Transformação genômica do Picoeukaryote<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Resumo

Este artigo descreve a transformação genética da alga marinha unicelular Ostreococcus tauri Por eletroporação. Este organismo eucariótico é uma plataforma de modelo eficaz para plantas superiores, possesing muito reduzida complexidade genômica e celular e de ser facilmente passíveis de ambos cultura de células e biologia química.

Resumo

Os problemas mais comuns que impedem um progresso rápido em Ciências da planta incluem tecido, celulares e complexidade organismo como um todo e, nomeadamente, o elevado nível de redundância genética genômica afetando simples em plantas superiores. O novo modelo organismo Ostreococcus tauri é o menor eucariota de vida livre conhecido até à data, e possui um tamanho de genoma grandemente reduzida e ^1,2 complexidade celular, que se manifesta-se pela presença de apenas uma da maioria dos organelos (mitocôndria, cloroplasto, pilha de Golgi) por celular, e um genoma que contém apenas ~ 8000 genes. Além disso, a combinação de unicellularity e cultura fácil proporciona uma plataforma passível de abordagens em biologia químicos. Recentemente, Ostreococcus tem sido empregada com sucesso para estudar mecanismos básicos subjacentes cronometragem circadiano ^3-6. Os resultados deste organismo modelo ter afetado não só a ciência das plantas, mas também a biologia dos mamíferos ^7. Este exemplo evidencia como a experimentação rápida em umeucarioto simples da linhagem verde pode acelerar a pesquisa em organismos mais complexos, gerando hipóteses testáveis ​​utilizando métodos tecnicamente viáveis ​​apenas neste fundo de menor complexidade. Conhecimento de um genoma ea possibilidade de modificar genes são ferramentas essenciais em qualquer espécie de modelo. Genomic ^1, transcriptomic ^{8, 9} e informação Proteômica para esta espécie está livremente disponível, ao passo que os métodos anteriormente relatados ^6,10 para transformar geneticamente Ostreococcus são conhecidos por poucos laboratórios em todo o mundo.

Neste artigo, os métodos experimentais para transformar geneticamente este organismo novo modelo com uma sobre-expressão de construção através de electroporação são descritas em detalhe, bem como o método de inclusão de células transformadas em baixo percentagem de agarose para permitir a selecção de linhas transformadas provenientes de uma único transformado da célula. Após o sucesso da aplicação OstreocoCCUs para pesquisa circadiano, o interesse crescente em Ostreococcus pode ser esperado de diversas áreas de pesquisa dentro e fora das ciências vegetais, incluindo áreas biotecnológicas. Pesquisadores de uma ampla gama de ciências biológicas e médicas que trabalham em conservadas vias bioquímicas podem considerar a investigação prossegue em Ostreococcus, livre da complexidade genômica e organismal de espécies de maior porte do modelo.

Protocolo

1. Preparação de Material de algas

1. As células são cultivadas em Ostreococcus água do mar artificial (ASW). Sais do mar (tipicamente cerca de 40 gramas por litro) são dissolvidos em água desionizada para uma salinidade de 30 ppt, tal como medido usando um medidor de salinidade. Meio de enriquecimento ^11,12, elementos vestigiais de metal e vitaminas são adicionados como descrito nas Tabelas 1-3. Os meios de comunicação é, então, esterilizada por filtração através de um filtro de 0,22 um.
2. Para a manutenção, as células de Ostreococcus estirpe OTTH95 são sub-cultivadas assepticamente a uma diluição de 1/100 em ASW fresco a cada 7 dias e cultivadas sob luz constante numa unidade de crescimento incubadora equipado com luar filtro azul. A intensidade da luz deve ser próximo de 20 umol m ^-2 s ^-1 e temperatura é mantida a 20 ° C. Células não requerem agitação constante, mas são agitados uma vez cada 2 a 3 dias para evitar a agregação.
3. Para cada transformação, 50 ml de células são necessários com uma célula density de 20-30 x 10 ⁶ ml ^-1, que deve ser atingido 5-7 dias após sub-cultura. A densidade celular aproximada e axeny pode ser determinada utilizando qualquer citometria de fluxo ou um hemocitómetro a um mínimo de aumento de 40X.

