Trasformazione genomica del Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus Tauri</em

Riepilogo

Questo articolo descrive la trasformazione genetica della marina alga unicellulare Ostreococcus Tauri Mediante elettroporazione. Questo organismo eucariotico è una piattaforma modello efficace per le piante superiori, possesing notevolmente ridotto la complessità genomica e cellulare ed essere facilmente suscettibili di sia la cultura della biologia cellulare e chimica.

Abstract

I problemi più comuni che ostacolano rapidi progressi in Scienze della pianta includono cellulare, tissutale e la complessità intero organismo, e in particolare l'alto livello di ridondanza genomica genetica che colpisce semplici piante superiori. Il nuovo modello di organismo Ostreococcus Tauri è il più piccolo a vita libera eucariote conosciuta fino ad oggi, e possiede una dimensione del genoma molto ridotto e ^1,2 la complessità cellulare, si manifesta con la presenza di solo uno dei molti organelli (mitocondri, cloroplasti, pila del Golgi) per cella, e un genoma contenente soltanto ~ 8000 geni. Inoltre, la combinazione di unicellulari e della cultura semplice fornisce una piattaforma suscettibile di approcci di biologia chimica. Recentemente, Ostreococcus è stato impiegato con successo per studiare i meccanismi fondamentali alla base di indicazione dell'ora circadiano ^3-6. I risultati di questo organismo modello hanno avuto un impatto non solo la scienza delle piante, ma anche la biologia dei mammiferi ^7. Questo esempio mette in luce come una rapida sperimentazione in uneucariote semplice dal lignaggio verde può accelerare la ricerca in organismi più complessi, generando ipotesi verificabili con metodi tecnicamente fattibile solo in questo contesto di complessità ridotta. La conoscenza del genoma e la possibilità di modificare i geni sono strumenti essenziali nelle varie specie di modello. Genomic ^{1, 8} trascrittomica, proteomica e ⁹ le informazioni per questa specie è liberamente disponibile, mentre i metodi precedentemente segnalati ^6,10 per trasformare geneticamente Ostreococcus sono noti a pochi laboratori in tutto il mondo.

In questo articolo, i metodi sperimentali per trasformare geneticamente questo nuovo organismo modello con una sovraespressione costruire mediante elettroporazione è descritta in dettaglio, come pure il metodo di inserimento di cellule trasformate in percentuale agarosio bassa per consentire la selezione delle linee trasformate proveniente da un singola cellula trasformata. Dopo il successo dell'applicazione OstreocoCCU alla ricerca circadiano, l'interesse crescente Ostreococcus si può aspettare da aree di ricerca diverse all'interno e all'esterno delle scienze vegetali, comprese le zone biotecnologiche. I ricercatori provenienti da una vasta gamma di scienze biologiche e mediche che lavorano su conservate vie biochimiche può prendere in considerazione la ricerca perseguendo in Ostreococcus, senza la complessità genomica e organismal di specie modello più grande.

Protocollo

1. Preparazione del materiale algale

1. Ostreococcus cellule sono coltivate in acqua di mare artificiale (ASW). Sali marini (tipicamente circa 40 grammi per litro) vengono sciolti in acqua deionizzata ad una salinità di 30 ppt, come misurato utilizzando un misuratore salinità. Terreno di arricchimento ^11,12, elementi metallici oligoelementi e le vitamine sono aggiunti, come descritto nelle tabelle 1-3. I mezzi di comunicazione è quindi sterilizzata con filtro attraverso un filtro di 0,22 micron.
2. Per la manutenzione, le cellule del ceppo Ostreococcus OTTH95 sono sub-colta in modo asettico ad una diluizione di 1/100 in fresco ASW ogni 7 giorni e cresciuto sotto la luce costante in un incubatore di crescita delle piante dotate di filtro blu chiaro di luna. L'intensità della luce deve essere vicino a 20 pmol m ^-2 s ^-1 e la temperatura viene mantenuta a 20 ° C. Le cellule non richiedono agitazione costante, ma vengono agitate ogni 2 o 3 giorni per prevenire l'aggregazione.
3. Per ogni trasformazione, 50 ml di cellule sono richiesti in una cella density di 20-30 x 10 ⁶ ml ^-1, che dovrebbe essere raggiunto 5-7 giorni a seguito di sub-coltura. Densità approssimativa delle cellule e axeny può essere determinata utilizzando la citometria a flusso o un emocitometro ad un minimo di ingrandimento x40.

