דוגמנות סרטן קוליטיס-Associated עם Azoxymethane (AOM) ונתרן סולפט dextran (DSS)

Summary

אנחנו מדגימים את פרוטוקול שבו ממשל של azoxymethane הסוכן genotoxic (AOM) ואחרי שלושה מחזורים של נתרן פרו דלקתי סוכן dextran סולפט (DSS) במהירות ובעקביות יוצר גידולים במעי גס בעכברים עם דמיון מורפולוגיים ומולקולרי לאלו שנראו בקוליטיס האנושי -קשור לסרטן.

Abstract

אנשים עם מחלת מעי דלקתית (IBD), כגון מחלת קרוהן (CD) או קוליטיס (UC) נמצאים בסיכון מוגבר להתפתחות סרטן המעי גס (CRC) על אנשים בריאים. סיכון זה הוא פרופורציונלי לזמן וההיקף של מחלה, עם שכיחות מצטברת גבוה כמו 30% אצל אנשים עם UC ארוך שנים עם מעורבות נרחבת של מעי גסה. דיספלזיה חוקן ¹ במחלת מעי דלקתי וקוליטיס המשויך הסרטן (CAC) הם האמינו להתפתח כתוצאה מחזורים חוזרים ונשנים של פגיעה בתאי אפיתל ותיקון בזמן שהתאים האלה שוחים בסביבת ציטוקינים דלקתית כרונית. ² למרות שסרטן המעי גס וספונטני הקשורים לשתף את האיכות להיות אדנוקרצינומה, רצף של אירועים מולקולריים שבבסיס הוא ככל הנראה שונה. ³ זה הבחנה טוענת צורך במודלים של בעלי חיים ספציפיים של CAC.

כמה מודלי עכבר קיימים כיום ללימוד CAC. Dextran סולפט Sodiאממ (DSS), סוכן עם השפעות רעילות ישירות על אפיתל של המעי הגס, יכול להינתן במי שתייה לעכברים במחזורים מרובים כדי ליצור מצב דלקתי כרוני. עם משך מספיק, חלק מעכברים אלו יפתחו גידולים. ⁴ התפתחות גידול היא מהרה במודל זה אם מנוהל באווירה פרו מסרטנת. אלה כוללים עכברים עם מוטציה גנטית במסלולי tumorigenesis (APC, p53, MSH2), כמו גם עכברים שטופלו מראש-עם סוכני genotoxic (azoxymethane [AOM], 1,2-dimethylhydrazine [DMH]). ⁵

שילוב של DSS עם AOM כמודל לסרטן משויך קוליטיס צבר פופולרי לשחזור שלו, העצמה, המחיר נמוך, וקלות השימוש. למרות שיש להם מנגנון משותף, AOM כבר מצא להיות יותר חזק ויציב בתמיסה מDMH. בעוד התפתחות גידול בדגמים אחרים דורשת בדרך כלל מספר חודשים, עכברים שהוזרקו עם AOM, ולאחר מכן טופלו בDSS לפתח גידולים בהולמיםיכולים להינתן כקטן של 7-10 שבועות. ^{6, 7} לבסוף, AOM וDSS לעכברים מכל רקע גנטי (knock out, מהונדס, וכו ') ללא הכלאות למתח סרטני מסוים. הנה, אנחנו מדגימים את הפרוטוקול לtumorigenesis מעי דלקתי מונע בעכברי ניצול זריקה אחת של AOM אחרי שלושה מחזורים של שבעה ימים של DSS לאורך תקופת שבוע 10. מודל זה גורם לגידולים בשינויים ההיסטולוגיים ומולקולריים דומים מאוד לאלה המתרחשים בCAC האנושי ומספק מודל יקר מאוד ללימוד oncogenesis ומניעה כימית במחלה זו. ⁸

Protocol

1. אינדוקצית סרטן המעי גס הקשורים

1. מניחים בצד כלובים של מין וגיל 6-8 עכבריו מותאמים בשבוע ישנים שישמש לקבוצות ניסוי ובקרה. עכברים יכולים להיות מתויג באופן אישי, עם סימון זנב או קליפים אוזן.
2. ביום 0, משקולות בסיסיות תקליטים ולהזריק כל intraperitoneally עכבר (IP) עם 10 מ"ג / ק"ג של פתרון עובד AOM (1 מ"ג / מ"ל ​​בסליין איזוטוני, דילול מפתרון מניית מ"ל 10 מ"ג / בdH2O החזיקו ב -20 מעלות C) . בהתבסס על ניסיון, מינון זה יכול להיות מותאם בין 7-14 מ"ג / ק"ג ו / או חזר בתחילת הניסוי.

