Do genoma deleções de genes em<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; Por PCR de Alto Rendimento

Resumo

Um eficiente do genoma método única mutação genética foi estabelecida utilizando Streptococcus sanguinis Como um organismo modelo. Este método tem alcançado via PCRs recombinantes de alto rendimento e transformações.

Resumo

Transposon mutagênese e único gene exclusão são dois métodos aplicados no genoma nocaute de genes em ^1,2 bactérias. Embora mutagénese transposon é menos demorado, menos dispendiosa, e não requer informação sobre o genoma completo, existem dois pontos fracos neste método: (1) a possibilidade de um mutantes diferentes na biblioteca misto mutante que contra-selecciona mutantes com competição reduzida; e (2) a possibilidade de inactivação parcial do gene por meio de que os genes não perder completamente a sua função após a inserção de um transposão. Single-gene análise de deleção pode compensar os inconvenientes associados com a mutagénese transposon. Para melhorar a eficiência do genoma deleção do gene único, tentamos estabelecer uma técnica de alto rendimento para o genoma de deleção do gene único usando Streptococcus sanguinis como um organismo modelo. Cada deleção do gene construir em S. sanguinis genoma foi concebido para incluir uma-Kb a montante do gene alvo, o gene APHA-3, a proteína que codifica a resistência à canamicina, e 1-kb a jusante do gene alvo. Três conjuntos de primers F1/R1, F2/R2 e F3/R3, respectivamente, foram concebidos e sintetizados de um formato de placa de 96 poços para amplificações por PCR destes três componentes de cada apagamento construir. Primers R1 e F3 conter 25-bp sequências que são complementares a regiões do gene APHA-3 no fim do seu 5 '. Uma larga escala de amplificação por PCR do gene-3 APHA é executada uma vez para criar todas as construções de deleção de um único gene. O promotor do gene APHA-3 é inicialmente excluídos para minimizar o potencial efeito polar da cassete de canamicina. Para criar as construções de deleção de genes, de alto rendimento e de amplificação por PCR de purificação são realizados num formato de placa de 96 poços. Um fragmento amplificado de PCR recombinante linear para cada deleção do gene será composto por quatro reacções de PCR utilizando polimerase de alta fidelidade de ADN. O expon inicialfase de crescimento cial de S. sanguinis cultivados em caldo Todd Hewitt suplementado com soro de cavalo a 2,5% inactivado é utilizada para aumentar a capacidade para a transformação de PCR-recombinantes construtos. Sob esta condição, até 20% de S. As células podem ser transformadas sanguinis usando ~ 50 ng de DNA. Com base nesta abordagem, 2.048 mutantes com um único gene de exclusão foram finalmente obtidos a partir dos genes de S. 2270 sanguinis excluindo quatro ORFs de genes contido inteiramente dentro ORFs outros S. sanguinis SK36 e 218 potenciais genes essenciais. A técnica na criação de construções de deleção do gene é de alto rendimento e poderia ser fácil de usar em eliminações do genoma de um único gene para todas as bactérias transformáveis.

Protocolo

1. Projeto Primer

1. Os iniciadores são concebidos utilizando em scripts casa baseada na S. sanguinis seqüência do genoma SK36. Três conjuntos de primers, F1/R1, F2/R2 e F3/R3 foram concebidos para amplificação da 1-kb de sequência a montante do gene alvo, a APHA-3 gene que codifica a resistência à canamicina (Km ^r) da proteína ³ e do 1 -kb de sequência a jusante do gene alvo, respectivamente (Figura 1). Entre estes iniciadores, F1 e R3 são concebidos utilizando ePrimer3 na suite de programas EMBOSS ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) para amplificar as regiões que flanqueiam a montante ou a jusante do alvo gene. Iniciadores específicos do gene, R1 e F3, foram concebidos com base na extremidade 5 'e 3' as sequências do gene-alvo. Primers R1 e F3 contêm sequências de 25 pb adaptador no seu final 5 'que são complementares a APHA-3gene. As temperaturas de fusão de cada um dos iniciadores foram concebidos para serem tão próximo quanto possível de 60 ° C para permitir a utilização de uma temperatura uniforme do recozimento para todas as reacções de PCR em formato de 96 poços.
2. F1, R1, R3, F3 e iniciadores são sintetizados em placas de 96 poços com base em uma ordem de genes. Cada placa contém um tipo de iniciadores na ordem mesmo gene. Diluir os primers em placa de 96 poços de primer de trabalho para uma concentração final de 10 uM para a amplificação por PCR, utilizando uma pipeta multicanal.

