Picoeukaryote genomik Dönüşüm<em&gt; Ostreococcus tauri</em

Özet

Bu makalede, tek hücreli deniz alg genetik dönüşümü anlatılmaktadır Ostreococcus tauri Elektroporasyonla. Bu ökaryot organizma büyük ölçüde azaltılmış genomik ve hücresel karmaşıklığı haiz ve hücre kültürü ve kimyasal biyoloji hem de kolayca uysal biri, yüksek bitkiler için etkili bir model platformdur.

Özet

Bitki Bilimleri hızlı ilerleme engelleyen ortak sorunları hücresel, doku ve tüm organizmanın karmaşıklığı ve yüksek bitkiler basit genetik etkileyen genomik fazlalık özellikle yüksek düzeyde bulunmaktadır. Yeni model organizma Ostreococcus tauri bugüne kadar bilinen en küçük serbest yaşayan ökaryot ve başına en organellerin sadece biri (mitokondri, kloroplast, golgi yığını) varlığı ile kendini gösteren büyük oranda azaltılmış genom büyüklüğü ve hücresel karmaşıklık ^1,2, sahip Hücre ve sadece ~ 8.000 gen içeren bir genomu. Dahası, unicellularity ve kolay bir kültür kombinasyonu kimyasal biyolojisi yaklaşımlara müsait bir platform sağlar. Son zamanlarda, Ostreococcus başarıyla sirkadiyen Timekeeping ^3-6 altında yatan temel mekanizmaları incelemek için kullanılmıştır. Bu model organizma sonuçları memeli biyoloji ⁷ bitki bilimi sadece etkiledi, ama var. Bu örnek, nasıl hızlı bir deney vurgulamaktadıryeşil soydan basit ökaryot yalnızca sınırlı karmaşıklığı bu arka planda teknik olarak uygulanabilir yöntemlerle sınanabilir hipotezler üretme, daha kompleks organizmalarda araştırma hızlandırabilir. Bir genom ve genler değiştirmek olanağı Bilgi herhangi bir model türler için temel araçlardır. Genetik Ostreococcus dönüştürmek için daha önce bildirilen yöntemler ^6,10 dünyada çok az laboratuar bilinmektedir ise Genomik ^1, Transkriptomik ^8, ve bu türler için Proteomik ⁹ bilgiler, özgürce kullanılabilir.

Bu makale, deney yöntemleri genetik elektroporasyon yoluyla yapı ayrıntılı olarak belirtildiği gibi dönüştürülmüştür hatları seçimi, bir kaynaklanan izin verecek şekilde düşük oranda agaroz in transforme hücreler dahil edilmesi metodu olan bir aşırı ekspresyonu ile Bu yeni model organizma dönüştürmeye tek hücre dönüştürdü. Ostreoco başarılı uygulama sonrasındasirkadiyen araştırma ccus, Ostreococcus artan bir ilgi biyoteknolojik alanlarda dahil olmak üzere bitki bilimleri, içinde ve dışında çeşitli araştırma alanları beklenebilir. Korunmuş biyokimyasal yollar üzerinde çalışmak biyoloji ve tıp bilimleri, geniş bir alanda araştırmacılar büyük bir model türlerinin genomik ve organizma karmaşıklığı ücretsiz Ostreococcus içinde takip araştırma, düşünebilirsiniz.

Protokol

1. Alg Malzeme Hazırlanması

1. Ostreococcus hücrelerin yapay deniz suyu (ABY) kültürlenmiştir. Deniz tuzları (litre başına tipik olarak yaklaşık 40 gram) 30 bir tuz için deiyonize su içinde çözülür, ppt gibi bir tuz sayacı kullanılarak ölçüldü. 1-3 Tablolarda tarif edildiği gibi Zenginleştirme orta ^11,12, eser elementler metal ve vitaminler eklenir. Ortam 0.22 um bir filtreden daha sonra filtre ile sterilize edilmiş olup.
2. Bakım için Ostreococcus gerginlik OTTH95 hücreleri taze ASW her 7 günde 1/100 dilusyondaki aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m ^-2 s ^-1 olmalıdır ve sıcaklık 20 ° C'de muhafaza edilir Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez, ancak her 2 ila 3 gün agregasyonunu önlemek için bir kez çalkalanır.
3. Her bir dönüşüm için, hücreler 50 ml de bir hücre gerekmektediralt-kültür takiben 5-7 gün elde edilmelidir 20-30 x 10 ⁶ ml ^-1, bir nsity. Yaklaşık hücre yoğunluğu ve axeny x40 büyütme en az akış sitometrisi ya da bir ya haemocytometer kullanılarak belirlenebilir.

