全基因组基因缺失<em&gt;链球菌血统</em通过高通量PCR

摘要

已经建立一个高效的全基因组单基因突变的方法使用链球菌血统

摘要

转座子突变和单基因缺失的两种方法适用于全基因组基因敲除细菌^1,2。虽然转座子诱变是耗时更少，成本更低，并且不需要完成的基因组信息，在该方法中有两个缺点：（1）在该混合反选择竞争降低的突变体的突变体库的一个完全不同的突变体的可能性;和（2）的部分的基因失活的可能性，即基因的不完全失去的转座子的插入后，它们的功能。单基因的缺失分析可能补偿相关的缺点与转座子诱变。为了提高效率的全基因组的单基因缺失，我们尝试建立了高通量技术的使用链球菌血统作为模式生物的全基因组单基因缺失。每个基因缺失构建S.血统基因组被设计成包括1-kb的上游的靶基因，APHA-3基因，编码卡那霉素抗性的蛋白质，和1-kb的下游的靶基因。分别三套引物F1/R1 F2/R2和F3/R3，设计并合成用于PCR扩增这三个组成部分的每个删除构建在96孔板中的格式。引物R1和F3包含25-bp的序列的APHA-3基因在它们的5'末端的区域是互补的。执行一次创建所有的单基因缺失构建一个大型的APHA-3基因的 PCR扩增。 APHA-3基因的启动子的初步排除卡那霉素磁带，以减少潜在的极性效应。要创建的基因缺失构建，高吞吐量的PCR扩增和纯化是在96孔板中的格式进行。线性每个基因缺失的重组PCR扩增子将通过4采用高保真DNA聚合酶的PCR反应。最初的expon差分生长阶段的S.血统 Todd Hewitt肉汤培养在补充有2.5％灭活的马血清是用来增加PCR的重组构建体的转化能力。在此条件下，高达20％的S.血统细胞可以使用〜50ng的DNA转化。根据此方法，2048个单基因缺失的突变体，最终获得的2270个基因在S.血统不包括4个基因的ORF完全包含在其他的ORF S.血统 SK36和218潜在的必需基因。该技术是高通量基因缺失结构，可以很容易使用任何变形菌的全基因组的单基因缺失。

研究方案

1。引物设计

1. 引物的设计采用了内部脚本的基础上的S.血统的 SK36基因组序列。三套引物，F1/R1，F2/R2和F3/R3被设计用于扩增的1-kb的上游序列的靶基因，APHA-3基因编码卡那霉素抗性（公里^R）蛋白³和1 -kb的下游序列的靶基因，分别（ 图1）。在这些引物中，F1和R 3的设计采用ePrimer3 EMBOSS套件的方案（ http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ）扩增侧翼区的上游或下游的目标基因。基因特异性引物，R 1和F3，设计根据的5'和3'序列的靶基因。 R1和F3引物包含25 bp的适配器，在其5'末端的序列是互补的APHA-3的基因。各引物的熔化温度被设计为尽可能接近到60℃，以使均匀的退火温度可用于所有PCR反应在96孔格式的使用。
2. F1，F3，R1和R3引物合成的基因顺序的基础上在96 - 孔板中。每块板包含一种类型的引物在相同的基因顺序。稀释在96 - 孔工作引物板的引物进行PCR扩增，使用多道移液器中至最终浓度为10μM。