2. Elettroporazione

1. Preparare DNA per la trasformazione. Per ogni trasformazione, 5 pg di pura, DNA plasmidico linearizzato è richiesto ad una concentrazione di 1 pg / pl in acqua deionizzata sterile. Per ottenere questo DNA, gli autori raccomandano utilizzando un kit Qiagen midi preparazione, anche se altri metodi potrebbe funzionare ugualmente bene. Digerire il prodotto con un enzima che taglia nella spina dorsale del vettore utilizzato, ma non nel transgene o gene di selezione. Ulteriori purificare e concentrare il DNA lineare risultante dalla precipitazione con etanolo, e risospendere il prodotto in volume appropriato di alta qualità acqua sterile deionizzata.
2. Preparare le provette per microcentrifuga DNA contenenti 5 mg per ogni trasformazione. A Control senza DNA è necessaria per ciascuna linea cellulare da trasformare. Conservare le provette su ghiaccio, unitamente ad una cuvetta elettroporazione 2 mm per ogni trasformazione.
3. Preparare 2,2 ml di tampone risospensione per la trasformazione. Sciogliere Sorbitolo di una soluzione 1 M in ddh ₂ O, aggiungere 0,1% acido Pluronic F68 e filtro-sterilizzare.
4. Aggiungere acido Pluronic F68, ad una concentrazione finale di 0,1% per le cellule, e pellet per 10 minuti a 8000X g a 10 ° C in una provetta da 50 ml con fondo conico. Immediatamente risospendere le cellule in 1 ml di tampone di risospensione pipettando su e giù, e trasferire una provetta da microcentrifuga. Centrifugare per 10 minuti a 8000 xg a 10 ° C, e lavorare velocemente, ripetere questo passaggio di lavaggio ancora una volta.
5. Con una punta di taglio, risospendere ogni finale pellet in 40 microlitri di buffer di risospensione. Aggiungere 40 microlitri delle cellule risospese ad ogni tubo di DNA linearizzato su ghiaccio, mescolare delicatamente e trasferire nella cuvetta elettroporazione.
6. Mettere la cuvetta nel electroporazione macchina. Modificare le impostazioni a 6 kV cm ^-1, 600 Ω, e 25 uF. Elettroporare le cellule.
7. Incubare le cellule electoporated nelle cuvette a temperatura ambiente per 10 minuti, e usare questo tempo per preparare le fiasche di coltura di tessuto. Etichettare e aggiungere 30 ml di fresco ASW a ciascuno. Prendere 1 ml da ogni pallone e delicatamente aggiungere alla cuvetta corrispondente. Incubare per 2 minuti e rimuovere delicatamente il ASW, che ora contiene il globulo di cellule e delicatezza pipettare direttamente nel ASW nel pallone cultura.
8. Le cellule rimangono tipicamente in un globulo. Fare attenzione a non scuotere o disturbare le cellule aggregate in questo momento. Consentire alle cellule di recuperare in incubatrice per 1-2 ore, poi risospendere agitando le staffe. A questo punto, le cellule devono Risospendere liberamente e senza grumi dovrebbero essere visibili. Lasciare le culture per recuperare durante la notte in incubatrice.