2. Eletroporação

1. Preparar DNA para a transformação. Para cada transformação, 5 ug de puro, o DNA linearizado plasmídeo é necessário a uma concentração de 1 ug / uL em água desionizada estéril. Para obter esse DNA, os autores recomendam usar um kit Qiagen midi preparação, embora outros métodos podem funcionar igualmente bem. Digerir o produto com uma enzima que corta na espinha dorsal do vector utilizado, mas não no transgene ou gene de selecção. Além disso purificar e concentrar o ADN linear resultante por precipitação com etanol, e ressuspender o produto no volume apropriado de alta qualidade da água desionizada estéril.
2. Preparar tubos de microcentrífuga contendo 5 ug de DNA para cada transformação. A controvérsial sem DNA é necessária para cada linha celular a ser transformado. Manter estes tubos em gelo, em conjunto com uma cuvete de electroporação 2 mm para cada transformação.
3. Preparar 2,2 ml de tampão de ressuspensão por transformação. Dissolver Sorbitol a uma solução 1 M em _ddH2O, adicionar 0,1% de ácido Pluronic F68 eo filtro-esterilizar.
4. Adicionar ácido plurónico F68, a uma concentração final de 0,1% para as células, e pellet-los durante 10 minutos a 8000X g, a 10 ° C num tubo de 50 ml com fundo cónico. Imediatamente ressuspender as células em 1 ml de tampão de ressuspensão por pipetagem para cima e para baixo, e transferir para um tubo de microcentrífuga. Girar para baixo durante 10 minutos a 8000 xg a 10 ° C, e trabalhando rapidamente, repetir este passo de lavagem mais uma vez.
5. Com uma ponta de corte, ressuspender cada sedimento final em 40 ul de tampão de ressuspensão. Adicionar 40 ul de as células ressuspensas a cada tubo de DNA linearizado em gelo, misturar suavemente e transferir para a cuvete de electroporação.
6. Coloque a cuba no electropmáquina de oração. Altere as configurações para 6 kV cm ^-1, 600 Ω e 25 uF. Electroporate as células.
7. Incubar as células electoporated nas cuvettes à temperatura ambiente durante 10 minutos, e usar esse tempo para preparar os frascos de cultura de tecidos. Identificá-los e adicionar 30 ml de ASW fresco a cada um. Tomar 1 ml de cada frasco e suavemente adicioná-la à cuvete correspondente. Incubar durante 2 minutos e remover suavemente a ASW, agora contendo o glóbulo de células e suavemente e lentamente pipetar directamente para o ASW no frasco de cultura.
8. Células permanecem tipicamente em um glóbulo. Tome cuidado para não abalar ou perturbar as células agregadas neste momento. Permitir que as células para se recuperar na incubadora durante 1-2 horas, em seguida, ressuspender por agitação dos frascos. Neste momento, as células devem ressuspender livremente e não aglomerados deve ser visível. Deixe as culturas para se recuperar durante a noite na incubadora.

3. Inclusão de células em placas em meio semi-sólido

1. No dia seguinte, autoclave uma solução de 2,1% de agarose de baixo ponto de fusão em _ddH2O em um frasco contendo uma haste de agitação. Manter fundido a 65-90 ° C em um copo contendo água maior sobre um agitador magnético de aquecimento. Para cada transformação preparar 8 placas de Petri (55 mm de diâmetro) e 8 x 15 ml tubos cada um contendo 9 ml de ASW mais a selecção requerida. Se usando Nourseothricin ou G418, utilizar 2 mg / ml.
2. Recolher as células transformadas a partir da incubadora. Trabalhando em um flowhood estéril, adicionar 1 ml de ebulição LMP de agarose para os 9 ml de um dos tubos. Fechar o tubo e misturar por inversão. Em seguida, adicionar 0,5 ml de células de fresco transformadas, de forma rápida e misturar verter na placa. Repita esse processo com os restantes 7 tubos e prossiga para o balão de transformação que vem.
3. Deixar as placas abrir na capela de fluxo por uma hora, para a agarose a ser definido. Em seguida, feche as placas e transferi-los para grandes pratos quadrados de Petri, que irá realizar 4 placas cada. Selar a sagacidade placas quadradash parafilme. Note-se que as placas não irá definir completamente, e como resultado, o gel é muito frágil. Cuidados devem ser tomados para não quebrar o gel durante a movimentação das placas. Coloque todas as placas quadradas na incubadora.