2。高通量PCR扩增，纯化

1. 以高通量扩增出1 kb的上游或下游的目标S.血统基因，组装的PCR鸡尾酒混合物在冰中含有1640微升DDH _{2 O，250}微升10xHigh富达PCR缓冲液，200微升10mM的dNTP混合液，加入100μl的50 mM MgSO _4干燥 ，加入100μl的15毫升锥形管10 ng /μl的S。血统 SK36的基因组DNA和10μl的Taq DNA铂polymeRASE高的保真度和传输23微升的混合物中，每孔96孔PCR板，使用多道移液器。 1微升每个F1和R1（或F3和R3）的传输工作引物板的PCR板使用多道移液器从10μM。密封PCR板和执行放大，在94℃1分钟，30个循环的94℃30秒，54℃下为30秒和68℃1.5分钟。
2. 准备1％琼脂糖凝胶含有溴化乙锭的48孔嵌合多道移液器装载。 4微升的PCR产物用1微升5xDNA样缓冲液混合，在96孔板上，并加载在琼脂糖凝胶上的样品，使用10微升的多道移液器。运行在135 V电泳30分钟。检查带凝胶，UVP记录和分析系统。
3. 纯化的PCR产物由96 PureLink PCR纯化试剂盒，根据制造商的指示的使用离心。为了洗脱DNA，加入40μl的无菌DDH _{2 O}的B井inding板。
4. 随机挑选几个纯化扩增板使用的NanoDrop分光光度计检查的DNA浓度。铭牌上的扩增子的浓度调节到〜10纳克/微升。
5. 消化的质粒公里^ŕ磁带使用ECOR我作为PCR模板。消化的质粒通过QIAquick PCR纯化试剂盒纯化和线性质粒DNA被调整到最终DNA浓度10纳克/微升。组装25微升混合物公里^ŕ盒扩增子包括16.4微升DDH _{2 O，2.5}微升10xHigh富达PCR缓冲液，2微升10mM的dNTP混合液，1微升的50mM的Mg SO _{4，10μMF2，1}微升1微升10μM的R2，1微升的线性质粒DNA和0.1微升白金的Taq DNA聚合酶的高保真度。进行PCR扩增，在94℃1分钟，30个循环的94℃30秒，55℃下为30秒和68℃下进行1分钟。检查的PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳。蒲慕明洛杉矶大部分的^Kmŕ由10个独立的PCR纯化QIAquick PCR纯化试剂盒磁带扩增子。调整的扩增子浓度为10 ng /μL。
6. 以得到最终的线性重组PCR扩增子，3个PCR扩增子相结合，与每1微升（几乎相等的摩尔量），在一个PCR板以及作为PCR模板。其他PCR成分被添加，包括14.4微升DDH _{2 O，2.5}微升10xHigh富达PCR缓冲液，2微升10mM的dNTP混合液，1微升的50mM的Mg SO _4，10μM的F1，1微升1微升10μM的R3， 0.1μL铂金的Taq DNA聚合酶高的保真度。 PCR扩增在94℃下进行30秒55℃2分钟，30个循环的94℃下为30秒和68℃3.5分钟，最后68℃4分钟。
7. 检查PCR产物在琼脂糖凝胶上。如上所述净化和量化的PCR扩增子。冻结重组PCR扩增产物在-20°C。

3。 COMpetent的制备

1. Todd Hewitt肉汤制备，调节pH值至7.6，用10 1N的NaOH，加热至沸腾，然后冷却至室温，并灭菌过滤器⁴使用0.22微米聚苯乙烯。加入300μl的热灭活马血清（终浓度为2.5％）至11.7毫升Todd Hewitt肉汤15毫升锥形管，以弥补TH + HS介质。等分试样TH + HS介质到2毫升和10毫升管中。
2. 接种5μL的股票S.血统 SK36到2ml TH + HS介质和在-80℃下冻结，孵育培养过夜封端紧紧地在37℃下，伴随着预孵育10毫升TH + HS管。
3. 过夜后，转移到10ml TH + HS50μl的文化，管在37℃下孵育3小时（对应0.07-0.08的OD _660），立即使用用于转化。

4。细胞转化和抗生素的选择

1. 加入2μl70毫微克S.血统 SK36 COMPE唐塞刺激肽（CSP）和2微升线性重组PCR扩增子（〜50毫微克）到Eppendorf管中，在96孔块和预暖它们在37℃下每管330μl的3小时孵育SK36文化的转移。在37℃下孵育1小时。替换DNA，用无菌DDH _{2 O}控制。
2. 块放置在冰上，并与500微克/毫升卡那霉素的脑心浸液（BHI）琼脂平板上传播100μl的每个变换。在37°C孵育板微氧条件下为2天。