3. Inclusione di Celle Piastre in terreno semisolido

1. Il giorno successivo, in autoclave una soluzione di 2,1% agarosio a basso punto di fusione in ddh ₂ O in una bottiglia contenente una bacchetta. Mantenere fuso a 65-90 ° C in un becker contenente acqua maggiore su un agitatore magnetico riscaldamento. Per ogni trasformazione preparare 8 Petri (55 mm di diametro) e 8 x 15 ml ciascuna provette contenenti 9 ml di ASW e la selezione desiderata. Se si utilizza Nourseothricin o G418, usare 2 mg / ml.
2. Raccogliere le cellule trasformate dal termostato. Lavorando in uno flowhood sterile, aggiungere 1 ml di agarosio LMP bollente al ml 9 in uno dei tubi. Chiudere la provetta, e mescolare per inversione. Poi aggiungere 0,5 ml di cellule appena trasformate, mescolare velocemente e versare nel piatto. Ripetere questa operazione con i restanti 7 tubi e quindi procedere al pallone trasformazione successiva.
3. Lasciare le piastre aprono nella cappa a flusso per un'ora, per l'agarosio per impostare. Quindi chiudere le piastre e trasferirli ai grandi piatti quadrati Petri, che terrà la 4 piatti ciascuno. Sigillare l'arguzia piazza piastreh parafilm. Si noti che le piastre non si imposta completamente, e come risultato, il gel è molto fragile. Si deve prestare attenzione a non rompere il gel durante la manipolazione delle lastre. Mettere tutti i piatti quadrati in incubatrice.

4. Selezione delle colonie trasformate

1. Le colonie dovrebbe apparire dopo 10 a 21 giorni sulle piastre di trasformazione, ma non sui piatti finti trasformati. Per scegliere le colonie usare una pipetta 200 ml con cut-off suggerimenti. Basta selezionare le colonie libere e succhiare la colonia verde. Fare attenzione a non includere le cellule delle colonie vicine.
2. Trasferire le cellule a 2 ml di terreno liquido contenente la selezione, in una piastra a 24 pozzetti. Quando si utilizza Nourseothricin, utilizzare 1,75 mg / ml. Mescolare pipettando su e giù. Selezionare 24-50 colonie per la trasformazione. Sigillare le piastre con parafilm e trasferimento in incubatrice.
3. Dopo una settimana, trasferire 100 ul di ciascun pozzetto a 2 ml fresco ASW con selezione in una piastra a 24 pozzetti e crescere per un additional 7 giorni. Linee cellulari sopravvissuti può essere utilizzato per ulteriori studi. Integrazione stabile nel numero genoma e l'inserimento devono essere analizzati mediante PCR e Southern Blot. Il DNA genomico può essere ottenuta per tali scopi utilizzando qualsiasi down-scala metodo standard per l'estrazione del DNA vegetale.

5. Risultati rappresentativi

Dividi celle 1/100 ha raggiunto una densità di 25 milioni di cellule per millilitro dopo essere cresciuto per 7 giorni. Elettroporazione delle cellule con le impostazioni appropriate comportato una costante di tempo tra 10 e 14 millisecondi. Quando le cellule sono trasferito su un supporto in fiasche di coltura, una pallina di cellule dovrebbero formare. Quando viene leggermente scosso dopo un'ora, le cellule dovrebbero facilmente riportare in sospensione. L'inclusione di 1 ml cellule trasformate in agar LMP 0,2% dovrebbe comportare in maniera coerente, ma solo semi-solido gel. Le colonie dovrebbe apparire dopo 10 a 21 giorni. Quando trasformando 5 pg di DNA linearizzato usando il protocollo sopra, 50-100 colonie per trasformazionepiastra sono state generalmente previsto, contro nessuno sulle piastre di controllo negativo. ~ 80% delle colonie sono state raccolte selezionate positivamente dalla resistenza agli antibiotici in terreno liquido e sono stati usati in studi successivi.

