Геномная Трансформация Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Тельца</em

Резюме

В этой статье описывается генетической трансформации одноклеточных морских водорослей Ostreococcus Тельца Путем электропорации. Это эукариотических организмов является эффективной платформой модели для высших растений, possesing значительно снижается геномных и клеточных сложности и быть легко поддаются как культура клеток и химической биологии.

Аннотация

Общие проблемы, препятствующие быстрому прогрессу в завод наук включают клеточном, тканевом и вся сложность организма, и, в частности высокий уровень избыточности генома, влияющих простой генетики в высших растениях. Роман модель организма Ostreococcus Тельца является самым маленьким свободно живущих эукариот известно на сегодняшний день и обладает значительно уменьшен размер генома и клеточных ^1,2 сложностью, которая проявляется наличием только одной из самых органелл (митохондрий, хлоропластов, Гольджи стека) в клетки, и геном, содержащий только ~ 8000 генов. Кроме того, сочетание одноклеточность и легко культура представляет собой платформу поддаются подходов химической биологии. В последнее время Ostreococcus был успешно применен для изучения основных механизмов, лежащих в основе циркадных хронометраж ^3-6. Результаты этой модели организм повлияли не только завод науки, но и биологии млекопитающих ^7. Этот пример подчеркивает, насколько быстрым экспериментов впростые эукариот из зеленого линии может ускорить исследования в более сложных организмов путем создания проверяемых гипотез методами технически осуществимо только в этом фоне снижение сложности. Знание генома, а также возможность изменять гены являются важными инструментами в любой модели вида. Геномная ¹ Transcriptomic ^{8, 9} и протеомных информации для этого вида находится в свободном доступе, тогда как ранее сообщалось о методах ^6,10 генетически трансформировать Ostreococcus, как известно, несколько лабораторий по всему миру.

В этой статье, экспериментальные методы генетически трансформировать этот роман организм модель с гиперэкспрессией построить с помощью электропорации изложены в деталях, а также метод включения трансформированных клеток в агарозном низкий процент, чтобы отбор трансформированных линий, исходящих из одной трансформированной клетки. После успешного применения Ostreococcus на циркадный исследования, растет интерес к Ostreococcus можно ожидать от различных областях исследований и за ее пределами завода наук, в том числе биотехнологические области. Исследователи из широкого спектра биологических и медицинских наук, которые работают на сохраняющихся биохимических путей может рассмотреть вопрос проведения исследований в Ostreococcus, свободной от геномных и организменном сложности более крупных видов модели.

протокол

1. Подготовка материала водорослей

1. Ostreococcus клетки культивируют в искусственной морской воде (ASW). Морской соли (обычно около 40 граммов на литр), растворяют в дистиллированной воде с соленостью 30 п.п., а измеряется с помощью солености метр. Обогащение средней ^11,12, микроэлементы металлов и витамины добавляются как описано в таблицах 1-3. Средства массовой информации, то фильтр стерилизовать через 0,22 мкм фильтр.
2. Для обеспечения, клетки Ostreococcus штамм OTTH95 суб-культурных асептически в разведении 1/100 в свежих ASW каждые 7 дней и вырос под постоянным светом в рост растений инкубатор оснащен Moonlight синий фильтр. Интенсивность света должна быть близка к 20 мкмоль м ^-2 с ^-1, а температура поддерживается на уровне 20 ° C. Клетки не требуют постоянного волнения, но потрясен каждые 2 до 3 дней для предотвращения агрегации.
3. Для каждой трансформации, 50 мл клеток необходимы в клетке-де-nsity 20-30 х 10 ⁶ мл ^-1, которые должны быть достигнуты через 5-7 дней после высеве. Приблизительная плотность клеток и axeny может быть определена с использованием либо проточной цитометрии или гемоцитометра как минимум увеличение x40.

