מחיקות Gene הגנום ב<em&gt; סטרפטוקוקוס sanguinis</em&gt; על ידי תפוקה הגבוהה PCR

Summary

שיטה יעילה הגנום בודדה גן מוטציה כבר נקבעה באמצעות סטרפטוקוקוס sanguinis כאורגניזם מודל. שיטה זו השיגה דרך PCRs גבוה התפוקה רקומביננטי ותמורות.

Abstract

Transposon mutagenesis ומחיקה של גן היחיד הם שתי שיטות שיושמו בנוקאאוט גן גנום רחב ^ב1,2 חיידקים. למרות mutagenesis transposon הוא פחות זמן רב, יקר פחות, ואינו דורש מידע הגנום הושלם, יש שתי חולשות בשיטה זו: (1) האפשרות של מוטציות שונות בספריית המוטציה המעורבת שנגד בוחרת מוטנטים עם תחרות ירד; ו (2) האפשרות של איון גן החלקי לפיו גנים לא לגמרי מאבדת את תפקודם לאחר החדרת transposon. ניתוח מחיקה של הגן יחיד עשוי לפצות על חסרונות הקשורים mutagenesis transposon. כדי לשפר את היעילות של מחיקה הגנום בודדה גן, אנו מנסים להקים טכניקת תפוקה גבוהה למחיקת גן יחידה הגנום באמצעות sanguinis Streptococcus כאורגניזם מודל. כל מחיקת גן לבנות בס sanguinis הגנום נועד מהווה 1-KB זרם של הגן הממוקד, גן APHA-3, חלבון התנגדות kanamycin קידוד, או במורד 1-KB של הגן הממוקד. שלושה זוגות של פריימרים F1/R1, F2/R2, וF3/R3, בהתאמה, מתוכננים ומסונתזים בפורמט צלחת 96-גם ל- amplifications PCR של שלושה המרכיבים האלה של כל מחיקה להקים. Primers R1 ו F3 מכילים רצפי 25-BP שמשלימים לאזורים של-3 APHA הגן בקצה 5 'שלהם. הגברת PCR קנה מידה גדולה של-3 APHA הגן מתבצעת פעם אחת ליצירה כל מבני המחיקה בגן בודד. האמרגן של גן APHA-3 בתחילה הוצא כדי למזער את ההשפעה הפוטנציאלית של קוטב קלטת kanamycin. כדי ליצור מבני מחיקת הגן, הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור מבוצעות בפורמט צלחת 96-כן. Amplicon PCR רקומביננטי יניארית לכל מחיקת גן יהיה מורכב באמצעות ארבע תגובות PCR באמצעות DNA פולימראז באיכות גבוהה. Expon הראשונישלב הצמיחה ential של ס ' sanguinis תרבית בטוד יואיט מרק בתוספת 2.5% סרום סוס מומת משמש כדי להגדיל את היכולת של שינוי מבני PCR-רקומביננטי. תחת תנאי זה, עד 20% של ס ' תאי sanguinis ניתן להפוך באמצעות ~ 50 ng של DNA. בהתבסס על גישה זו, 2048 מוטנטים עם מחיקת גן יחיד סופו של דבר התקבלו מ2270 הגנים בס sanguinis למעט 4 ORFs גנים כלולים כולו בתוך ORFs האחר בס sanguinis SK36 ו218 גנים חיוניים פוטנציאליים. הטכניקה ביצירת מבני מחיקת גן היא תפוקה גבוהה ויכולה להיות קל לשימוש במחיקות גן יחידות הגנום לכל חיידקי transformable.

