימוש Nourseothricin, השתמש 1.75 מ"ג / מ"ל. מערבבים ידי pipetting מעלה ומטה. בחר 24-50 מושבות לכל שינוי. לאטום את הצלחות עם parafilm והעברה חממה.
  3. אחרי שבוע, להעביר 100 μl של כל טוב 2 מ"ל טרי ASW עם מבחר בצלחת בארות 24 ולגדול על additionaL-7 ימים. שורות תאים ששרדו יכול לשמש למחקרים נוספים. שילוב יציבה למספר הגנום הכניסה יש לנתח באמצעות PCR ו כתם הדרום. הדנ"א הגנומי ניתן להשיג מטרות אלה באמצעות כל שיטה לאורך בקנה מידה סטנדרטית להפקת DNA הצמח.

5. נציג תוצאות

פיצול תאים 1/100 הגיעו צפיפות של 25 מיליון תאים למיליליטר לאחר גידול של 7 ימים. Electroporation של תאים עם ההגדרות המתאימות הביא כמה זמן קבועים בין 10 ל 14 אלפיות השנייה. כאשר תאים מועברים בינוני צלוחיות תרבות, כדורית של תאים צריך טופס. כאשר מזועזע קלות אחרי שעה, התאים צריכים בקלות resuspend. הכללה של 1 מ"ל תאים הופכים אגר LMP 0.2% אמורה לגרום ג'ל חצי מוצק עקבי אבל רק. מושבות אמור להופיע לאחר 10 עד 21 ימים. כאשר למהפך 5 מיקרוגרם של ה-DNA linearised באמצעות פרוטוקול לעיל, 50-100 מושבות לכל שינויהצלחת היו אמורים בדרך כלל, לעומת אף על לוחות בקרה שליליות. ~ 80% מושבות הרים נבחרו באופן חיובי על ידי עמידות לאנטיביוטיקה במדיום נוזלי נעשה שימוש במחקרים הבאים.

ריכוז סופי המניות פתרון נפח של 1 ליטר
NANO 3 8.83 x 10 -4 M 75 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
NH 4 Cl 3.63 x 10 -5 M 2.68 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
β-glycerophosphate 1 x 10 -5 M 2.16 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
H 2 3 SEO 1 x 10 -8 M 1.29 מ"ג / ל 'ד"ה 2 O 1 מ"ל
טריס בסיס (pH 7.2) 1 x 10 -3 M 121.1 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
K עקבות פתרון מתכת טבלה 2 1 מ"ל
f / 2 פתרון ויטמין לוח 3 0.5 מ"ל

טבלה 1. המרכיבים בינוני לצמיחה של א ' tauri 11, 12. איפור בנפח כולל של 1 ליטר של מי ים מלאכותיים כדי מליחות של 30 ppt, ולהוסיף את המרכיבים הנ"ל מפתרונות מניות כמצוין. סנן-לעקר בינוני ושימוש בתוך שבוע. מניות של כל תרכובות מלבד פתרון ויטמין ניתן ונקווה להוסיף 6 מ"ל של פתרון זה עבור כל ליטר של המדיום.

ריכוז סופי המניות פתרון סכום של 1 ליטר
Na 2 EDTA • 2H 2 O 1 x 10 -4 M 41.6 גרם
FeCl 3 • 6 שעות 2 O 1 x 10 -5 M 3.15 גר '
Na 2 מו 4 • 2H 2 O 1 x 10 -8 M 6.3 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
ZnSO 4 • 7H 2 O 1 x 10 -9 M 22.0 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
CoCl 2 • 6 שעות 2 O 1 x 10 -9 M 10.0 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
MnCl 2 • 4H 2 O 1 x 10 -8 M 180.0 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
CuSO 4 • 5H 2 O 1 x 10 -8 M 9.8 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל

טבלה 2. עקוב אחר פתרון מתכת 11,12. לעשות עד לסך של 1 ליטר, ב ד"ה 2 O, וחום לפרק. הפתרון aliquot ומקפיאים לאחסון. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון מתכת עקבות.