זהירות: AOM הוא סוכן genotoxic תנודתי וצריך להיות מטופל בזהירות בהתאם לגיליון הבטיחות הנלווה. דילולים צריכים להיות מוכנים בברדס כימי, שמרו על קרח, והושלכו בעקבות פרוטוקולי מוסד ספציפיים.

3. הפוך 2.5% (2.5 g/100 מ"ל) פתרון DSS במים מזוקקים ועוברים דרך F יצטט תאית מיקרומטר 0.22ilter ידי ואקום. מינון זה יכול להיות מותאם בין 1-3.5% בהתאם לעכבר זן והסביבה. פתרון הכין פעם, DSS ניתן לשמור בקירור עד שבוע 1.
4. ביום 7, פתרון DSS אספקה ​​לעכברים כמו מי השתייה שלהם. כ 250 מ"ל / כלוב יהיה צורך בכל פעם DSS החדש מסופק למקסימום של 5 עכברים / כלוב, אך אלה רק הערכות וישתנו בהתאם לסוג בקבוקי מים בבית הגידול שלך.
5. כדי לספק אספקה ​​רציפה של DSS לשבעה ימים, פתרון DSS צריך להיות מוחלף בבקבוקים שלוש פעמים (כל 2-3 ימים) נקיים בתקופה זו. חוקרים אחדים למדוד את כמות DSS צרך לפני ההחלפה עם פתרון חדש כמדד לחשיפה.
6. ביום 14 בכלובים לעבור בחזרה למי שתייה הרגילה לשבועות.
7. חזור על שלבים (1.4) - (1.6) בימים 28 ו 49 לספק מחזור שני ושלישי של DSS. "מחזור" DSS מורכב משבוע אחד של DSS במי השתייהאחרי 2 שבועות של מים רגילים (autoclaved).

2. קוליטיס הערכה קליני והתקדמות גידול

1. עכברים צריכים להישקל / נצפו 2-3 פעמים בשבוע. ירידה במשקל אחוזים יחסית לקו הבסיס משמשת כמדד חלופי של חומרת קוליטיס. הערכות סדירות של דימום רקטלי, שלשולים או צניחה יכולות להתבצע בהתאם למטרות ניסוי ודיווחו על פי מערכות ניקוד שונות. ^{9, 10}
2. ירידה במשקל של עד 10%, יחד עם 2-3 ימים של שלשולים ודימום רקטלי ניתן לצפות בשבוע שלאחר מחזור שלם של DSS (תצפית יומית עשויה להיות שימושית בתקופה המיידית שלאחר זו DSS).

יתכן שהחלק מהעכברים לא יכולים להתאושש; עכברים לאבד יותר מ -20% מהמשקל שלהם הם פחות לשרוד ועשויים לדרוש המתת חסד מוקדמת. זריקה אחת IP של 0.5-1.0 מלוחת מ"ל בעכברים כאלה יכול להיות אמצעי יעיל לתיקון תומך flui נפח ד אבד בשל שלשולים.

3. Murine אנדוסקופיה (אופציונלי)

1. אנדוסקופיה לאחר המחזור השני או שלישי של DSS ניתן לבצע כדי לאשר את צמיחת גידול in vivo לפני להקריב. כAOM / מודל DSS הוא די אמין בייצור גידולים, צעד זה הוא בדרך כלל לא הכרחי. רק כמה עכברים צריכים הוערך באמצעות שיטה זו, שכן יש בו הפוטנציאל לשבש גידולי עכבר ^11.
2. הרדם עכבר עם סדציה נשאפת או בזריקות.
3. אחרי העכבר הוא מורדם, לאבטח את העכבר ללוח שטוח עם קלטת בזנב ובחזה.
4. קידום אנדוסקופ העכברי לתוך פי הטבעת באמצעות העכבר המלוחה בעדינות כדי לנפח ולהשקות כדי לשפר נוף intraluminal ולהסיר תוכן צואה. (שים לב שאנדוסקופיה יכולה גם להתבצע באמצעות הפחת אוויר כתחליף למלח וטכניקה זו עשויה להציע להדמיה משופרת של הגידול. ¹²⁾