2. High-throughput Amplificação por PCR e Purificação

1. Para alto rendimento amplificar 1-kb a montante ou a jusante do alvo S. genes sanguinis, montar uma mistura cocktail de PCR em gelo, num tubo cónico de 15 ml contendo 1640 uL DDH ₂ O, 250 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 200 ul de 10 mM de mistura dNTP, 100 ul de 50 mM de _MgSO4, 100 ul de 10 ng / ul S. sanguinis DNA genómico SK36 e 10 ul Platinum Taq DNA polimetilmetacrilatorase de alta fidelidade e transferência de 23 uL da mistura para cada poço na placa de 96 poços de PCR, utilizando uma pipeta multicanal. Transferir 1 ul de cada F1 e R1 (ou F3 e R3), a partir das placas de 10 uM de iniciadores úteis para a placa de PCR, utilizando uma pipeta multicanal. Selar a placa de PCR e amplificação de realizar a 94 ° C durante 1 min, e 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 54 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 1,5 min.
2. Prepare 1% de gel de agarose contendo brometo de etídio com 48 poços de carregamento pipeta multicanal encaixe. Mix 4 uL do produto de PCR com 1 ul de tampão de carga 5xDNA em placa de 96 poços e carregar as amostras em gel de agarose utilizando uma pipeta multicanal de 10 jil. Executar a electroforese a 135 V durante 30 min. Examine a banda em gel sob UVP documentação e sistema de análise.
3. Purifica-se o produto de PCR por PureLink kit de purificação de PCR utilizando 96 de centrifugação de acordo com as instruções do fabricante. Para a eluição de DNA, adicionar 40 ul estéril DDH ₂ O para o bem da binding placa.
4. Escolher aleatoriamente vários amplicons na placa para examinar as concentrações de ADN, utilizando espectrofotometria NanoDrop. Ajustar a concentração de amplicons na placa de ~ 10 ng / ul.
5. Um plasmídeo contendo km cassete ^r é digerido com EcoR I como molde de PCR. O plasmídeo digerido é purificado através de kit de purificação PCR QIAquick e o DNA linear do plasmídeo é ajustada para a concentração final de ADN de 10 ng / ul. Montar 25 ul de mistura de amplicon km cassete incluindo ^r 16,4 ul DDH ₂ O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM mistura de dNTP, 1 ul de 50 mM Mg SO _4, 1 ul de 10 mM F2, 1 ul de 10 R2 ^ M, 1 ul de DNA linear do plasmídeo e 0,1 ul de Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade. Realização da amplificação de PCR a 94 ° C durante 1 min, e 30 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 1 min. Examinar o produto de PCR por electroforese em gel de agarose a 1%. Poola maior parte do fragmento amplificado cassete km ^r desde 10 indivíduo PCR purificado por QIAquick kit de purificação de PCR. Ajustar a concentração de amplicon de 10 ng / ul.
6. Para obter a última linear amplicon de PCR recombinante, três amplicons de PCR são combinados uns com os uL 1 (em quantidades aproximadamente iguais-molar) em uma placa de PCR bem como o modelo de PCR. Outros componentes de PCR é adicionado 14,4 ul incluindo DDH ₂ O, 2,5 ul 10xHigh Fidelity PCR Buffer, 2 ul de 10 mM de mistura de dNTP, 1 ul de 50 mM Mg SO _4, 1 ul de 10 mM de F1, 1 ul de 10 R3 ^ M, 0,1 ul de Platinum Taq DNA polimerase de alta fidelidade. A amplificação por PCR é realizada a 94 ° C durante 2 min, 30 ciclos de 94 ° C durante 30 segundos a 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 3,5 min, e finalmente 68 ° C durante 4 min.
7. Examinar o amplicons PCR em gel de agarose. Purificar e quantificar os produtos de amplificação por PCR como descrito acima. Congelar os amplicons de PCR recombinados a -20 ° C.

3. ComPreparação Células competente

1. Caldo Todd Hewitt é preparado, pH ajustado para 7,6 utilizando NaOH 10 N, aquecida à ebulição e depois arrefeceu-se até à temperatura ambiente e esterilizada utilizando poliestireno 0,22 uM de filtro ^4. Adicionar 300 ul de cavalo inactivado pelo calor soro (concentração final de 2,5%) a 11,7 ml de caldo Todd Hewitt a 15 ml tubo cónico para compensar TH + HS médio. TH alíquota + HS médio em 2 ml e de 10 ml em tubos.
2. Inocular 5 ul de estoque S. sanguinis SK36 congelado a -80 ° C em 2 ml de meio HT + HS e incubar a cultura durante a noite com capeamento hermeticamente, a 37 ° C, acompanhado por pré-incubação a 10 ml + TH-tubo HS.
3. Depois de uma noite, transferir 50 ul da cultura em 10 ml de TH + HS e incubar o tubo a 37 ° C durante 3 h (correspondente a OD ₆₆₀ de 0,07-0,08), imediatamente utilizando para a transformação.