Protocol

1. עיצוב פריימר

1. Primers תוכנן באמצעות תסריטים בבית המבוסס על ס רצף הגנום sanguinis SK36. שלושה זוגות של פריימרים, F1/R1, F2/R2, וF3/R3 מיועדים להגברה של רצף 1-kb במעלה הזרם של גן המטרה, התנגדות APHA-3 גן קידוד kanamycin (הק"מ ^R) החלבון ³ ו 1 -KB רצף במורד זרם של גן המטרה, בהתאמה (איור 1). בין פריימרים אלה, F1 ו R3 תוכננו באמצעות ePrimer3 בסוויטת הבלטה של תוכניות (http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html) כדי להגביר אזורי איגוף מעלה זרם או במורד זרם של היעד גן. פריימרים הגן ספציפיים, R1 וF3, נועדו מבוססים על רצפים של גן היעד 5 '3 ו'. פריימרים R1 וF3 מכילים רצפי מתאם 25-BP בסוף 5 'שלהם שמשלימים לAPHA-3גן. את טמפרטורת ההיתוך של כל צבע יסוד נועדה להיות קרוב ככל האפשר עד 60 ° C כדי לאפשר שימוש במדי חישול טמפרטורה לכל תגובות PCR בפורמט 96-כן.
2. F1, R1, F3 ופריימרים R3 מסונתזים בצלחות 96-כן בהתבסס על מנת גנים. כל צלחת מכילה סוג אחד של פריימרים באותו סדר הגן. לדלל את האלפונים ב96-גם צלחת פריימר פועל לריכוז סופי של 10 מיקרומטר להגברת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים.

2. הגברת תפוקה גבוהה PCR וטיהור

1. כדי להגביר את התפוקה גבוהה 1-kb מעלה זרם או במורד זרם של היעד ס גני sanguinis, להרכיב תערובת קוקטייל PCR על קרח בצינור חרוטים 15-מ"ל מכיל 1640 DDH ₂ O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 250, 200 μl של תערובת 10 mM dNTP, 100 μl של 50 מ"מ MgSO _4, 100 μl של 10 ng / μl ס הדנ"א הגנומי sanguinis SK36 וμl פלטינום תקי DNA polyme 10rase איכות גבוהה והעברה 23 μl של התערובת לתוך כל באר על 96-גם צלחת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים. העברת μl 1 מתוך כל F1 וR1 (או F3 ו R3) מתוך 10 מיקרומטר עבודת צלחות פריימר לצלחת PCR באמצעות פיפטה רבה ערוצים. לאטום את צלחת PCR ולבצע הגברה ב 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 54 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 1.5 דקות.
2. הכן 1% agarose ג'ל המכיל רומיד ethidium עם טעינת 48 בארות הולמת רב ​​פיפטה. מערבבי 4 מוצר PCR μl μl עם 1 של חיץ טעינת 5xDNA בצלחת 96-היטב ולטעון את הדגימות על agarose ג'ל באמצעות פיפטה רב 10-μl. הפעל אלקטרופורזה ב135 V למשך 30 דקות. בדוק את הלהקה בג'ל תחת מערכת ניתוח ותיעוד UVP.
3. לטהר את מוצרי ה-PCR על ידי ערכת PureLink 96 PCR טיהור באמצעות צנטריפוגה פי ההוראות של היצרן. למשחררי DNA, להוסיף 40 μl סטרילי DDH ₂ O אל באר בinding צלחת.
4. באופן אקראי לקחת כמה amplicons מטוהר על הצלחת לבחון את ריכוזי DNA באמצעות ספקטרופוטומטר NanoDrop. התאם את הריכוז של amplicons על צלחת ל~ 10 ng / μl.
5. קלטת ^r פלסמיד המכיל ק"מ מתעכלת באמצעות EcoR כתבנית PCR. הפלסמיד מעוכל מטוהר על ידי ערכת טיהור PCR QIAquick וDNA פלסמיד לינארי מותאם לריכוז ה-DNA סופי 10 ng / μl. להרכיב תערובת μl 25 לamplicon קלטת ^r הק"מ כולל 16.4 DDH ₂ O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 2.5, 2 μl של תערובת 10 mM dNTP, μl 1 מתוך Mg 50 מ"מימ SO _4, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר F2, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר R2, ה-DNA 1 μl יניארי פלסמיד ונאמנות 0.1 μl פלטינום תקי פולימראז ה-DNA גבוהה. בצע הגברת PCR ב 94 מעלות צלזיוס במשך 1 דקות, ו 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך דקות 1. בדוק את מוצר PCR ידי אלקטרופורזה ג'ל על 1% agarose. פותפזורת של la amplicon הק"מ ^r הקלטת מ 10 פרט PCR מטוהר על ידי ערכת טיהור PCR QIAquick. התאם את ריכוז amplicon עד 10 ng / μl.
6. כדי להשיג את amplicon PCR רקומביננטי הסופי ליניארי, שלוש amplicons PCR בשילוב עם כל μl 1 (בכמויות כמעט שווה-טוחן) בצלחת אחת PCR גם תבנית ה-PCR. רכיבי PCR אחרים מתווספים כולל 14.4 DDH ₂ O μl, פידליטי 10xHigh μl PCR מאגר 2.5, 2 μl של תערובת 10 mM dNTP, μl 1 מתוך Mg 50 מ"מימ SO _4, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר F1, μl 1 מתוך 10 מיקרומטר R3, האיכות גבוהה 0.1 μl פלטינום תקי DNA פולימרז. הגברת PCR מתבצעת ב 94 מעלות צלזיוס למשך 2 דקות, 30 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות, ובסופו 68 המעלות צלזיוס במשך 4 דקות.
7. בחן PCR amplicons על agarose ג'ל. לטהר ולכמת את amplicons PCR כפי שתואר לעיל. הקפא את amplicons PCR מורכב ב -20 ° C.