2. Elektroporasyon

1. Dönüşümü için DNA hazırlamak. Her bir dönüşüm için, saf, linearised plazmid DNA 5 ug steril deiyonize su içinde 1 mg / ml arasında derişimde gereklidir. Diğer yöntemler işe eşit derecede iyi olabilir ama bu DNA elde etmek için, yazarlar, Qiagen midi hazırlık kiti kullanmanızı öneririz. Bir kullanılan vektörün omurgasında kesen bir enzimi, ancak transgen ya da seçim geni olan ürünün sindirilmesi. Daha da saflaştırmak ve etanol çökeltme ile sonuçta elde edilen DNA doğrusal konsantre ve yüksek kaliteli bir steril deiyonize su uygun hacimde yeniden süspanse ürünü.
2. Her bir dönüşüm için 5 ug DNA içeren tüpler mikrosantrifüj hazırlayın. Bir controHer bir hücre dizisi transforme edilmesi için bir DNA ile l gereklidir. Her bir dönüşüm için bir küvet 2 mm elektroporasyon ile birlikte, buz üzerinde bu tüplerin tutmak.
3. Dönüşüm başına tabanda tamponu 2.2 ml hazırlayın. GKD ₂ O içinde 1 M çözüm Sorbitol eritilir,% 0.1 Pluronic asit F68 ve filtre-sterilize ekleyin.
4. Konik alt ile bir 50 ml nihai bir tüp içinde hücreleri% 0.1 'lik konsantrasyonu, 10 ve at 8000X g'de 10 dakika boyunca granül bunların ° C ila Pluronic F68 asit, ekleyin. Hemen yukarı veya aşağı doğru pipet ile tarafından yeniden süspanse tampon 1 ml içinde tekrar süspansiyon hücreleri, ve bir mikrofüj tüpe transfer. 10 ° C'de 8000 xg'de 10 dakika aşağı doğru döndürün ve hızlı şekilde çalışma, bir kez daha bu yıkama adımı tekrarlayın.
5. Bir kesim ucu ile yeniden süspanse tampon 40 ul her son pelletini. Buz üzerinde linearised DNA'nın her tüpüne süspanse hücreler 40 ul ekleyin, hafifçe karıştırın ve elektroporasyon küvetine transfer.
6. Electrop de küvet koyunnutuk makinesi. 6 kV cm ^-1, 600 Ω ve 25 uF için ayarlarını değiştirin. Hücreleri Electroporate.
7. 10 dakika için oda sıcaklığında küvet içinde electoporated hücreleri inkübe ve doku kültür şişeleri hazırlamak için olduğu zaman kullanılır. Onları etiketlemek ve her taze ASW 30 ml ekleyin. Her balona 1 ml çıkarın ve yavaşça ilgili küvet ekleyin. 2 dakika inkübe ve yavaşça ASW kaldırmak, şimdi yavaşça hücrelerin damlası içeren ve yavaş yavaş kültür şişelerinde ASW doğrudan Pipeti.
8. Hücreler genellikle bir damlası kalır. Bu anda toplu hücreler sallamayın veya rahatsız dikkat edin. Hücreleri 1-2 saat inkübatörde kurtarmak için izin ver, sonra şişeleri sallayarak tekrar süspansiyon. Bu zamanda, hücre serbestçe tekrar süspansiyon olmalıdır ve hiçbir topaklar görülmelidir. Inkübatörde gecede kurtarmak için kültürleri bırakın.