2. Электропорация

1. Подготовка ДНК для трансформации. Для каждой трансформации, 5 мкг чистого линеаризованной плазмиды ДНК требуется при концентрации 1 мкг / мкл стерильной дистиллированной водой. Чтобы получить эту ДНК, авторы рекомендуют использовать Qiagen миди подготовительные комплект, хотя и другими методами может работать одинаково хорошо. Дайджест продукта с ферментом, который режет в основной вектор использовать, но не в трансгенов или выбор ген. Далее очищать и концентрировать полученной линейной ДНК осаждением этанолом, и ресуспендируют продукт в соответствующем объеме высококачественного стерильной дистиллированной водой.
2. Подготовить микроцентрифужных пробирок, содержащих 5 мкг ДНК для каждого преобразования. Controл с ДНК не является необходимым для каждой клеточной линии должны быть преобразованы. Храните эти трубы на льду, вместе с 2 мм электропорации кюветы для каждого преобразования.
3. Подготовить 2,2 мл буфера ресуспендирования в преобразовании. Растворите Сорбит в 1 М раствор в DDH ₂ O, добавить 0,1% плуроник кислоты F68 и фильтр-стерилизации.
4. Добавить плуроник кислоты F68, до конечной концентрации от 0,1% до клетки и гранул их в течение 10 минут 8000X г при 10 ° С в 50 мл трубки с коническим дном. Сразу ресуспендирования клеток в 1 мл ресуспендирования буфера с помощью пипетки вверх и вниз, и передать микроцентрифужную трубку. Спином вниз в течение 10 минут при 8000 х г при 10 ° С, а работать быстро, повторите этот шаг мыть еще раз.
5. В разрезе наконечник, ресуспендируют каждый конечный осадок в 40 мкл буфера ресуспендирования. Добавить 40 мкл ресуспендированного клеток каждый трубку линеаризованной ДНК на льду, аккуратно перемешать и передать электропорации кюветы.
6. Поместите кювету в electropречь машине. Изменение параметров до 6 кВ см ^-1, 600 Ω и 25 мкФ. Electroporate клеток.
7. Инкубируйте electoporated клеток в кювет при комнатной температуре в течение 10 минут, а использовать это время для подготовки колбы культуре ткани. Назовите их и добавить 30 мл свежего ASW каждому. Принимать по 1 мл из каждой колбы и осторожно добавить его к соответствующей кюветы. Выдержите в течение 2 минут и осторожно удалите ASW, теперь содержащие глобулы клеток и медленно и осторожно пипетировать непосредственно в ASW в культуре колбу.
8. Клетки обычно остаются в глобулы. Будьте осторожны, не трясите и не нарушать агрегированных клеток в данный момент. Дайте клеткам восстановиться в инкубаторе в течение 1-2 часов, затем ресуспендируют путем встряхивания колб. В это время клетки должны ресуспендируют свободно и без скопления должны быть видны. Оставьте культур для восстановления в течение ночи в инкубаторе.

3. Включение Ячейки плит в полу-твердые среднего

На следующий день, автоклав раствор 2,1% с низкой температурой плавления агарозы в DDH ₂ O во флакон, содержащий перемешивании стержня. Имейте в расплавленном 65-90 ° С в больших стакан с водой на отопление магнитной мешалкой. Для каждого преобразования подготовить 8 чашек Петри (55 мм) и 8 х 15 мл пробирок в каждом из которых 9 мл ASW плюс необходимый выбор. При использовании нурсеотрицина или G418, использовать 2 мг / мл.
1. Соберите трансформированные клетки из инкубатора. Работа в стерильных flowhood, добавить 1 мл кипящей LMP агарозы в 9 мл в одной из труб. Закройте трубы, и смешивать обращением. Затем добавить 0,5 мл свежей трансформированных клеток, быстро перемешать и вылить в тарелку. Повторите этот процесс с оставшимися 7 труб, а затем переходите к следующему колбу трансформации.
2. Оставьте пластин открыть в потоке капот в течение часа, для агарозы, чтобы установить. Затем закройте плиты и переносить их на большие квадратные чашки Петри, которая состоится 4 пластин в каждой. Печать площади остроумие пластинч парафильмом. Следует отметить, что пластины не будет устанавливать полностью, и, как следствие, гель очень хрупкая. Следует проявлять осторожность, чтобы не сломать гель при обработке пластин. Поместите все квадратные плиты в инкубаторе.