דואר "עקידה> 4. מאוסה וקצירת קולון

1. ביום 70, כל עכבר AOM / DSS טופל צריך לטפח גידולי מעי גס מרובים ולהיות מוכן להערכה. תאריך זה יכול להתעכב שבועות עד חודשים, אם גידולים גדולים יותר הם רצויים. (מן ראוי לציין כי עכברים עם רקטלית חמור צניחה ייתכן שיהיה צורך מורדמים מוקדם כדי למנוע אי נוחות מוגזמת לבעלי חיים כמו לכל ועדות טיפול בבעלי חיים מוסדיות.)
2. לפני נתיחה לאחר המוות, באופן אישי להרדים עכברים עם נקע בצוואר הרחם וisoflurane (או שיטה אחרת שאושרה-מוסדי). משקל סופי ומדידות אחרות יכולים להתבצע בשלב זה.
3. הנח את העכבר בצד גחונה נחשף על קרש חיתוך. כסה את הבטן עם אתנול 70% כדי למנוע את זיהום שערות את תוכן הבטן במהלך החילוץ של המעי הגס.
4. השתמש במלקחיים כדי לתפוס את קו האמצע של הבטן ולעשות חתך קטן לחשוף הצפק.
5. הרחב את החתך הזה בכל צד של הבטן לאורך costal מרגיn.
6. השתמש במספריים כדי לחתוך את האגן כך שניתן לקצור את המעי הגס לצומת anorectal. זה חשוב כי פציעת קוליטיס DSS היא גדולה ביותר ברקטום דיסטלי ובמקביל, זה האזור של התפתחות גידול הגדולה ביותר.
7. רקמות נוספות כגון בלוטות הלימפה mesenteric גם יכולות להיות שנקטפו בשלב זה.

5. הכנה לניתוח קולון מאקרוסקופיים

1. באמצעות מחט gavage 18G מחוברת למזרק 5 מ"ל, שטוף את המעי הגס עם נאגר פוספט קר כקרח כגון סליין (PBS) שיוצא נוזל בכיוון הפיזיולוגי. אם תשמש רקמת מעי גס לרנ"א או חלבון מבוסס ניתוח, זה יכול להישמר בקירור על ידי העסקת מגשי עבודה מראש מצוננים.
2. פתח את המעי הגס הסמוק longitudinally יחד לפדר והצבע שלה על המגש הקר. גידולים הם בקלות רבה יותר כשדמיינו המעי הגס מונח על משטח כהה. לחלופין, 1% Alcian כחול צבע ניתן ליישם כדי להדגיש tumors. הערך את המספר וגודל גידול בסרגל או הדיגיטלי קליפר.
3. חלקים קטנים של רקמה נורמלית וגידול הסמוך יהיו אפשר להוציא בשלב זה לניתוח בעתיד על ידי רנ"א, חלבונים, או שיטות immunohistochemical (IHC), ומשאירים איזה חלק של המעי הגס שנותר להערכה היסטולוגית.

צילום דיגיטלי של דגימות המעי הגסות מייד לאחר צעד 5.2 יכול להיות מועיל עבור ניתוח מדויק של ניטל גידול, במיוחד אם חלקים משמעותיים של המתיישבים שנכרתו לצורות אחרות של ניתוח כפי שתואר לעיל. ניטל גידול (%) ניתן לחשב כאזור מעי גס הכולל אזור גידול / שימוש בתוכנה חופשיה כדוגמת ImageJ.

6. הכנת המעי גס להערכה היסטולוגית

1. החל 10% פורמלין למעי הגס שנותר על המגש הקר באמצעות מזרק או אצבע. המאפשר את הרקמה כדי לתקן לפחות 30 שניות בצורה זו מאפשרת העברה לאגן הקיבעון. ודא שיורית פורמלין הוא WIPאד מעל לפני צביעת מעי גס נפתח חדש באותו המגש.
2. העברת נקודותיים לאגן מלא 10% פורמלין ולהצמיד בקצוות.
3. לאחר 3 שעות של קיבעון, להעביר לנקודותיים אתנול 70%. נקודותיים ניתן לשמר באתנול 70% ללא הגבלה זמן.
4. שלושה סעיפים אורכים של מעי גס (פרוקסימלי, האמצע, דיסטלי / רקטום) ניתן התייצב באגר 2% והוגשו להטבעת פרפין. הבטח שהמעי הגס הפרוקסימלי ומעי גס דיסטלי / הרקטום הוא בכיוון באופן אחיד לכל עכבר.
5. דיספלזיה, ניזק קריפטה, ודלקת יכולות להיות מתוארת ומוערך על ידי אדם מנוסה על פי פרוטוקולים שפורסמו בעבר. ^{10, 13-15} עכברים ניתן הקריב לפני 70 יום אם הנסיין מעוניין באיתור אירועי dysplastic מוקדמים.