3. Yarı-katı Ortamda Tabaklar Hücreler dahil edilmesi

1. Ertesi gün, bir karıştırma çubuğu içeren bir şişe içinde GKD ₂ O% 2.1 düşük erime noktası agaroz çözeltisi otoklavlama. Bir ısıtma altmda manyetik bir karıştırıcı su içeren bir cam kapta daha 65-90 ° C sıcaklıkta erimiş tutmak. Her dönüşüm için 9 ASW ml artı gerekli seçimi içeren 8 Petri (55 mm çap) ve 8 x 15 ml tüpler her hazırlamak. Nourseothricin veya G418 kullanıyorsanız, 2 mg / ml kullanın.
2. Kuluçka gelen dönüştürülmüş hücreler toplanır. Steril bir flowhood çalışan, tüplerin birinde 9 ml kaynar LMP agaroz 1 ml ilave edilir. Tüp kapatılır ve alt üst edilerek karıştırılır. Sonra, taze transforme hücreler 0.5 ml eklemek hızlı karıştırın ve plaka içine dökün. Kalan 7 tüpleri ile bu işlemi yineleyin ve ardından sonraki dönüşüm şişesi geçin.
3. Agaroz ayarlamak için tabak, bir saat boyunca akış kaputu açık bırakın. Sonra tabak kapatın ve 4 plakaları her tutacak büyük kare Petri, aktarabilirsiniz. Kare plakalar zekâ Sealh parafilm. Plakalar tamamen ayarlanır unutmayın, ve sonuç olarak, jel çok hassastır. Bakım tabak tutarken jel kırmamaya dikkat edilmelidir. Inkübatör tüm kare tabak yerleştirin.

4. Dönüştürülmüş Kolonileri Seçimi

1. Koloniler dönüşüm plakaları 10 ila 21 gün sonra, ancak davalarını dönüştürdü plakalar üzerinde görünmelidir. Koloniler kesme ipuçları ile 200 ul pipet kullanmak toparlamak için. Sadece ücretsiz koloniler seçin ve yeşil koloni berbat. Komşu kolonilerden herhangi bir hücre dahil etmemeye dikkat edin.
2. Bir 24 kuyu plaka, seçimi ihtiva eden sıvı bir ortam, 2 ml kadar hücreleri transfer edin. Nourseothricin kullanıldığı zaman, 1.75 mg / ml kullanabilir. Aşağı pipetleme tarafından karıştırın. Dönüşüm başına 24-50 koloniler seçin. Parafilm ve inkübatör için transfer yüzeyleri.
3. Bir hafta sonra, 24 kuyu plaka seçimi ile 2 ml taze ASW her iyi 100 ul aktarmak ve bir additiona için büyümekl 7 gün. Hayatta kalan hücre çizgileri başka çalışmalar için kullanılabilir. Genomu ve ekleme numarasına Kararlı entegrasyon PCR ve Southern Blot kullanılarak analiz edilmelidir. Genomik DNA bitki DNA ekstraksiyonu için herhangi bir yere ölçekli standart metot kullanılarak bu amaçlar için elde edilebilir.

5.. Temsilcisi Sonuçlar

Hücreler 1/100 7 gün boyunca gelişen sonra, mililitrede 25 milyon hücrelik bir yoğunlukta ulaşmıştır bölünür. Ayarları uygun olan hücrelerin elektroporasyon bir zaman sabiti 10 ila 14 milisaniye ile sonuçlanmıştır. Hücrelerinin kültür şişeleri içinde orta aktarıldığında, hücrelerin bir damlası oluşturması gerekir. Hafif bir saat sonra çalkalandı zaman, hücrelerin kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. % 0.2 LMP agar içine 1 ml transforme hücreler dahil edilmesi tutarlı ama sadece yarı katı jel neden. Kolonileri 10 ile 21 gün sonra görünmelidir. dönüşüm başına yukarıda protokolünü kullanarak linearised DNA 5 mikrogram dönüştüren, 50-100 kolonilerplaka genellikle negatif kontrol plakalar üzerinde hiçbir karşılık, bekleniyordu. ~ Seçilmiş kolonilerin% 80 pozitif sıvı ortam içinde antibiyotik direnci ile seçilmiştir ve müteakip çalışmalarda kullanılan edildi.

