ゲノムワイドな遺伝子欠失で<em&gt;ストレプトコッカス血統</em&gt;ハイスループットPCRによる

要約

効率的なゲノムワイドな単一遺伝子突然変異法は使用して確立されているストレプトコッカス血統モデル生物として。この方法は、高スループット換えPCRとの変換を介して実現しています。

要約

トランスポゾン突然変異誘発及び単一遺伝子欠失は細菌^1,2におけるゲノムワイドな遺伝子ノックアウトで適用2つの方法です。トランスポゾン突然変異誘発は、低コスト、時間の無駄であり、完成したゲノム情報を必要としませんが、この方法で2つの弱点がありますが：低下競争を有する変異体をカウンターで選択された混合された変異体ライブラリー内の異なる変異体（1）の可能性が;と、（2）部分的な遺伝子の不活性化の可能性はそれによって遺伝子が完全にトランスポゾンの挿入後に、その機能を失うことはありません。単一遺伝子欠失解析は、トランスポゾン突然変異誘発に付随する欠点を補償することができる。ゲノムワイドな単一遺伝子欠失の効率を改善するために、私たちはモデル生物として連鎖球菌血統を使ってゲノムワイドな単一遺伝子欠失のためのハイスループット技術を確立しようとします。各遺伝子の欠失は、Sで構築血統ゲノムは1を備えるように設計されています標的遺伝子の-kbの上流に、標的遺伝子のカナマイシン耐性タンパク質をコードAPHA-3遺伝子、および1-kbの下流。それぞれのプライマーF1/R1、F2/R2、F3/R3と、、の3つのセットを設計し、各欠失構築物のこれらの3つのコンポーネントのPCR増幅のための96ウェルプレートフォーマットで合成される。プライマーR1とF3はそれらの5 '末端APHA-3遺伝子の領域に相補的な25塩基対の配列を含む。 APHA-3遺伝子の大規模PCR増幅はすべて単一遺伝子欠失構築物を作成するために一回行われます。 APHA-3遺伝子のプロモーターは、当初カナマイシンカセットの潜在的な極性の影響を最小限に抑えるために除外されます。遺伝子欠失構築物を作成するには、ハイスループットPCR増幅および精製は、96ウェルプレートフォーマットで行われます。各遺伝子欠失のための線形換えPCRアンプリコンは、高忠実度DNAポリメラーゼを用いて4つのPCR反応を介して構成されます。初期EXPONSの動増殖期トッドヒューイットブロス中で培養した血統は、不活化ウマ血清をPCR-換え構築物の形質転換のために能力を高めるために使用される2.5％を補足。この条件では、Sの最大20％ 血統細胞は DNAの約50 ngを使用して変換することができます。このアプローチに基づいて、単一遺伝子欠失を持つ2048の変異体は、最終的にSの2270の遺伝子から得られたSに他のORF内に完全に含まれる4つの遺伝子のORFを除く血統血統 SK36と218潜在的な必須遺伝子。遺伝子欠失構築物を作成するための技術は、高スループットであり、任意の形質転換可能な細菌のゲノムワイドな単一遺伝子欠失で使いやすいかもしれません。

プロトコル

1。プライマー設計

1. プライマーはS.に基づいて家のスクリプトで使用して設計されてい血統 SK36ゲノム配列。プライマー、F1/R1、F2/R2、F3/R3と、3組の標的遺伝子の1-kbの上流配列を増幅するために設計されており、APHA-3をコードする遺伝子、カナマイシン耐性（キロ^r）はタンパク質³と1それぞれの標的遺伝子の-kbの下流配列、（ 図1）。これらのプライマーのうち、F1およびR3は、プログラムのEMBOSSスイート（でePrimer3を使用して設計されてhttp://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.htmlターゲットの上流または下流隣接領域を増幅するために）遺伝子。遺伝子特異的プライマー、R1とF3は、標的遺伝子の5 'および3'配列に基づいて設計されています。 R1とF3プライマーはAPHA-3に相補的であり、それらの5 '末端の25-bpのアダプター配列を含んでいる遺伝子。各プライマーの融解温度は、できるだけ近い60になるように設計されました°C、96ウェルフォーマットで、すべてのPCR反応のため均一なアニール温度の使用を可能にする。
2. F1、R1、F3とR3プライマーは遺伝子の順序に基づいて、96ウェルプレート内で合成される。各プレートは、同じ遺伝子の順序におけるプライマーの1種類が入っています。マルチチャンネルピペットを用いてPCR増幅のための10μMの最終濃度になるように96ウェルワーキングプライマープレート内のプライマーを希釈します。