4. Transformação de células e selecção de antibióticos

1. Adicionam-se 2 jil de 70 ng S. sanguinis SK36 competênciatência peptídeo estimulante (CSP) e 2 ul de PCR recombinante linear amplicon (~ 50 ng) para tubos Eppendorf com 96 poços de bloco e pré-aquecê-los a 37 ° C. Transferir 330 uL de 3 hr-incubada SK36 cultura em cada tubo. Incubar a 37 ° C durante 1 h. Substitua DNA com estéril DDH ₂ O como controle.
2. Colocar o bloco de gelo e espalhar 100 ul de cada transformação em infusão de cérebro e coração (BHI) em placa de ágar com 500 ug / ml de canamicina. Incubar as placas a 37 ° C durante 2 d em condições de microaerofilia.

5. Confirmação mutante e Armazenamento

1. Para cada mutante de substituição, aleatoriamente pegar 2 colónias individuais, inocular a colónia em 5 ml de BHI contendo 500 ug / ml de canamicina e incubadas durante a noite o inoculo microaerobically a 37 ° C. Criopreservar cada cultura em glicerol a 30% à temperatura de -80 ° C
2. Para examinar se o mutante contendo o gene de substituição previsto, executar colónia PCR para cada mutante utilizando F1 e R3primers em placa de 96 poços PCR. Cerca de cultura 1-ul durante a noite a partir de colónias individuais é utilizado como o molde de ADN de 25-ul de reacção de amplificação por PCR. A PCR é realizada a 94 ° C durante 5 min, 35 ciclos de 94 ° C durante 30 seg, 55 ° C durante 30 seg e 68 ° C durante 3,5 min, e finalmente 68 ° C durante 4 min.
3. Para identificar precisamente banda dupla mutantes ou amplicon PCR contaminante, examine o amplicon de PCR por eletroforese durante 4 h em> 12 cm de comprimento de 2% em gel de agarose com brometo de etídio coloração. Sob esta condição eletroforese em gel de agarose, os fragmentos amplificados com uma diferença de ≥ 100 pb foram claramente identificadas. Quando as bandas resultantes da amplificação da cassete de Km e ^r o gene do tipo selvagem são antecipados para diferir <100 bp, um iniciador interno T1 é usado para determinar se um gene de tipo selvagem pode ser detectada por PCR.
4. Para confirmar ainda mais a eliminação, os amplicons são purificados por PureLink kit de purificação de PCR 96 e sequenciado utilizando o iniciador P1 queliga-se a cassete de ^r Km. Mantenha apenas os mutantes corretas confirmados por seqüenciamento.

Resultados

Após amplificação por PCR, utilizando iniciadores F1 e R1, R3 e F3 e, aproximadamente, 1 kb a montante e a jusante de cada um S. sanguinis gene foram obtidos em formato de 96 poços, respectivamente (Figura 2A). Sob as nossas condições de PCR e utilizando os iniciadores desenhados, um produto específico foi amplificado a partir de S. sanguinis ADN genómico em cada reacção de PCR. Este resultado indicou os primers foram altamente específico para as metas de S. sanguinis.

Discussão

Para minimizar os possíveis efeitos polares da substituição de um gene-alvo com antibióticos gene exógeno em genes vizinhos, duas medidas são tomadas enquanto cartilha inicial de projeto. Para a maioria dos genes deletados, o R1 e F3 primers são concebidos para eliminar a região codificadora de 6 pb a seguir ao codão de iniciação para 30 pb antes do codão de paragem. Os últimos 30 pares de base são mantidas para proteger local potencial de ligação ribossomal usado por um gene adjacente a jusante. A regi?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primer F2	Integrated DNA Technologies	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
R2 Primer	Ibid	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Primer F2P	Ibid	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
P1 Primer	Ibid	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
P2 Primer	Ibid	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5 'end_R1_seq	Ibid	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5 'end_F3_seq	Ibid	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5 'end_R1p_seq	Ibid	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	Sequência: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
DNA Polymerase	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq DNA Polymerase High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc.	R0101S	Enzima de restrição
Agar	American Bioanalytical	AB01185
Agarose	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Brain Heart Infusion
Horse soro	Fisher Scientific	SH3007403	Horse soro
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Canamicina
TH caldo	BD Biosciences	249240	Caldo Todd Hewitt
PureLink 96	Invitrogen	K310096	96 PureLink kit de purificação PCR
QIAquick	Qiagen	28106	Kit de purificação PCR QIAquick
Filtro	Corning	431117	Filtro de 0,22 uM poliestireno
Sistema Anoxomat	Mart Microbiologia bv	Anoxomat Mark II
Centrífuga de bancada	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Além disso microplaca rotor
Documentação Gel	UVP LLC	BioDoc-It 210
Incubadora	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet de Gel XL	Labnet	E0160	Labnet de Gel XL
Microcentrífuga	Eppendorf	22621408	Microcentrífuga 5415 R
Pipetas Multicanal	Thermo scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Thermal Cycler	Applied Biosystems Inc.	N805-0200	GeneAmp PCR System 9700