4. Seleção de colónias transformadas

1. Colónias deve aparecer após 10 a 21 dias, com as placas de transformação, mas não sobre as placas de simulação transformadas. Para escolher colônias usar uma pipeta de 200 ul com dicas de corte. Basta selecionar colônias livres e sugar a colônia verde. Tome cuidado para não incluir todas as células de colônias vizinhas.
2. Transferir as células a 2 ml de meio líquido contendo a selecção, numa placa de poços 24. Quando se utiliza Nourseothricin, usar 1,75 mg / ml. Misturar por pipetagem cima e para baixo. Selecione 24-50 colônias por transformação. Selar as placas com parafilme e transferência para a incubadora.
3. Após uma semana, transferir 100 uL de cada poço a 2 ml fresco ASW com selecção de uma placa de poços 24 e crescer para uma additional 7 dias. Linhas de células sobreviventes pode ser usado para estudos posteriores. Integração estável no número genoma e inserção deve ser analisado utilizando PCR e Southern Blot. O ADN genómico pode ser obtido para estes fins, utilizando qualquer método para baixo em escala padrão para extracção de ADN de plantas.

5. Os resultados representativos

Células divididas 1/100 atingiu uma densidade de 25 milhões de células por mililitro após crescimento durante 7 dias. Eletroporação das células com as configurações adequadas resultou em um tempo de constantes entre 10 e 14 milissegundos. Quando as células são transferidas para o meio em frascos de cultura, um glóbulo de células deve formar-se. Quando levemente abalada depois de uma hora, as células devem facilmente ressuspender. A inclusão de células de 1 ml transformadas em agar LMP 0,2% deverá resultar num consistente, mas apenas gel semi-sólido. Colónias deve aparecer após 10 a 21 dias. Quando transformando 5 ug de DNA linearizado utilizando o protocolo anterior, 50-100 colónias por transformaçãoplaca foram tipicamente esperado, versus nenhum sobre as placas de controlo negativo. ~ 80% das colónias escolhidas foram positivamente seleccionadas pela resistência a antibióticos em meio líquido e foram utilizados em estudos subsequentes.

	Concentração final	Solução estoque	Volume para 1 litro
NaNO 3	8,83 x 10 -4 M	75 g / L de dH2O	1 mL
De NH4CI	3,63 x 10 ~ 5 M	2,68 g / L de dH2O	1 mL
β-glicerofosfato	1 x 10 ~ 5 M	2,16 g / L de dH2O	1 mL
H 2 3 SeO	1 x 10 -8 M	1,29 mg / L de dH2O	1 mL
Tris-base (pH 7,2)	1 x 10 M -3	121,1 g / L de dH2O	1 mL
K solução de metal traço		Tabela 2	1 mL
f / 2 solução de vitaminas		Tabela 3	0,5 mL

Tabela 1. Constituintes do meio para o crescimento de O. tauri ^{11, 12.} Perfazer um volume total de 1 litro de água do mar artificial a uma salinidade de 30 ppt, e adicionar os componentes acima a partir de soluções de reserva, como indicado. Filtrar a esterilizar o meio e utilização dentro de uma semana. Existências de todos os compostos, excepto a solução de vitaminas podem ser agrupados para adicionar 6 ml desta solução para cada litro de meio.

	Concentração final	Solução estoque	Valor para 1 litro
Na 2 EDTA • 2H 2 O	1 x 10 M -4		41,6 g
FeCl 3 6H 2 O •	1 x 10 ~ 5 M		3,15 g
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O	1 x 10 -8 M	6,3 g / L de dH2O	1 mL
ZnSO 4 • 7H 2 ó	1 x 10 -9 M	22,0 g / L de dH2O	1 mL
CoCl 2 • 6H 2 O	1 x 10 -9 M	10,0 g / L de dH2O	1 mL
MnCl 2 • 4H 2 O	1 x 10 -8 M	180,0 g / L de dH2O	1 mL
CuSO 4 • 5H 2 O	1 x 10 -8 M	9,8 g / L dH 2 ó	1 mL

Tabela 2. Rastreamento de metal solução ^11,12. Perfaz-se a um total de 1 litro, _em dH2O, e aquece-se dissolver. Solução alíquota eo congelamento para armazenamento. As concentrações finais indicadas referem-se ao meio final, não a solução de vestígios metálicos.