	Nihai konsantrasyon	Stok çözelti	1 litre için Hacmi
NaNO 3	8.83 x 10 -4 M	75 g / L dH 2 O	1 mL
NH4CI	3.63 x 10 -5 M	2.68 g / L dH 2 O	1 mL
β-gliserofosfat	1 x 10 -5 M	2.16 g / L dH 2 O	1 mL
H 2 SeO 3	1 x 10 -8 M	1.29 mg / L dH 2 O	1 mL
Tris-bazlı (pH 7.2)	1 x 10 -3 M	121.1 g / L dH 2 O	1 mL
K eser metal çözüm		Tablo 2	1 mL
f / 2 vitamini çözüm		Tablo 3	0,5 mL

Tablo 1. O. büyüme için Orta bileşenlerin tauri ^{11, 12.} 30 ppt tuzluluk bir yapay deniz suyu 1 litre toplam hacmi Makyaj ve belirtildiği gibi stok solüsyonlar yukarıda bileşenlerini ekleyin. Bir hafta içinde orta ve kullanım Filter-sterilize edin. Vitamin çözeltisi dışında bütün bileşiklerin stokları orta her bir litre için bu çözelti 6 ml eklemek için havuzlanmış edilebilir.

	Nihai konsantrasyon	Stok çözelti	1 litre için Tutarı
Na 2 EDTA • 2H 2 O	1 x 10 -4 M		41.6 g
FeCl 3 • 6H 2 O	1 x 10 -5 M		3.15 g
Na 2 Moo 4 • 2H 2 O	1 x 10 -8 M	6.3 g / L dH 2 O	1 mL
ZnSO 4 • 7H 2 O	1 x 10 -9 M	22.0 g / L dH 2 O	1 mL
CoCl 2 • 6H 2 O	1 x 10 -9 M	10.0 g / L dH 2 O	1 mL
MnCl 2 • 4H 2 O	1 x 10 -8 M	180.0 g / L dH 2 O	1 mL
CuSO 4 • 5H 2 O	1 x 10 -8 M	9.8 g / L dH 2 O	1 mL

Tablo 2. Metal çözüm ^11,12 çiziniz. Bir dH ₂ O 1 litre toplam, ve çözülmekte ısı kadar olun. Depolama için tablet çözümü ve dondurma. Final konsantrasyonları son ortamı değil, eser metal çözümü için verilmiştir.

	Nihai konsantrasyon	Stok çözelti	1 litre için Tutarı
Vitamin B 12	1 x 10 -10 M	1 g / L dH 2 O	1 mL
Biotin	1 x 10 -9 M	0.1 g / L dH 2 O	10 mL
Tiamin • HCl	1 x 10 -7 M		200 mg

Tablo 3. f / 2Vitamin çözümü ^11. dH ₂ O, filtre sterilize, tablet ve dondurucuda 1 litre toplam Makyaj. Nihai konsantrasyonlar nihai orta değil, vitamin çözeltisi için verilmiştir.

Şekil 1.. Dönüşüm işlemi grafiksel bakış. Genetik elektroporasyonla Ostreococcus tauri dönüştürme işlemi şematik gösterimi.

Şekil 2. Kültür büyüme. Hücreler taze ASW 1/100 dilüsyon her 7 günde aseptik alt-kültür ve Ayışığı Mavi filtre takılmış bir bitki büyüme inkübatörde sabit ışık altında yetiştirilen. Işık yoğunluğu yaklaşık 20 mmol m ^-2 s ^-1 ° C Hücreler sürekli ajitasyon gerekmez 20 tutulur, ama s, gerekenagregasyonunu önlemek için her 2 ila 3 günde bir Haken.

Şekil 3. % 0.2 LMP agaroz koloni oluşumu. Büyük bir kare Petri Transfer 4 plaka ve parafilm (sol üst) ile mühür. Koloniler oluşturdular zaman, sadece ücretsiz (ideal konik biçimli) koloniler (sağ üstte) seçin ve bir P200 pipetle plaka onları emmek. Negatif kontrol (sağ alt) üzerinde koloniler olmamalıdır.