3. Comהכנת תאים petent

1. טוד יואיט המרק מוכן, חומציות מותאמת לשימוש 10 7.6 N NaOH, מחומם לרתיחה ולאחר מכן מקוררת לטמפרטורת חדר ועיקור באמצעות קלקר 0.22 מיקרומטר סינון ^4. הוסף 300 סוס סרום μl חום מומת (ריכוז סופי של 2.5%) עד 11.7 מ"ל טוד יואיט מרק בצינור חרוטים 15-מ"ל כדי לפצות TH + בינוני HS. TH aliquot + HS הבינונית ל2 מ"ל ו 10 מ"ל בצינורות.
2. לחסן 5 μl של המנייה ס sanguinis SK36 קפוא ב -80 ° C לTH + בינוני 2 מ"ל HS ודגירת תרבות הלילה עם המכסה בחוזקה על 37 מעלות צלזיוס, בליווי דוגר מראש 10 מ"ל-TH + צינור HS.
3. אחרי הלילה, להעביר תרבות μl 50 לתוך 10 המ"ל TH + HS ודגירת הצינור ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות (מקביל לOD ₆₆₀ של 0.07-0.08), תוך שימוש באופן מיידי לשינוי.

4. שינוי תא ובחירת אנטיביוטיקה

1. הוסף 2 μl של 70 ng ס sanguinis SK36 compeפפטיד tence מגרה (CSP) וμl יניארי רקומביננטי PCR amplicon 2 (~ 50 ng) לאפנדורף צינורות על 96-גם בלוק ומראש החם ב 37 ° C. העברת 330 μl של 3 SK36 תרבות HR-מודגרות לכל צינור. לדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. החלף DNA עם DDH ₂ O סטרילית כשליטה.
2. הנח את הבלוק על קרח והתפשט 100 μl של כל שינוי על צלחת אגרה עירוי לב מוח (BHI) עם 500 מיקרוגרם / המ"ל kanamycin. דגירת הצלחות על 37 מעלות צלזיוס למשך 2 ד בתנאי microaerobic.