	Concentração final	Solução estoque	Valor para 1 litro
A vitamina B 12	1 x 10 -10 M	1 g / L de dH2O	1 mL
Biotina	1 x 10 -9 M	0,1 g / L de dH2O	10 mL
• A tiamina HCl	1 x 10 -7 M		200 mg

Tabela 3. f / 2vitamina solução ^11. Perfazer para um total de 1 litro _em dH2O, filtro-esterilizar, alíquota e congelar. As concentrações finais indicadas referem-se ao meio final, não a solução de vitaminas.

Figura 1. Resumo gráfica do processo de transformação. Representação esquemática do procedimento para transformar geneticamente Ostreococcus tauri por electroporação.

Figura 2. Células de crescimento da cultura. São sub-cultivadas assepticamente a uma diluição de 1/100 em ASW fresco a cada 7 dias e cultivadas sob luz constante numa unidade de crescimento incubadora equipado com luar filtro azul. A intensidade da luz deve ser próximo de 20 umol m ^-2 s ^-1 e temperatura é mantida a 20 ° C Células não requerem agitação constante, mas são sHaken uma vez cada 2 a 3 dias para evitar a agregação.

Figura 3. Formação de colônias em 0,2% agarose LMP. Transferência de 4 placas de uma placa de Petri grande e quadrada, e vedação com parafilme (superior esquerdo). Quando formaram colônias, basta selecionar livres (de preferência de forma cónica) colônias (canto superior direito) e sugá-los para fora da placa com uma pipeta de p200. Não deve haver colônias no controle negativo (inferior direito).

Discussão

Axeny estado e cultura celular é de importância crucial para o processo de transformação. Embora as células são normalmente mantida em ciclos de 12 horas de luz, 12 horas escuro, a eficiência da transformação nas células cultivadas sob estas condições foram encontrados para ser insuficiente. Durante os repetidos granulação / ressuspensão etapas, as células devem sempre ressuspender facilmente. Se as células agregado, ou uma substância muco-como é presente, é melhor para iniciar o processo desde o início novamente. Tipicamente, ~ 50 colónias pode ser esperado em cada placa de transformação, versus nenhum sobre a placa de controlo negativo. No caso de baixa eficiência de transformação, as condições de cultura deve ser variada para assegurar células estão no estado ideal. As variáveis ​​que afectam a eficiência de transformação incluem a temperatura ambiente no laboratório (deve estar próxima de 20 ° C) e velocidade de manipulação (Processo de granulação células [2,3] para recuperação [2,7] deve tomar ~ 1 hora). É também importante que todas as soluções de umre feito fresco antes de cada transformação. Para inclusão em placas, a concentração de LMP de agarose é crucial. Células Ostreococcus não crescerão em concentrações elevadas de agarose, e irá difundir em baixas concentrações.

Três vetores de transformação para Ostreococcus foram publicados anteriormente ^6, e mais vetores devem ser gerados e publicados em breve. O vector existente Pot-Luc ⁶ permite a utilização de um promotor de escolha, em combinação com uma etiqueta de pirilampo C-terminal da luciferase permitindo a selecção de linhas transgénicas mais rápida, mais padrões de expressão tratáveis, enquanto que o vector Potox ⁶ transporta o forte promotor indutível ¹³ tirada da Ostreococcus Fosfato de alta afinidade gene transportador (HAPT) para sobre-expressão de gene de interesse. O vector Potox-Luc deriva Potox, transportando um marcador de luciferase adicional que pode ser utilizada para a selecção de linhas indirecta superexpressão 14. Marcadores de seleção de sucesso sobre esses vetores são Nourseothricin e G148. No entanto, as células Ostreococcus são altamente resistentes a vários antibióticos, e as concentrações de compostos necessários para a selecção de células transgénicas Ostreococcus é maior do que para os sistemas de modelo convencional (2 mg / ml).

Embora o processo parece ineficiente, o grande número de células e ADN de plasmídeo necessária para este procedimento não representa qualquer obstáculo significativo. Um maior limitação é que cada linha gerada, que é resistente ao marcador seleccionável precisa de ser analisadas individualmente para verificar que a construção inteira está integrado no DNA. Observamos exemplos em que a expressão bem sucedida do marcador seleccionável não correspondiam a inserção do gene de interesse real; integrações ie parciais podem ocorrer. Evidentemente, a inserção aleatória no genoma também significa que não existe controlo do local de inserção utilizando este método, e métodos bom base na recombinação homóloga estão sendo desenvolvidos atualmente. No entanto, o método aqui descrito é, para o nosso melhor conhecimento, actualmente o único método caracterizado para gerar células Ostreococcus geneticamente modificados.