Tartışmalar

Hücresel devlet ve kültür axeny dönüşüm prosedürü için büyük önem taşır. Hücreleri, genellikle ışık 12 saat çevrimi içinde muhafaza edilmesine rağmen, 12 saat karanlık, bu şartlar altında yetiştirilen hücrelerinde dönüşümünün verim yetersiz olduğu bulunmuştur. Tekrarlanan peletleme / tabanda adımları sırasında hücreler her zaman kolaylıkla tekrar süspansiyon gerekir. Hücreleri agrega veya mukus benzeri bir madde varsa, tekrar baştan prosedürü başlatmak için daha iyidir. Tipik olarak, ~ 50 koloniler negatif kontrol plaka üzerinde hiç karşı, her dönüşüm plaka beklenebilir. Düşük dönüşümü verim durumda, kültürleme koşulları hücreleri optimum halindedir sağlamak üzere değiştirilebilir olmalıdır. Dönüşüm verimliliği etkileyen değişkenler ortam laboratuarında sıcaklıkta (yaklaşık 20 ° C olmalı) ve işleme hızı (hücre [2,3] kurtarma [2,7] peletleme gelen Prosedürü ~ 1 saat sürer) içerir. Aynı zamanda önemli olduğu bütün solüsyonlar,yeniden her dönüşüm öncesi taze yaptı. Plakalar dahil olmak için LMP agaroz konsantrasyonu Ostreococcus hücreleri yüksek agaroz konsantrasyonlarda büyümek olmaz. Çok önemlidir ve düşük konsantrasyonlarda karışacaktır.

Ostreococcus için üç dönüşüm vektörleri daha önce ⁶ yayınlanmış olan ve daha vektörler oluşturulan ve kısa zamanda yayınlanacaktır bekleniyor. Potox vektör ⁶ Ostreococcus alınan güçlü uyarılabilir ¹³ promotor taşıyan ise mevcut vektör Pot-Luc ^6, hızlı transgenik hat seçimini artı uysal ekspresyonu sağlayan bir C-terminal ateşböceği lusiferaz etiketi ile birlikte bir seçim promotor kullanılmasına izin verir ilgi genin ekspresyonu için yüksek afinite Fosfat Taşıyıcı (HAPT) geni. Potox-Luc vektör aşırı hatları dolaylı seçimi için kullanılabilecek ek bir lusiferaz işareti taşıyan, Potox türemiştir kadar. Bu vektörler başarılı seçim işaretleyicilerini Nourseothricin ve G148 vardır. Bununla birlikte, birçok Ostreococcus hücreleri antibiyotikler dayanımı ve transjenik Ostreococcus hücrelerin seçilmesi için gerekli olan bileşiklerin konsantrasyonları konvansiyonel sistemlerin modeli (2 mg / ml) daha yüksektir.

Süreci verimsiz görünür rağmen, hücreler ve bu işlem için gerekli plazmid DNA sayıda anlamlı bir engel teşkil etmektedir. Daha geniş bir sınırlama seçilebilir işaretleyici dayanıklı üretilen her satırı tüm yapı DNA entegre olduğunu kontrol etmek için ayrı ayrı analiz edilmesi gerekiyor. Biz seçilebilir marker başarılı ifadesi ilgi gerçek geninin ekleme uymadı hangi örnekler gözlemledim, yani kısmi entegrasyonlar oluşabilir. Açıkça, genom içine rastgele yerleştirilmesi de bu yöntemle ekleme sitenin hiçbir kontrolü olmadığı anlamına gelir, ve yöntemleri bhomolog rekombinasyon üzerine ased halen geliştirilmektedir. Ancak, yöntem, en iyi bilgi için, burada genetiği değiştirilmiş Ostreococcus hücreleri oluşturmak için şu anda sadece karakterize yöntemi açıklanmıştır.