2。ハイスループットPCR増幅および精製

1. ターゲットSの1-kbの上流または下流を増幅する高スループットへ血統の遺伝子は、1640μlのddH ₂ Oを、250μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液200μl、50mMのMgSO _4を 、100μlの100μlを含む15 mlコニカルチューブ内の氷の上でPCRカクテル混合物を組み立てる10 ng /μlにS.血統 SK36ゲノムDNAおよび10μlのプラチナTaq DNAポリメラーゼpolyme撃つ高忠実度やマルチチャンネルピペットを用いて、96ウェルPCRプレートに各ウェルに23μlの混合物を転送します。マルチチャンネルピペットを用いて、PCRプレートにプライマープレートを作業10μMから各F1とR1（またはF3およびR3）の1μLを。 PCRプレートを密封し、1.5分間、30秒、68℃で30秒間、1分間、及び94℃の30サイクル、54℃、94℃で増幅を行う。
2. 48ウェルフィッティングマルチチャンネルピペットのロードとエチジウムブロマイドを含む1％アガロースゲルを準備します。 96ウェルプレートに5xDNAローディングバッファー1μlを4μlのPCR産物を混合し、10μlのマルチチャンネルピペットを用いてアガロースゲルにサンプルをロードします。 30分間135 Vで電気泳動を実行します。 UVPのマニュアルおよび解析システムでゲル上のバンドを調べます。
3. 製造業者の指示に従って遠心分離を用いPureLink 96 PCR精製キットでPCR産物を精製する。 DNAを溶出するために、bのウェルに40μlの滅菌蒸留H ₂ Oを追加プレートをinding。
4. ランダム光度計、分光光度計を用いてDNA濃度を調べるために板の上にいくつかの精製されたアンプリコンを選ぶ。 〜10 ng /μlに、プレート上のアンプリコンの濃度を調整します。
5. プラスミドを含むキロ^Rカセット^は PCR鋳型としてEcoRIにて Iを用いて消化される。消化したプラスミドをQIAquick PCR精製キットにより精製されており、線状プラスミドDNAは最終DNA濃度が10 ng /μlに調整されます。 _{4、10μM、F2、1μl}の1μlのSO 16.4μlのddH ₂ Oを、2.5μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液2μl、50mMのMgの1μlを含むキロ^{Rカセット}リコン用の25μlの混合物を組み立てる10μMのR2は、1μlの線状プラスミドDNAを、0.1μlのプラチナTaq DNAポリメラーゼハイファイ。 ℃で1分間、30秒、68のために30秒で1分、そして94℃の30サイクル、55℃、94℃でPCR増幅を行う。 1％アガロースゲル上で電気泳動によりPCR産物を調べます。うんちQIAクイックPCR精製キットで10個々のPCR精製からキロ^{Rカセット}リコンのラバルク。 10 ng /μlにするアンプリコンの濃度を調整します。
6. 最後の直線換えPCRアンプリコンを取得するには、3つのPCRアンプリコンはウェルPCRテンプレートとして1 PCRプレートの各1μlを（ほぼ等しいモル量で）と結合されます。他のPCRコンポーネント_4、10μMのF1を1μl、10μMR3の1μlのは、SO 14.4μlのddH ₂ Oを、2.5μlの10xHighフィデリティPCRバッファー、10mMのdNTP混合液2μl、50mMのMgの1μlを含めて追加されます0.1μLプラチナTaq DNAポリメラーゼハイファイ。 PCR増幅は4分間3.5分、最後に68℃で30秒、68℃30秒55℃2分間、94℃で30サイクル、94℃で行われる。
7. アガロースゲル上のPCR増幅産物を調べます。上記のように、PCR産物を精製し、定量化する。 -20℃で再結合されたPCRアンプリコンを凍結

3。 COMpetent細胞の調製

1. トッドヒューイットブロスを作製し、室温まで冷却し、0.22μmのポリスチレンフィルタ^4を用い^て滅菌^した後沸騰するまで加熱10NのNaOHを用いてpHを7.6に調整。 TH + HS媒体を補うために、15 mlコニカルチューブに11.7ミリリットルトッドヒューイットブロスに300μlの熱不活化ウマ血清（2.5％最終濃度）を追加します。アリコートのTH + HS培地2ml及びチューブ内に10ミリリットル。
2. 株式Sの5μlを接種血統 SK36は2ミリリットルのTH + HS培地中に-80℃で凍結し、37℃でしっかりとプレインキュベート10ミリリットル-TH + HSチューブ伴う℃をキャッピングで一晩培養した培養液をインキュベートする。
3. 一晩後、10ミリリットルのTH + HSに50μlの培養を転送し、3時間（0.07から0.08のOD ₆₆₀に対応）37℃でチューブをインキュベート、直ちに形質転換のために使用します。

4。細胞の形質転換と抗生物質選択

1. 70 ngのSの2μlを加え血統 SK36コンペタンス刺激ペプチド（CSP）および37のブロック96ウェル、それらプリ暖かい上のエッペンドルフチュー​​ブに2μlの線形リコンビナントPCRアンプリコン（〜50 ngの）℃各試験管に3時間インキュベートしたSK36文化の330μlを。 1時間37℃でインキュベートする。制御などの滅菌ddH ₂ OでDNAを交換してください。
2. 氷の上にブロックを配置し、500μg/ mlのカナマイシンをブレインハートインフュージョン（BHI）寒天プレート上でそれぞれの変換の100μlを広げた。微好気条件下で2日間37℃でプレートをインキュベートする。