7. נציג תוצאות

מודל AOM / DSS המתואר כאן מאפשר לחוקר מהימן ליצור גידולים במעי גס בעכברים.גדילת גידול במודל זה מושפע ישירות על ידי התהליך הדלקתי המשויך. חומרת קוליטיס צריכה להיות במעקב קליני על ידי ביצוע ירידה במשקל ונוכחות של שלשול / hematochezia (איור 2). אלה סימנים של פעילות מחלה נוטים להתחיל ביום 5 למחזור DSS ובמשך ארבעה ימים או יותר לאחר DSS הוסר. לעיתים נדיר, עכברים עם ניטל גידול משמעותי רקטלית יכולים לפתח צניחה רקטלית. אחרי שלשול מחזור DSS השני או שלישי עלול להיות עקשן. בדרך כלל גידולים קיימים וזיהוי על ידי קולונוסקופיה העכברית לפני המחזור השלישי של DSS (איור 3). זמן נוסף וכמובן שלישי של תוצאות DSS בגידולים גדולים יותר בזמן הקציר (איור 4). שימוש במריחה על עור Alcian הכחול כתם ניתן להשתמש כדי להדגיש גידולים (איור 5). תצלומים של גידולים במעי גסים יסייעו ביצירת מדידות סרטניות אשר ניתן להשתמש בי כמותית להשוות ייצור וגודל גידולבין קבוצות ניסוי (איור 6). דגימות מעי גס משובצות קבועות ופרפין ואז ניתן להעריך ליסטולוגיה או עם השימוש בimmunohistochemical מכתים (איור 7, 8).

איור 1. סכמטי של AOM וממשל DSS. AOM (10 מ"ג / ק"ג) מוזרק ביום 0. בתחילת השבוע השני (יום 7), 2.5% פתרון DSS ניתן לעכברים במי השתייה שלהם. שבעה ימים של DSS אחריו שבועות של מי autoclaved. עוד שני מחזורים נוספים של DSS מנוהלים לפני להקריב.

איור 2. משקל יחסית לתחילת מחקר ובממשל AOM DSS מאוס. יצוין, כי בשבוע שלאחר כל מחזור DSS, העכברים לוס דואר 5-10% ממשקל גופם. ירידה במשקל בניסוי זה היא סמן פונדקאי לחומרת קוליטיס.

איור 3. צפה של גידולים במעי גס דיסטלי באמצעות אנדוסקופיה עכברית ביום 50 לטיפול AOM / DSS. שים לב ההמונים המרובים פוליפואידית שיבוש לומן של המעי גס דיסטלי (ב, ג) בהשוואה למעי הגס (הנורמלי).

איור 4. Longitudinally נפתח מעי גס עכבר ממחיש מראה גולמי של גידולים. שים לב לניטל הגבוה יותר גידול במעי גס דיסטלי / פי טבעת (תמונה עליונה משמאל), ואת מרקם rugated האופייני למעי הגס הפרוקסימלי (תמונה עליונה מימין) עם צמיחת גידול קטנה. תצוגה מעלה קרוב של המעי גס דיסטלי מראה גידולים רבים בגדלים שונים (להלן).

ove_content "fo: לשמור-together.within עמודים =" תמיד ">
איור 5. גידולים מודגשים על ידי יישום של Alcian כתם כחול. שים לב איך הצבע מדגיש את המרקם הנורמלי של המעי הגס, כמו גם את גבולותיו של כל גידול פרט. הכתמה כזו יכולה להיות מועילה במדידה המדויקת של אזורי גידול על ידי שליט או מדידה דיגיטלית.

איור 6. הפצת נציג את המספר הממוצע של גידולים לכל עכבר שטופלו בAOM / DSS. שים לב שרוב הגידולים נמצאים במעי גס דיסטלי והם <2 מ"מ בגודל.