	Concentrazione finale	Soluzione madre	Volume per 1 litro
NaNO 3	8,83 x 10 -4 M	75 g / L dH 2 O	1 mL
NH 4 Cl	3,63 x 10 -5 M	2,68 g / L dH 2 O	1 mL
β-glicerofosfato	1 x 10 -5 M	2,16 g / L dH 2 O	1 mL
H 2 SeO 3	1 x 10 -8 M	1,29 mg / L dH 2 O	1 mL
Tris-base (pH 7,2)	1 x 10 -3 M	121,1 g / L dH 2 O	1 mL
K metalli in tracce soluzione		Tabella 2	1 mL
f / 2 una soluzione di vitamine		Tabella 3	0,5 mL

Tabella 1. Componenti medi per la crescita di O. Tauri ^{11, 12.} Portare un volume totale di 1 litro di acqua di mare artificiale a una salinità di 30 ppt, e aggiungere i componenti di cui sopra da soluzioni madre come indicato. Filtro-sterilizzare il terreno e l'uso entro una settimana. Gli stock di tutti i composti tranne la soluzione vitamina può essere mescolati per aggiungere 6 ml di questa soluzione per ogni litro di terreno.

	Concentrazione finale	Soluzione madre	Importo per 1 litro
Na 2 EDTA • 2H 2 O	1 x 10 M -4		41,6 g
FeCl 3 • 6H 2 O	1 x 10 -5 M		3,15 g
Na 2 Moo 4 • 2H 2 O	1 x 10 -8 M	6,3 g / L dH 2 O	1 mL
ZnSO 4 • 7H 2 O	1 M x 10 -9	22,0 g / L dH 2 O	1 mL
• CoCl 2 6H 2 O	1 M x 10 -9	10,0 g / L dH 2 O	1 mL
MnCl 2 • 4H 2 O	1 x 10 -8 M	180,0 g / L dH 2 O	1 mL
CuSO 4 • 5H 2 O	1 x 10 -8 M	9,8 g / L dH 2 O	1 mL

Tabella 2. Tracciare una soluzione in metallo ^11,12. Portare ad un totale di 1 litro, in dH ₂ O, e il calore per sciogliere. Aliquotare la soluzione per lo stoccaggio e congelamento. Le concentrazioni finali indicati si riferiscono al mezzo finale, non la soluzione dei metalli in tracce.

	Concentrazione finale	Soluzione madre	Importo per 1 litro
La vitamina B 12	1 x 10 -10 M	1 g / L dH 2 O	1 mL
Biotina	1 M x 10 -9	0,1 g / L dH 2 O	10 mL
• Tiamina HCl	1 x 10 -7 M		200 mg

Tabella 3. f / 2vitamina soluzione ^11. portare a un totale di 1 litro in dH ₂ O, filtro-sterilizzare, aliquotare e congelare. Le concentrazioni finali indicati si riferiscono al mezzo finale, non la soluzione di vitamine.

Figura 1. Visione grafica della procedura di trasformazione. Rappresentazione schematica della procedura per trasformare geneticamente Ostreococcus tauri mediante elettroporazione.

Figura 2. Crescita delle cellule della Cultura. Sono sub-colta in modo asettico ad una diluizione di 1/100 in fresco ASW ogni 7 giorni e cresciuto sotto la luce costante in un incubatore di crescita delle piante dotate di filtro blu chiaro di luna. L'intensità della luce deve essere vicino a 20 pmol m ^-2 s ^-1 e la temperatura viene mantenuta a 20 ° C Le cellule non richiedono agitazione costante, ma sono shaken ogni 2 o 3 giorni per prevenire l'aggregazione.

Figura 3. Formazione di colonie sul 0,2% di agarosio LMP. Transfer 4 piastre per un grande piatto quadrato Petri, e sigillare con parafilm (in alto a sinistra). Quando le colonie si sono formate, è sufficiente selezionare liberi (idealmente forma conica) colonie (in alto a destra) e succhiare fuori della piastra con una pipetta P200. Non ci dovrebbero essere le colonie per i controlli negativi (in basso a destra).