5。変異体の確認とストレージ

1. それぞれの置換変異体は、ランダムに、2個のコロニーを拾う500μg/ mlのカナマイシンを含む5mlのBHI培地にコロニーを接種し、37℃で一晩microaerobically接種をインキュベート℃に-80℃で30％グリセロールで各文化を凍結保存°C
2. 、予想される遺伝子置換を含む変異体は、それぞれの変異体を使用してF1とR3にはコロニーPCRを行うかどうかを調べるために、96ウェルPCRプレートのプライマー。個々のコロニーから約1μlの一晩培養物を25μlのPCR-増幅反応におけるDNA鋳型として使用されます。 PCRは℃で3.5分、最後に68℃で4分間、30秒、68で30秒、55℃で5分、94、35サイクルの°Cのために94℃で行われる。
3. 正確にはダブルバンド変異体又は汚染PCRアンプリコンを識別するには、エチジウムブロマイド染色で> 12センチ2％アガロースゲル上で4時間電気泳動によってPCRアンプリコンを調べます。このアガロースゲル電気泳動条件の下で、≥100 bpの差を持つ任意のアンプリコンが明確に特定された。キロr ^{のカセット}と、野生型遺伝子の増幅に起因するバンドが<100 bpによって異なることが予想されている場合、内部のT1プライマーは、野生型遺伝子をPCRにより検出することができるかどうかを判断するために使用されます。
4. さらに削除を確認するには、アンプリコンはPureLink 96 PCR精製キットで精製し、そのP1プライマーを用いて配列決定されるキロ^{Rカセット}に結合する。配列決定によって確認のみ正しい変異を保持します。

結果

後のPCRプライマーF1とR1を使用して増幅し、F3およびR3は、それぞれSの約1 kbの上流および下流血統遺伝子は、96ウェルフォーマットであった（ 図2A）で得られた。私たちのPCR条件と使用して設計されたプライマーの下では、特定の製品はSから増幅した各PCR反応における血統ゲノムDNA。この結果は、プライマーがSのターゲットに非常に特異的であっ...

ディスカッション

初期のプライマーが設計しながら、隣接する遺伝子の外因性の抗生物質遺伝子と1標的遺伝子の交換の可能性極性効果を最小限に抑えるためには、2つのステップがとられる。削除された遺伝子のほとんどは、プライマーR1とF3は前に終止コドンから30 bpに開始コドンに続く6 BPからコーディング領域を削除するために設計されています。最後の30塩基対は、隣接する下流遺伝子によって使用され?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
プライマーF2	統合DNA技術	TGACTAACTAGGAGGAATAAATGGCTAAAATGAGAATAT
プライマーR2	同上	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAACAATTCATCCAGT
プライマーF2P	同上	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
プライマーP1	同上	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
プライマーP2	同上	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
プライマーの5 'end_R1_seq	同上	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
プライマーの5 'end_F3_seq	同上	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
プライマーの5 'end_R1p_seq	同上	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	シーケンス：NH2-DLRGVPNPWGWIFGR、-COOH
DNAポリメラーゼ	インビトロジェン	11304-102	プラチナTaq DNAポリメラーゼハイフィデリティ
をEcoRI	ニューイングランドバイオラボ社	R0101S	制限酵素
寒天	アメリカン·バイオ分析	AB01185
アガロース	プロメガ	V3125
BHI	BD Biosciences社	237500	ブレインハートインフュージョン
馬血清	フィッシャー·サイエンティフィック	SH3007403	馬血清
キロ	フィッシャー·サイエンティフィック	BP906-5	カナマイシン
THブロス	BD Biosciences社	249240	トッドヒューイットブロス
PureLink 96	インビトロジェン	K310096	PureLink 96 PCR精製キット
QIAクイック	キアゲン	28106	QIAクイックPCR精製キット
フィルター	コーニング	431117	0.22μmのポリスチレンフィルター
Anoxomatシステム	マート微生物BV	AnoxomatマークII
ベンチトップ遠心分離機	サーモサイエンティフィック	75004377	ソーバル伝説RTプラスマイクロローター
ゲルドキュメンテーション	UVP LLC	BioDocイット210
インキュベーター	フィッシャー·サイエンティフィック	11から690-625D	Isotemp
LabnetのジェルXL	Labnet	E0160	LabnetのジェルXL
マイクロ遠心機	エッペンドルフ	22621408	マイクロ遠心機5415 R
マルチチャンネルピペット	サーモScientfic	4661040、4661020	フィンピペットF1]
サーマルサイクラー	アプライドバイオシステムズ	N805-0200	ジーンアンプPCRシステム9700