ריכוז סופי המניות פתרון סכום של 1 ליטר
ויטמין B 12 1 x 10 מ -10 1 גר '/ ל' ד"ה 2 O 1 מ"ל
ביוטין 1 x 10 -9 M 0.1 גר '/ ל' ד"ה 2 O 10 מ"ל
תיאמין • HCl 1 x 10 -7 M 200 מ"ג

לוח 3. f / 2ויטמין הפתרון 11. לעשות עד לסך של 1 ליטר ב DH 2 O, פילטר לעקר, aliquot ומקפיאים. הריכוזים האחרונים הצביעו מתייחסים בינוני של דבר, לא הפתרון ויטמין.

figure-protocol-10822
באיור 1. סקירה גרפית של תהליך השינוי. ייצוג סכמטי של הליך גנטית כדי להפוך Ostreococcus tauri ידי electroporation.

figure-protocol-11099
איור 2. תאים גדילה והתרבות. הם תת תרבות בסביבה נקייה מחיידקים, בדילול של 1/100 ב ASW טרי כל 7 ימים, גדל תחת אור קבוע גידול צמחים בחממה מצויד אור ירח כחול הסינון. עוצמת האור צריך להיות קרוב ל 20 μmol m -2 s -1 והטמפרטורה נשמרת על 20 מעלות צלזיוס תאים אינם דורשים תסיסה מתמדת, אבל הם שלhaken אחת ל -2 עד 3 ימים כדי למנוע צבירה.

figure-protocol-11618
איור 3. במושבה היווצרות על 0.2% LMP agarose. העברת 4 צלחות פטרי צלחת גדולה בכיכר, ואת החותם עם parafilm (למעלה משמאל). כאשר הקימו מושבות, פשוט לבחור בחינם (באופן אידיאלי בצורת conically) מושבות (מימין למעלה) ולמצוץ אותם בצלחת עם טפטפת P200. לא אמורה להיות מושבות בשלט שלילית (מימין למטה).

Discussion

נייד axeny המדינה והתרבות היא בעלת חשיבות מכרעת לתהליך השינוי. למרות שתאי נשמרים בדרך כלל מחזורים של 12 שעות אור, 12 שעות חושך, יעילות השינוי בתאים הגדלים בתנאים הללו נמצאו מספיק. במהלך pelleting / resuspension צעדים חוזרים ונשנים, התאים תמיד צריך resuspend בקלות. אם תאים צבירה, או חומר דמוי ריר נוכח, עדיף להתחיל את התהליך מההתחלה שוב. בדרך כלל, ~ 50 מושבות ניתן לצפות על כל צלחת שינוי, לעומת אף על צלחת הביקורת השלילית. במקרה של יעילות הטרנספורמציה נמוכה, תנאי culturing צריכים להיות מגוונים על מנת להבטיח התאים נמצאים במצב אופטימלי. המשתנים המשפיעים על יעילות השינוי כוללים טמפרטורת הסביבה במעבדה (צריך להיות קרוב ל 20 מעלות צלזיוס) ומהירות הטיפול (נוהל מ pelleting תאים [2.3] להחלמה [2.7] צריך לקחת ~ 1 שעה). כמו כן, חשוב כי כל כמה פתרונותRe עשה טרי לפני כל שינוי. עבור הכללה צלחות, ריכוז LMP agarose הוא קריטי. תאים Ostreococcus לא יגדל ב ריכוזים גבוהים agarose, ויהיה לפזר בריכוזים נמוכים.

שלושה וקטורים שינוי עבור Ostreococcus פורסמו בעבר 6, ו וקטורים נוספים צפויים להיות שנוצר ופורסם זמן קצר. וקטור קיים פוט לוק 6 מאפשר שימוש promotor הבחירה בשילוב עם תג גחלילית בטרמינל C-בלוציפראז המאפשר בחירת הקו מהונדס מהיר בתוספת דפוסי הביטוי צייתן, בעוד וקטור Potox 6 נושא מושרה חזק 13 promotor שנלקח Ostreococcus זיקה גבוהה פוספט Transporter (HAPT) הגן ביטוי יתר של הגן של עניין. וקטור Potox לוק נובע Potox, נושא בלוציפראז סמן נוסף שניתן להשתמש בו לבחירה ישירה של קווי overexpression 14. סמנים בחירה מוצלחת על וקטורים אלו Nourseothricin ו G148. עם זאת, תאים Ostreococcus עמידות מאוד בפני אנטיביוטיקה רבים, ריכוזי חומרים הדרושים מבחר מהונדס לתאי Ostreococcus הוא גבוה יותר מאשר עבור מערכות המודל המקובל (2 מ"ג / מ"ל).