Discussione

Cellular axeny stato e la cultura è di cruciale importanza per la procedura di trasformazione. Sebbene le celle sono generalmente mantenute in cicli di 12 ore di luce, 12 ore buio, l'efficienza della trasformazione in cellule coltivate in queste condizioni sono risultate insufficienti. Durante i ripetuti pellettatura / risospensione passi, le celle devono sempre risospendere facilmente. Se aggregato cellule, o una sostanza simile a muco è presente, è meglio per iniziare la procedura dall'inizio di nuovo. Tipicamente, ~ 50 colonie può essere previsto su ciascuna piastra di trasformazione, rispetto nessuno sulla piastra di controllo negativo. In caso di scarsa efficienza di trasformazione, condizioni di coltura deve essere variato per garantire cellule sono nello stato ottimale. Le variabili che influenzano l'efficienza della trasformazione includono la temperatura ambiente in laboratorio (dovrebbe essere prossima ai 20 ° C) e velocità di movimentazione (Procedura di pellet cellule [2,3] per il recupero [2.7] dovrebbe prendere ~ 1 ora). È altresì importante che tutte le soluzioni are preparato fresco prima di ogni trasformazione. Per l'inclusione in piastre, la concentrazione di agarosio LMP è cruciale. Cellule Ostreococcus non crescerà in concentrazioni elevate di agarosio, e si diffonderà in basse concentrazioni.

Tre vettori di trasformazione per Ostreococcus sono stati pubblicati in precedenza ^6, e più vettori dovrebbero essere generato e pubblicato a breve. Il vettore esistente Pot-Luc ⁶ permette l'utilizzo di un promotore di scelta in combinazione con un C-terminale tag lucciola, luciferasi permettendo la selezione della linea più veloce, più modelli di espressione transgenica trattabili, mentre il vettore Potox ⁶ porta la forte promotore inducibile ¹³ ricavati dal Ostreococcus alta affinità fosfato Transporter (HAPT) gene per la sovraespressione del gene di interesse. Il Potox-Luc vettore deriva da Potox, portando un marcatore addizionale luciferasi che può essere utilizzato per la selezione indiretta di linee sovraespressione ^{14. Marcatori di selezione di successo su questi vettori sono Nourseothricin e G148. Tuttavia, le cellule Ostreococcus sono altamente resistenti a molti antibiotici, e le concentrazioni dei composti necessari per la selezione di cellule transgeniche Ostreococcus è più elevato che per sistemi modello convenzionale (2 mg / ml).}

Sebbene il processo risulta inefficiente, il numero di cellule e il DNA plasmide necessari per questa procedura non pone alcun ostacolo significativo. Una limitazione è più grande che ogni riga generato che è resistente al marcatore selezionabile deve essere analizzato singolarmente per verificare che l'intero costrutto viene integrato nel DNA. Abbiamo osservato esempi in cui espressione riuscita del marcatore selezionabile non corrispondono all'inserimento del gene di interesse effettivo; integrazioni cioè parziali possono verificarsi. Evidentemente, inserimento casuale nel genoma significa anche che non vi è alcun controllo del sito di inserimento utilizzando questo metodo, e metodi bulla base ricombinazione omologa sono attualmente in fase di sviluppo. Tuttavia, il metodo qui descritto è, a nostra conoscenza, attualmente l'unico metodo caratterizzato per generare cellule Ostreococcus geneticamente modificate.