4. Выбор трансформированных колоний

1. Колонии должны появиться после 10 до 21 дней на преобразование пластин, а не на макете преобразован пластин. Чтобы выбрать колоний используют 200 мкл пипетку с запорными советы. Просто выберите свободный колониями и высасывают зеленые колонии. Будьте осторожны, чтобы не включать любые клетки из соседних колоний.
2. Передача клеток по 2 мл жидкой среды, содержащей выделения, в 24 пластин скважин. При использовании нурсеотрицина, используйте 1,75 мг / мл. Смешайте с помощью пипетки вверх и вниз. Выберите 24-50 колоний на преобразование. Уплотнение пластин с парафильмом и трансфер в инкубаторе.
3. Через неделю, передавать по 100 мкл в каждую лунку по 2 мл свежего ASW с выбором в 24 пластин скважин и расти additionaл 7 дней. Выжившие клеточные линии могут быть использованы для дальнейших исследований. Стабильная интеграция в число генома и вставки должны быть проанализированы с помощью ПЦР и Южной Blot. Геномная ДНК могут быть получены для этих целей с помощью любого вниз масштабных стандартный метод выделения ДНК растения.

5. Представитель Результаты

Клетки разделены 1/100 достигли плотности 25 миллионов клеток на миллилитр, увеличившись на 7 дней. Электропорация клеток с соответствующими параметрами в результате постоянной времени от 10 до 14 миллисекунд. Когда клетки переносятся в среду в области культуры фляги, глобулы клетки должны сформироваться. Когда слегка потряс через час, клетки должны легко ресуспендирования. Включение 1 мл трансформированных клеток в 0,2% LMP агар должно привести к последовательной, но только полутвердый гель. Колонии должны появиться после 10 до 21 дней. При преобразовании 5 мкг линеаризованной ДНК с использованием протокола выше, 50-100 колоний на преобразованиеплита, как правило, ожидается, по сравнению с ни на отрицательные пластины контроля. ~ 80% колоний взял положительно выбран устойчивости к антибиотикам в жидкой среде и были использованы в последующих исследованиях.

	Конечная концентрация	Основной раствор	Объем за 1 литр
NaNO 3	8,83 х 10 -4 М	75 г / л дН 2 O	1 мл
NH 4 Cl	3,63 х 10 -5 М	2,68 г / л дН 2 O	1 мл
β-глицерофосфата	1 х 10 -5 М	2,16 г / л дН 2 O	1 мл
H 2 SeO 3	1 х 10 -8 М	1,29 мг / л дН 2 O	1 мл
Трис-основание (рН 7,2)	1 х 10 -3 М	121,1 г / л дН 2 O	1 мл
К следов металла решения		Таблица 2	1 мл
е / 2 витамин решение		Таблица 3	0,5 мл

Таблица 1. Средние составляющие для роста О. ^{11 Тельца, 12.} Составьте общий объем 1 литра искусственной морской воды с соленостью 30 п.п., а также добавлять компоненты со склада выше решения, как указано. Фильтр-стерилизации среды и использования в течение недели. Акции всех соединений, кроме решения витамина могут быть объединены, чтобы добавить 6 мл этого раствора на каждый литр среды.

	Конечная концентрация	Основной раствор	Сумма за 1 литр
Na 2 ЭДТА • 2H 2 O	1 х 10 -4 М		41,6 г
FeCl 3 • 6H 2 O	1 х 10 -5 М		3,15 г
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O	1 х 10 -8 М	6,3 г / л дН 2 O	1 мл
ZnSO 4 • 7H 2 O	1 х 10 -9 М	22,0 г / л дН 2 O	1 мл
CoCl 2 • 6H 2 O	1 х 10 -9 М	10,0 г / л дН 2 O	1 мл
MnCl 2 • 4H 2 O	1 х 10 -8 М	180,0 г / л дН 2 O	1 мл
CuSO 4 • 5H 2 O	1 х 10 -8 М	9,8 г / л дН 2 O	1 мл

Таблица 2. Трассировка металл решение ^11,12. Макияж в общей сложности 1 литр, в дН ₂ O, и тепло, чтобы раствориться. Алиготе решение и заморозить для хранения. Окончательные концентрации указаны ссылки на окончательный средний, а не решение следов металла.