Como Ostreococcus tauri só recentemente foi usado como um organismo modelo experimental, a maioria dos métodos de trabalho com essas células é susceptível de evoluir e ser refinado pela comunidade de pesquisa em crescimento envolvidos. Este protocolo destina-se a ajudar as pessoas a iniciar os trabalhos com Ostreococcus, mas nem por isso pretende descrever tudo o que há para saber sobre a transformação genômico da microalga. A confiança autores que os leitores serão capazes de se adaptar este protocolo para suas próprias necessidades como pequenas diferenças em incubadoras (níveis de luz ou de qualidade) e os outros parâmetros existentes e provavelmente terá de ser otimizado em cada laboratório individual para obter as culturas saudáveis ​​necessários para este protocolo. Depois de dominar as técnicas descritas aqui,vectores podem ser construídos para gerar luminescente, fluorescente, ou outras linhas de fusão etiquetados sob o controlo de uma variedade de promotores. Esta plataforma experimental emocionante novela será útil para estudar como os complexos problemas bioquímicos são resolvidos em um eucarionte de complexidade reduzida, em que abordagens farmacológicas são altamente facilitada ^3.

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Constituintes do meio
Químico	Número de catálogo		Fornecedor
Instantânea Marinha do Oceano Sal	da amazon.co.uk ou rocketaquatics.co.uk
NaNO 3	S5506-250G		Sigma
De NH4CI	A9434-500G		Sigma
Glicerol 2-fosfato hidrato de sal dissódico	G9422-100G		Sigma
H 2 3 SeO	84920-250G		Sigma
Ultra pura tris	15504-020		Invitrogen
Na 2 EDTA • 2 O 2H	BPE120-500G		Fisher Scientific
FeCl 3 6H 2 O •	157740		Sigma
Na 2 MoO 4 • 2H 2 O	31439-100G-R		Sigma
ZnSO 4 • 7H 2 ó	Z0251		Sigma
CoCl 2 • 6H 2 O	31277		Sigma
MnCl 2 • 4H 2 O	203.734-5G		Sigma
CuSO 4 • 5H 2 O	C8027		Sigma
A vitamina B 12 (cianocobalamina)	V2876		Sigma
Biotina	47868		Sigma
• A tiamina HCl	T4625		Sigma
Ampicilina	A9518-25G		Sigma
Neomicina	N6386		Sigma
Canamicina	K4000		Sigma
Os consumíveis para a cultura
Item		Número de catálogo	Fornecedor
Frasco para cultura de tecidos T25 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal		83.1810.502	Starstedt
Frasco para cultura de tecidos T75 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal		83.1813.502	Starstedt
Frasco para cultura de tecidos T175 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal		83.1812.502	Starstedt
Garrafa TPP filtros principais, 1l, completos		99950T	Helena Bioscience
Filtros Garrafa TPP topo, 500ml,		99500T	Helena Bioscience
Garrafa TPP filtros topo, 250ml,		99250T	Helena Bioscience
Garrafa TPP filtros topo, 150ml,		99150T	Helena Bioscience
Medidor de Salinidade para Marine Aquarium		DSG-10	Daeyoon

Produtos químicos para a transformação
Químico	Catálogonúmero	Fornecedor
D-Sorbitol	S6021-1KG	Sigma
Solução de Pluronic F-68	P5556-100ML	Sigma
ClonNat	51000	Werner
Baixo ponto de fusão de agarose	16520-050	Invitrogen
Consumíveis para a transformação
Item	Número de catálogo	Fornecedor
Frasco para cultura de tecidos T25 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal	83.1810.502	Starstedt
Frasco para cultura de tecidos T75 culturas em suspensão perfurada com derramamento Canal	83.1813.502	Starstedt
Frasco de cultura de tecido T175 Suspensão Cultures perfurada com derramamento Canal	83.1812.502	Starstedt
Tubos de centrífuga Greiner 50ml	227261	GBO
Gene Pulser / MicroPulser Cubetas, 0,2 gap cm, 50	165-2086	Bio-Rad
Petri prato redondo PS 3 ABERTURAS H14.2 Φ55	391-0895	VWR International
Placa de Petri quadrado, com quatro saídas de poliestireno estéril por 120 milímetros de irradiação clara	FB51788	Fisher Scientific
Luar Azul filtro de luz	183	Lee Iluminação