Come Ostreococcus tauri solo recentemente è stata utilizzata come organismo modello sperimentale, la maggior parte dei metodi di lavoro con queste cellule è probabile evolversi ed essere perfezionato dalla comunità di ricerca sempre più coinvolta. Questo protocollo ha lo scopo di aiutare le persone con Ostreococcus avviare i lavori, ma in nessun modo pretende di descrivere tutto quello che c'è da sapere su genomica trasformazione di questa microalga. La fiducia gli autori che i lettori saranno in grado di adattare questo protocollo per le proprie esigenze, come piccole differenze di incubatori (livelli di luce o la qualità) e di altri parametri esistono e probabilmente devono essere ottimizzati in ogni singolo laboratorio per ottenere le culture sane necessari per questo protocollo. Dopo aver imparato le tecniche descritte qui,vettori possono essere costruiti per generare luminescente, fluorescenti, o altre linee di fusione etichetta sotto il controllo di una serie di promotori. Questo entusiasmante piattaforma sperimentale romanzo sarà utile per studiare come biochimici complessi problemi sono risolti in un eucariote di complessità ridotta, in cui approcci farmacologici sono molto facilitati ^3.

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Costituenti del terreno
Chimico	Numero di catalogo		Fornitore
Immediata Ocean Marine Salt	da amazon.co.uk o rocketaquatics.co.uk
NaNO 3	S5506-250G		Sigma
NH 4 Cl	A9434-500G		Sigma
Glicerolo 2-fosfato sale disodico idrato	G9422-100G		Sigma
H 2 SeO 3	84920-250G		Sigma
Ultra puro tris	15504-020		Invitrogen
EDTA • Na 2 2H 2 O	BPE120-500G		Fisher Scientific
FeCl 3 • 6H 2 O	157740		Sigma
Na 2 Moo 4 • 2H 2 O	31439-100G-R		Sigma
ZnSO 4 • 7H 2 O	Z0251		Sigma
• CoCl 2 6H 2 O	31277		Sigma
MnCl 2 • 4H 2 O	203734-5G		Sigma
CuSO 4 • 5H 2 O	C8027		Sigma
La vitamina B 12 (cianocobalamina)	V2876		Sigma
Biotina	47868		Sigma
• Tiamina HCl	T4625		Sigma
Ampicillin	A9518-25G		Sigma
Neomicina	N6386		Sigma
Kanamicina	K4000		Sigma
Materiali di consumo per la coltura
Voce		Numero di catalogo	Fornitore
Tissue Culture Flask T25 colture in sospensione ventilato con Versare Canale		83.1810.502	Starstedt
Tissue Culture Flask T75 colture in sospensione ventilato con Versare Canale		83.1813.502	Starstedt
Tissue Culture Flask T175 colture in sospensione ventilato con Versare Canale		83.1812.502	Starstedt
TPP bottiglie filtri top, 1L, completi		99950T	Bioscience Helena
Filtri bottiglie TPP top, 500ml,		99500T	Bioscience Helena
TPP bottiglie filtri migliori, 250ml,		99250T	Bioscience Helena
TPP bottiglie filtri top, 150ml,		99150T	Bioscience Helena
Misuratore di salinità per il Marine Aquarium		DSG-10	Daeyoon

Prodotti chimici per la trasformazione
Chimico	Catalogonumero	Fornitore
D-Sorbitolo	S6021-1KG	Sigma
Pluronic F-68 soluzione	P5556-100ML	Sigma
ClonNat	51000	Werner
Basso punto di fusione di agarosio	16520-050	Invitrogen
Materiali di consumo per la trasformazione
Voce	Numero di catalogo	Fornitore
Tissue Culture Flask T25 colture in sospensione ventilato con Versare Canale	83.1810.502	Starstedt
Tissue Culture Flask T75 colture in sospensione ventilato con Versare Canale	83.1813.502	Starstedt
Cultura Flask Tissue T175 Sospensione Cultures ventilato con Versare Canale	83.1812.502	Starstedt
Greiner provette da 50 ml	227261	GBO
Gene Pulser / MicroPulser cuvette da 0,2 cm, 50 gap	165-2086	Bio-Rad
Petri piatto tondo PS 3 VENTS H14.2 Φ55	391-0895	VWR International
Petri quadrata con quattro prese d'aria sterile in polistirolo da 120 millimetri irradiazione chiara	FB51788	Fisher Scientific
Moonlight filtrano la luce blu	183	Lee Lighting