	Конечная концентрация	Основной раствор	Сумма за 1 литр
Витамин B 12	1 х 10 -10 М	1 г / л дН 2 O	1 мл
Биотин	1 х 10 -9 М	0,1 г / л дН 2 O	10 мл
Тиамин • HCl	1 х 10 -7 М		200 мг

Таблица 3. е / 2Витамин решение ^11. Сделайте в общей сложности до 1 литра в дН ₂ O, фильтр-стерилизации, аликвоты и заморозить. Окончательные концентрации указаны ссылки на окончательное среде, не витамин решение.

Рисунок 1. Графическое представление преобразования процедуры. Схематическое изображение процедуры генетически трансформировать Ostreococcus Тельца путем электропорации.

Рисунок 2. Культура роста. Клетки суб-культурных асептически в разведении 1/100 в свежих ASW каждые 7 дней и вырос под постоянным светом в рост растений инкубатор оснащен Moonlight синий фильтр. Интенсивность света должна быть близка к 20 мкмоль м ^-2 с ^-1 и поддерживается температура 20 ° С клетки не нуждаются в постоянной тревоге, но сХакен каждые 2 до 3 дней для предотвращения агрегации.

Рисунок 3. Колония образования на 0,2% агарозном LMP. Передача 4 пластин большой площади чашки Петри, а печать с парафильмом (вверху слева). Когда колонии образуются, просто выделите бесплатно (в идеале конической формы), колонии (вверху справа) и сосать их из пластины с пипеткой P200. Там должно быть никаких колоний на отрицательный контроль (внизу справа).

Обсуждение

Сотовые axeny государства и культуры имеет решающее значение для превращения процедуры. Хотя клетки, как правило, сохраняется в циклах 12 часов света, 12 часов темного, эффективность трансформации в клетки, выращенные в этих условиях оказались недостаточными. При повторном гранулирования / ресуспендирования шаги, клетки должны всегда ресуспендируют легко. Если ячейки совокупности, или слизь, как вещество присутствует, то лучше начать процедуру с самого начала еще раз. Как правило, около 50 колоний, можно ожидать на каждом преобразовании пластины, по сравнению с ни на отрицательной пластине управления. В случае низкой эффективности преобразования, условия культивирования должны быть изменены, чтобы обеспечить клетки находятся в оптимальном состоянии. Переменные, которые влияют на эффективность трансформации включают температуру окружающей среды в лаборатории (должна быть близка к 20 ° С) и скорости обработки (процедура от гранулирования клеток [2,3] для восстановления [2,7] должно ~ 1 час). Важно также, что все решенияповторно сделал свежий перед каждой трансформации. Для включения в виде пластин, концентрация агарозы LMP имеет решающее значение. Ostreococcus клетки не будут расти в высокой концентрации агарозы, и будут распространять в низких концентрациях.

Три преобразование векторов Ostreococcus были опубликованы ранее ⁶ и более векторов, как ожидается, будет создан и опубликован в ближайшее время. Существующий вектор Pot-Люк ⁶ позволяет использование промотора выбора в сочетании с С-концевыми люциферазы светляков тег позволяет быстрее трансгенных выбор линии плюс послушный моделей выражения, в то время как вектор Potox ⁶ несет сильный индуцируемый промотор ¹³ взята из Ostreococcus высокое сродство фосфат Transporter (HAPT) гена гиперэкспрессией гена. Potox-Люк вектор происходит от Potox, проведение дополнительных маркеров люциферазы, который можно использовать для косвенного отбора гиперэкспрессия линии 14. Успешный выбор маркеров на эти векторы нурсеотрицина и G148. Тем не менее, Ostreococcus клетки очень устойчивы ко многим антибиотикам, и концентрации соединений, необходимых для отбора трансгенных клеток Ostreococcus выше, чем у обычных систем модели (2 мг / мл).

Хотя этот процесс представляется неэффективной, большое количество клеток и ДНК плазмиды, необходимых для этой процедуры не представляет серьезное препятствие. Больше ограничений в том, что каждый порожденный линии, которая устойчива к выбору маркера необходимо анализировать индивидуально проверить, что вся конструкция интегрирована в ДНК. Мы наблюдали примеры, в которых успешное выражение селективного маркера не соответствует введение фактического гена, то есть частичная интеграция может произойти. Очевидно, что случайные вставки в геном также означает, что нет никакого контроля вставки сайт, используя этот метод, и методы бased на гомологичной рекомбинации в настоящее время разрабатываются. Тем не менее, метод, описанный здесь, чтобы нам известно, в настоящее время характеризуется только метод для создания генетически модифицированных клеток Ostreococcus.