אמנם התהליך נראה בלתי יעיל, מספר גדול של תאים ו-DNA פלסמיד צורך בהליך זה אינו מהווה מכשול משמעותי. הגבלה גדולה יותר היא שכל קו שנוצר כי הוא עמיד בפני סמן לבחירה צריך להיות מנותח בנפרד כדי לבדוק את המבנה כולו משולב ב-DNA. ראינו דוגמאות שבהן ביטוי מוצלח של סמן לבחירה לא תואמות את הכניסה של הגן בפועל של עניין, כלומר אינטגרציה חלקי יכול להתרחש. ככל הנראה, הכניסה אקראי לתוך הגנום גם אומר שאין שליטה על הכניסה לאתר באמצעות שיטה זו, ושיטות בased על רקומבינציה הומולוגיים כרגע בשלבי פיתוח. עם זאת, השיטה המתוארת כאן היא, למיטב ידיעתנו, כיום השיטה מאופיינת רק כדי לייצר תאים Ostreococcus מהונדסים גנטית.

כמו Ostreococcus tauri רק לאחרונה נעשה שימוש כאורגניזם מודל ניסיוני, רוב שיטות עבודה עם תאים אלה עשוי להתפתח להיות מעודן על ידי קהילת המחקר הגוברת מעורב. פרוטוקול זה נועד לעזור לאנשים להתחיל לעבוד עם Ostreococcus, אבל בשום פנים ואופן לא מתיימר לתאר את כל מה שיש לדעת על שינוי גנטי של microalga זה. אמון המחברים כי הקוראים יוכלו להתאים את פרוטוקול לצרכים שלהם כמו הבדלים קטנים חממות (רמות האור או איכות) ופרמטרים נוספים יהיו קיימים וסביר צריך להיות מותאם במעבדה כל אדם לקבל את התרבויות בריאים הדרושים לכך פרוטוקול. לאחר שליטה בטכניקות שתוארו כאן,וקטורים ניתן לבנות ליצור זורח, פלורסנט, או קווים אחרים היתוך מתוייגים תחת שליטה של ​​מגוון רחב של promotors. זו פלטפורמה מרגש ניסיוני הספר יהיה שימושי ללמוד כמה בעיות ביוכימיות מסובכות נפתרות ב eukaryote מורכבות מופחתת, בו גישות תרופתי הם הקלו מאוד 3.

Disclosures

אין ניגוד עניינים הצהיר.

Acknowledgements

SynthSys המרכז לביולוגיה אינטגרטיבית מערכות במימון BBSRC ואת הפרס EPSRC D019621. האיחוד האירופי FP6 רשת מענק מצוינות "Genomics ימית" כדי FYB מימנה פיתוח שיטות שינוי גנטי.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
בינוני מרכיבים
כימי מספר קטלוגי ספק
מיידית האוקיינוס ​​ימית מלח מ amazon.co.uk או rocketaquatics.co.uk
NANO 3 S5506-250 גרם סיגמא
NH 4 Cl A9434-500 גרם סיגמא
2-גליצרול פוספט הרכב: מימה מלח G9422-100 גרם סיגמא
H 2 3 SEO 84920-250 סיגמא
אולטרה טהורים טריס 15504-020 Invitrogen
Na 2 EDTA • 2H 2 O BPE120-500 גרם פישר סיינטיפיק
FeCl 3 • 6 שעות 2 O 157740 סיגמא
Na 2 מו 4 • 2H 2 O 31439-100 גרם-R סיגמא
ZnSO 4 • 7H 2 O Z0251 סיגמא
CoCl 2 • 6 שעות 2 O 31277 סיגמא
MnCl 2 • 4H 2 O 203734-5G סיגמא
CuSO 4 • 5H 2 O C8027 סיגמא
ויטמין B 12 (cyanocobalamin) V2876 סיגמא
ביוטין 47868 סיגמא
תיאמין • HCl T4625 סיגמא
Ampicillin A9518-25 גרם סיגמא
Neomycin N6386 סיגמא
Kanamycin K4000 סיגמא
חומרים מתכלים ל culturing
פריט מספר קטלוגי ספק
תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ 83.1810.502 Starstedt
תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ 83.1813.502 Starstedלא
תרביות רקמה קנקן T175 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ 83.1812.502 Starstedt
הדף TPP בקבוק מסננים, 1 ליטר, להשלים 99950T Bioscience הלנה
TPP מסננים בקבוק העליון, 500 מ"ל, 99500T Bioscience הלנה
הדף TPP בקבוק מסננים, 250 מ"ל, 99250T Bioscience הלנה
הדף TPP בקבוק מסננים, 150 מ"ל, 99150T Bioscience הלנה
מליחות מטר ימית Aquarium DSG-10 Daeyoon
כימיקלים לשינוי
כימי קטלוגמספר ספק
D-סורביטול S6021-1 ק"ג סיגמא
F-68 Pluronic פתרון P5556-100 מ"ל סיגמא
ClonNat 51000 ורנר
נקודת התכה נמוכה agarose 16520-050 Invitrogen
מתכלים לשינוי
פריט מספר קטלוגי ספק
תרביות רקמה קנקן T25 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ 83.1810.502 Starstedt
תרביות רקמה קנקן T75 מתלה תרבויות פרקו עם יציקת ערוץ 83.1813.502 Starstedt
תרבות Flask רקמות T175 השעיה Cultures פרקו עם יציקת ערוץ 83.1812.502 Starstedt
גריינר צינורות צנטריפוגות 50 מ"ל 227261 GBO
הגן Pulser / MicroPulser cuvettes, 0.2 הפער ס"מ, 50 165-2086 ביו רד
פטרי צלחת עגולה PS 3 פתחי אוורור H14.2 Φ55 391-0895 VWR הבינלאומי
פטרי צלחת מרובעת עם קלקר פתחי 4 סטרילית ידי 120mm קרינה ברורה FB51788 פישר סיינטיפיק
אור ירח כחול בהיר מסנן 183 לי תאורה