5。突变的确认和存储

1. 每次更换突变体，随机挑选2个单个菌落，接种到5毫升BHI为500μg/ ml卡那霉素的殖民地和孵化接种microaerobically隔夜在37°C。 30％的甘油冷冻保存每一种文化在-80°C
2. 要检查是否包含预期的基因替代突变体，每一个突变F1进行菌落PCR和R3引物在96孔PCR板。约1微升过夜培养从单个菌落作为模板DNA的25微升的PCR扩增反应中使用。进行PCR，在94℃5分钟，35个循环的94℃下30秒，55℃3.5分钟，最后68℃下4分钟为30秒和68℃下进行。
3. 为了精确地确定双波段的突变体或污染物的PCR扩增，通过电泳检查PCR扩增子，在> 12厘米长的2％琼脂糖凝胶用溴化乙锭染色的4小时。这琼脂糖凝胶电泳条件下，任何扩增产物≥100 bp的差异进行明确标识。当频带从公里^ŕ盒扩增的野生型基因所产生的预期<100，一个内部的T1引物使用，以确定是否可以通过PCR检测的野生型基因的沸点不同。
4. 为了进一步确认删除时，PureLink 96 PCR纯化试剂盒纯化，扩增子的使用P1引物和测序结合公里^ŕ盒。只保留正确的突变体经测序证实。

结果

经过PCR扩增用引物F1和R1，和F3和R3，约1 kb的上游和下游的每个S.血统基因中得到的96孔板的形式，分别为（ 图2A）。在我们的PCR条件下，使用设计引物，扩增特定产品的S.血统每个PCR反应中的基因组DNA。此结果表明，该引物对具有高度特异性的目标的S.血统 。通过PCR扩增使用F1和R3引物和3扩增子作为DNA模板，线性的重组PCR构造（〜3 kb的）的高通量的96孔板中，组成的...

讨论

为了尽量减少可能的极性的影响1与外源性抗生素基因对邻近基因的靶基因的更换，采取两个步骤，而最初的引物设计。对于大多数已删除的基因，引物R1和F3被设计用于删除后的6个碱基的30 bp的起始密码子到终止密码子之前的编码区。最后保留了30个碱基对，以保护潜在的使用相邻的下游基因的核糖体结合位点。两个相邻的基因之间的保留区域被扩展到100 bp的，当他们位于相反方向，这两种蛋白的...

材料

Name	Company	Catalog Number	Comments
引物F2	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
入门R2	同上	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
入门F2P	同上	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
引物P1	同上	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
引物P2	同上	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
同上	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
同上	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
同上	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	序列：NH 2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH的
DNA聚合酶	Invitrogen公司	11304-102	铂金Taq DNA聚合酶高保真
EcoRI位	新英格兰生物实验室公司	R0101S	限制性内切酶
琼脂	AB01185
琼脂糖	Promega公司	V3125
BHI	BD Biosciences公司	237500	脑心浸液
马血清	默飞世尔科技	SH3007403	马血清
KM	默飞世尔科技	BP906-5	卡那霉素
TH肉汤	BD Biosciences公司	249240	Todd Hewitt肉汤
PureLink 96	Invitrogen公司	K310096	PureLink 96 PCR纯化试剂盒
QIAQUICK	Qiagen公司	28106	的Qiaquick PCR产物纯化试剂盒
过滤器	康宁	431117	0.22微米的聚苯乙烯过滤器
Anoxomat系统	沃尔玛微生物BV	Anoxomat Mark II的
台式离心机	赛默飞世尔科技	75004377
凝胶	UVP有限责任公司	BioDoc-210
孵化器	默飞世尔科技	11-690-625D	Isotemp
Labnet	E0160
微型离心机	Eppendorf公司	22621408	微量5415ŕ
多道移液器	热Scientfic	4661040，4661020	Finnpipette F1
热循环仪	应用生物系统公司	N805-0200	GeneAmp PCR系统9700