איור 7. פרפין מוטבע סעיפים אורכים של מעי גס בקלטת (לעיל)ד בשקופית בעקבות H & E כתם (להלן). שימו לב שAlcian שיורים כחול כתם אינו מתערב עם H & E מכתימה. גידול גדול חג בשקופית התמונה (מוקף בעיגול). הכינויים "דיסטלי", "הבינוניים", ו" התוצאה הפרוקסימלי "מחתך כל המעי גס בשלישים בין cecum ופי הטבעת.

איור 8. היסטולוגיה נציג של גידול וכתוצאה מממשל AOM / DSS במעי גס דיסטלי. H & E, BrdU, ושקופיות מוכתמות β-catenin ב50x (למעלה פנל) ו400x (פנל תחתון) בהתאמה להפגין שינויים דומים לאדם אדנוקרצינומה של המעי גס dysplastic.

Discussion

טיפול בעכברים עם AOM וDSS מהירות וביעילות מודלי סרטן בבני אדם הקשורים לדלקת מעי גס. השערות לגבי גורמים תורשתיים לסרטן המעי גס הקשורים ניתן ללמוד בקלות בעכברים מהונדסים גנטי. ^{13, 16} לחלופין, ההשפעה של מטרות תרופתיות בסרטן המעי גס הקשורים ניתן ללמוד על ידי העסקת עכברי ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
שם המגיב	חברה	מספר קטלוגים	תגובות
עכברי C57BL/6J	ג'קסון מעבדה	000664
Azoxymethane (AOM)	סיגמה אולדריץ	A5486-100 מ"ג	פתרון המלאי: לדלל עד 10 מ"ג / מ"ל במים מזוקקים כדי להיות כל זמן ב -20 ° C כמו 0.5-1 aliquots מ"ל. פתרון עובד: לדלל מניות ל1 מ"ג / מ"ל באיזוטוני (0.9%) המלוח
נתרן סולפט dextran (DSS)	ייעוץ TdB	DB001	MW 40 kDa (36-50 הכנות KDA ממקורות אחרים הם מקובלים; אותו המגרש שישמש לניסוי בודד) 6
Coloviewמערכת miniendoscopic	קרל Storz	מרובה	ראה בקר et al. להסבר מפורט של ציוד והתקנה. 11
TPP ראפיד FILTERMAX 500 בקבוק-מסנן מ"ל, 0.22 מיקרומטר PES	מערב תיכון מדעי	TP99500	כל מסנן תרבית רקמה הסטנדרטית מקובל
אתיל אלכוהול 200 ההוכחה ASC / USP	Pharmaco-AAPER (או אחר)	11ACS200	לדלל עד 70% במים מזוקקים
, USP isoflurane	אספקת לבריאות בעלי החיים באטלר	4029405	עכבר מקום בצנצנת זכוכית עם גזה או מטלית קטנה טבולה בחומר ההרדמה
18G מחט Gavage סטרייט	בריינטרי מדעי	N-008
נאגר מלוח פוספט (PBS)	סיגמאאולדריץ	P5493	מדולל ל1X (0.01 M) במים מזוקקים
מגש קר (פלייט הרקמות Tek השני הקר)	הפישר סיינטיפיק	NC9491941	חנות ב -20 ° C
ImageJ תוכנה	NIH (להורדה בחינם)		http://rsbweb.nih.gov/ij/
פורמלדהיד (37%)	הפישר סיינטיפיק	F79-500	לדלל עד 10% בPBS
אגר BD Bacto	הפישר סיינטיפיק	DF0140-01-0	השתמש בפלטה חשמלית כדי ליצור פתרון 2% במים מזוקקים
מלקחי הלבשת Eye Miltex	MedPlus בע"מ	18-780
מספרי Eye Miltex	MedPlus בע"מ	18-1430	נקודות מעוגלות למנוע ניזק למעי גס במהלך פתיחה.
Alcian הכחול 8GX (אבקה)	סיגמה אולדריץ	A5268	הוסף אבקת 1 גרם לחומצת 100 מ"ל 3% אצטית (חומצה אצטית קרחונית 3 מ"ל + 97 מיליליטר מים מזוקקים)
מזרק 1 מ"ל טוברקולין עם 26 המצורפים G x 3/8 במחט פוע intradermal	BD	305946	להזרקה של AOM