5. אישור ואחסון מוטציה

1. עבור כל מוטצית החלפה, באופן אקראי להרים 2 מושבות בודדות, לחסן את המושבה ל5 המ"ל מכיל 500 מיקרוגרם BHI / kanamycin מ"ל ודגירת בידוד microaerobically לילה בשעת 37 ° C. Cryopreserve כל תרבות בגליצרול 30% ב-80 ° C
2. כדי לבחון האם מכיל את החלפת גן המוטנטי הצפוי, לבצע מושבה PCR לכל F1 באמצעות מוטציה וR3אלפונים ב96-PCR גם צלחת. על תרבות הלילה 1-μl ממושבה בודדה משמשת כתבנית ה-DNA בתגובת 25-μl PCR הגברה. PCR מתבצע ב 94 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות, 35 מחזורים של 94 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות, 55 מעלות צלזיוס למשך 30 שניות ו 68 מעלות צלזיוס במשך 3.5 דקות, ובסופו 68 המעלות צלזיוס במשך 4 דקות.
3. לזהות במדויק מוטנטים-band הכפול או amplicon PCR המזהם, לבחון amplicon PCR ידי אלקטרופורזה במשך 4 שעות ב> 12 סנטימטר ארוך 2% agarose ג'ל עם כתמי רומיד ethidium. תחת תנאי אלקטרופורזה ג'ל agarose זה, כל amplicons עם ≥ הבדל 100 נ"ב באופן מובהק. כאשר להקות תוצאה מההגברה של קלטת ^r הק"מ והגן פראי מהסוג צפויות לשינוי על פי <100 נ"ב, פריימר T1 הפנימי משמש כדי לקבוע האם גן פראי מסוג יכול להיות מזוהה על ידי PCR.
4. על מנת להמשיך ולאשר את המחיקה, את amplicons מטוהר על ידי ערכת טיהור PureLink 96 PCR ורצף באמצעות פריימר P1 בינקשר לקלטת ^r הק"מ. שמור רק מוטנטים נכונים אושרו על ידי רצף.

תוצאות

After PCR amplification using primers F1 and R1, and F3 and R3, approximately 1-kb upstream and downstream of each S. sanguinis gene were obtained in 96-well format, respectively (Figure 2A). Under our PCR conditions and using designed primers, a specific product was amplified from S. sanguinis genomic DNA in each PCR reaction. This result indicated the primers were highly specific to the targets of S. sanguinis. Through PCR re-amplification using primers F1 and R3 and t...

Discussion

כדי למזער את ההשפעות האפשריות של קוטב החלפת הגן ממוקד אחד עם אנטיביוטיקת גן אקסוגני בגנים סמוכים, שני צעדים נלקחים תוך פריימר הראשוני בעיצוב. עבור רוב הגנים שנמחקו, פריימרים R1 ו F3 נועדו למחוק את אזור קידוד מ6 נ"ב לאחר קודון התחילה ועד 30 נ"ב לפני קודון העצירה. את 30 ז...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
פריימר F2	משולבות טכנולוגיות ה-DNA	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
R2 פריימר	שם	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
פריימר F2P	שם	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
P1 פריימר	שם	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
P2 פריימר	שם	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
פריימר 5 'end_R1_seq	שם	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
פריימר 5 'end_F3_seq	שם	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
פריימר 5 'end_R1p_seq	שם	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	רצף: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
פולימראז ה-DNA	Invitrogen	11304-102	פלטינום תקי פולימראז ה-DNA נאמנות גבוהה
EcoRI	ניו אינגלנד Biolabs Inc	R0101S	אנזים הגבלה
אגר	אמריקאי Bioanalytical	AB01185
Agarose	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	עירוי לב המוח
סוס סרום	הפישר סיינטיפיק	SH3007403	סוס סרום
ק"מ	הפישר סיינטיפיק	BP906-5	Kanamycin
TH מרק	BD Biosciences	249240	טוד יואיט מרק
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 ערכת טיהור PCR
QIAquick	Qiagen	28106	ערכת טיהור PCR QIAquick
סינון	קורנינג	431117	מסנן קלקר מיקרומטר 0.22
Anoxomat מערכת	מארט מיקרוביולוגיה bv	Anoxomat Mark II
צנטריפוגה Benchtop	Thermo Scientific	75004377	Sorvall מקרא RT פלוס microplate הרוטור
תיעוד ג'ל	UVP LLC	BioDoc-זה 210
חממה	הפישר סיינטיפיק	11-690-625D	Isotemp
של Labnet ג'ל XL	Labnet	E0160	של Labnet ג'ל XL
Microcentrifuge	אפנדורף	22621408	5415 R microcentrifuge
Pipettes רב	Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Cycler תרמית	יישומי BioSystems בע"מ	N805-0200	GeneAmp PCR מערכת 9700