Как Ostreococcus Тельца только недавно был использован в качестве экспериментальной модели организма, большинство методов работы с этими клетками, вероятно, будет развиваться и уточняться растущей исследования общины. Этот протокол предназначен, чтобы помочь людям начать работу с Ostreococcus, но отнюдь не претендует, чтобы описать все, что нужно знать о геномной трансформации этой микроводоросли. Авторы доверия, что читатели смогут адаптировать этот протокол для собственных нужд, как небольшие различия в инкубаторах (свет уровня или качества) и другие параметры, будет существовать и, вероятно, должны быть оптимизированы в каждой отдельной лаборатории для получения здоровых культур, необходимых для этого протокол. После освоения методов, описанных здесь,Векторы могут быть построены для создания люминесцентных, люминесцентных и других отмеченных линии слияния под контроль ряд промоторов. Эта замечательная платформа экспериментальный роман будет полезно изучить, как сложный биохимический проблемы решаются в эукариот сокращенного сложности, в которых фармакологических подходов весьма способствовало ^3.

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Средний составляющих
Химический	Номер по каталогу		Поставщик
Мгновенный Океан морской соли	от amazon.co.uk или rocketaquatics.co.uk
NaNO 3	S5506-250G		Сигма
NH 4 Cl	A9434-500G		Сигма
Глицерин 2-фосфата динатриевая соль гидрата	G9422-100G		Сигма
H 2 SeO 3	84920-250G		Сигма
Ультра чистый трис	15504-020		Invitrogen
Na 2 EDTA • 2H 2 O	BPE120-500G		Fisher Scientific
FeCl 3 • 6H 2 O	157740		Сигма
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O	31439-100G-R		Сигма
ZnSO 4 • 7H 2 O	Z0251		Сигма
CoCl 2 • 6H 2 O	31277		Сигма
MnCl 2 • 4H 2 O	203734-5G		Сигма
CuSO 4 • 5H 2 O	C8027		Сигма
Витамин B 12 (цианокобаламин)	V2876		Сигма
Биотин	47868		Сигма
Тиамин • HCl	T4625		Сигма
Ампициллин	A9518-25G		Сигма
Неомицин	N6386		Сигма
Канамицин	K4000		Сигма
Расходные материалы для культивирования
Пункт		Номер по каталогу	Поставщик
Tissue Culture Настой T25 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал		83.1810.502	Starstedt
Tissue Culture Настой T75 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал		83.1813.502	Starstedт
Tissue Culture Настой T175 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал		83.1812.502	Starstedt
ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 1 л, в комплекте		99950T	Елена Bioscience
ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 500,		99500T	Елена Bioscience
ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 250 мл,		99250T	Елена Bioscience
ТЭЦ бутылки верхнюю фильтров, 150 мл,		99150T	Елена Bioscience
Соленость метр морской аквариум		DSG-10	Daeyoon

Химикаты для преобразования
Химический	Каталогномер	Поставщик
D-сорбит	S6021-1 кг	Сигма
Pluronic F-68 решение	P5556-100мл	Сигма
ClonNat	51000	Вернер
Низкая температура плавления агарозы	16520-050	Invitrogen
Расходные материалы для преобразования
Пункт	Номер по каталогу	Поставщик
Tissue Culture Настой T25 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал	83.1810.502	Starstedt
Tissue Culture Настой T75 Подвеска культур вентилируется с Заливка канал	83.1813.502	Starstedt
Настой культуры ткани T175 Подвеска Cultures вентилируется с Заливка канал	83.1812.502	Starstedt
Greiner пробирок 50мл	227261	ГБО
Гена генератор / MicroPulser кювет, 0,2 см зазор, 50	165-2086	Bio-Rad
Петри круглый PS 3 ВЕНТС H14.2 Φ55	391-0895	VWR International
Петри квадратных четыре отверстия полистирола стерильные облучения ясно 120мм	FB51788	Fisher Scientific
Лунный свет синий светофильтр	183	Ли освещение