Ostreococcus tauri ancak son zamanlarda bir deneysel model organizma olarak kullanılan olduğu gibi, bu hücrelerin çalışma yöntemleri çoğu gelişmeye ve ilgili artan araştırma topluluğu tarafından rafine edilmesi muhtemeldir. Bu protokol insanların Ostreococcus ile çalışma başlatmak yardımcı olmak için tasarlanmıştır, ama hiçbir şekilde bu mikroalgi genomik dönüşümü hakkında bilmek olduğunu tüm tanımlamak için iddia edilir. Okuyucuları, küçük kuluçka farklılıklar (ışık seviyesi ve kalitesi) ve diğer parametreler var olacaktır olarak kendi ihtiyaçlarına göre bu protokol uyum ve muhtemelen bunun için gerekli sağlıklı kültürleri elde etmek için her bireyin laboratuvarda optimize edilmiş olması mümkün olacak yazarlar güven protokolü. Mastering sonra teknikleri, burada açıklananvektörler promotörleri bir dizi kontrolü altında ışıldayan, floresan veya diğer tagged füzyon hatları oluşturmak için inşa edilebilir. Bu heyecan verici yeni deney platformu karmaşık biyokimyasal sorunlar farmakolojik yaklaşımlar oldukça kolaylaştırdı ³ edildiği azaltılmış karmaşıklığı, bir ökaryot çözülüyor, nasıl çalışmak faydalı olacaktır.

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Orta bileşenleri
Kimyasal	Katalog numarası		Satıcı
Instant Ocean Deniz Tuz	gelen amazon.co.uk veya rocketaquatics.co.uk
NaNO 3	S5506-250G		Sigma
NH4CI	A9434-500G		Sigma
Gliserol 2-fosfat disodyum tuzu hidrat	G9422-100G		Sigma
H 2 SeO 3	84.920-250G		Sigma
Ultra saf tris	15504-020		Invitrogen
Na 2 EDTA • 2H 2 O	BPE120-500G		Fisher Scientific
FeCl 3 • 6H 2 O	157740		Sigma
Na 2 Moo 4 • 2H 2 O	31.439-100G-R		Sigma
ZnSO 4 • 7H 2 O	Z0251		Sigma
CoCl 2 • 6H 2 O	31277		Sigma
MnCl 2 • 4H 2 O	203.734-5G		Sigma
CuSO 4 • 5H 2 O	C8027		Sigma
Vitamin B 12 (Siyanokobalamin)	V2876		Sigma
Biotin	47868		Sigma
Tiamin • HCl	T4625		Sigma
Ampisilin	A9518-25G		Sigma
Neomisin	N6386		Sigma
Kanamisin	K4000		Sigma
Yetiştiricilik için Sarf Malzemeleri
Madde		Katalog numarası	Satıcı
Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T25 Süspansiyon Kültürleri		83.1810.502	Starstedt
Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T75 Süspansiyon Kültürleri		83.1813.502	Starstedt
Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T175 Süspansiyon Kültürleri		83.1812.502	Starstedt
DYP Şişe üst filtreler, 1L, tam		99950T	Bioscience Helena
DYP Şişe üst filtreler, 500ml,		99500T	Bioscience Helena
DYP Şişe üst filtreler, 250ml,		99250T	Bioscience Helena
DYP Şişe üst filtreler, 150ml,		99150T	Bioscience Helena
Marine Aquarium için Tuzluluk Ölçer		DSG-10	Daeyoon

Dönüşümü için kimyasallar
Kimyasal	Katalognumara	Satıcı
D-sorbitol	S6021-1KG	Sigma
Pluronic F-68 çözüm	P5556-100ML	Sigma
ClonNat	51000	Werner
Düşük erime noktası agaroz	16520-050	Invitrogen
Dönüşüm için Sarf
Madde	Katalog numarası	Satıcı
Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T25 Süspansiyon Kültürleri	83.1810.502	Starstedt
Kanal Dökme ile havalandırılmış Doku Kültürü Flask T75 Süspansiyon Kültürleri	83.1813.502	Starstedt
Doku Kültürü Flask T175 Süspansiyon Cultures Kanal Dökme ile havalandırılmış	83.1812.502	Starstedt
Greiner santrifüj tüpü 50ml	227261	GBO
Gen Verici / MicroPulser küvetler, 0.2 cm boşluk, 50	165-2086	Bio-Rad
Petri yuvarlak PS 3 DELIKLERI H14.2 Φ55	391-0895	VWR International
Işınlama net 120mm tarafından steril dört havalandırmaları polistiren ile Petri kare	FB51788	Fisher Scientific
Ayışığı Mavi ışık filtresi	183	Lee Aydınlatma