References

  1. Derelle, E. Genome analysis of the smallest free-living eukaryote Ostreococcus tauri unveils many unique features. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 103, 11647-11652 (2006).
  2. Henderson, G. P., Gan, L., Jensen, G. J. 3-D ultrastructure of O. tauri: electron cryotomography of an entire eukaryotic cell. PLoS One. 2, e749(2007).
  3. O'Neill, J. S. Circadian rhythms persist without transcription in a eukaryote. Nature. 469, 554-558 (2011).
  4. van Ooijen, G., Dixon, L. E., Troein, C., Millar, A. J. Proteasome function is required for biological timing throughout the twenty-four hour cycle. Curr. Biol. 21, 869-875 (2011).
  5. Troein, C. Multiple light inputs to a simple clock circuit allow complex biological rhythms. Plant. J. 66, 375-385 (2011).
  6. Corellou, F. Clocks in the green lineage: comparative functional analysis of the circadian architecture of the picoeukaryote ostreococcus. Plant Cell. 21, 3436-3449 (2009).
  7. O'Neill, J. S., Reddy, A. B. Circadian clocks in human red blood cells. Nature. 469, 498-503 (2011).
  8. Monnier, A. Orchestrated transcription of biological processes in the marine picoeukaryote Ostreococcus exposed to light/dark cycles. B.M.C. Genomics. 11, 192(2010).
  9. Le Bihan, T. Shotgun proteomic analysis of the unicellular alga Ostreococcus tauri. J. Proteomics. 74, 2060-2070 (2011).
  10. Expression of polypeptides from the nuclear genome of Ostreococcus sp. US application patent. , 201001174050 (2010).
  11. Guillard, R. R. L., Ryther, J. H. Studies of marine planktonic diatoms. I. Cyclotella nana Hustedt, and Detonula confervacea (cleve) Gran. Can. J. Microbiol. 8, 229-239 (1962).
  12. Keller, M. D., Selvin, R. C., Claus, W., Guillard, R. R. L. Media for the culture of oceanic ultraphytoplankton. J. Phycol. 23, 633-638 (1987).
  13. Djouani-Tari, elB. A phosphate-regulated promoter for fine-tuned and reversible overexpression in Ostreococcus: Application to circadian clock functional analysis. PLoS One. 6, e28471(2011).
  14. Moulager, M. Integration of light signals by the retinoblastoma pathway in the control of S phase entry in the picophytoplanktonic cell Ostreococcus. PLoS. Genet. 6, e1000957(2010).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

65electroporationOstreococcus tauri

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved