По всему геному Гена удаления в<em&gt; Streptococcus sanguinis</em&gt; По высокая пропускная способность ПЦР

Резюме

Эффективное генома одного метода генной мутации была создана использования Streptococcus sanguinis В качестве модельного организма. Этот метод осуществляется через высокую пропускную способность рекомбинантного ПЦР и преобразований.

Аннотация

Транспозонов мутагенеза и одного гена удаления двух методов, применяемых в генома генов нокаутом в ^1,2 бактерии. Хотя транспозона мутагенеза является менее трудоемким и менее дорогостоящими, и не требует завершить геноме информации, есть два слабых места в этом методе: (1) возможность разных мутантов в смешанном мутант библиотека, которая по борьбе с мутантами выбирает со снижением конкуренции; и (2) возможность частичной инактивации гена которой гены не полностью теряют свои функции после введения транспозона. Одного гена удаления анализа могут компенсировать недостатки, связанные с мутагенеза транспозонов. Для повышения эффективности генома одного делеции гена, мы пытаемся установить высокую пропускную техника для генома одного удаления гена с использованием Streptococcus sanguinis в качестве модельного организма. Каждый ген удаления построить в S. sanguinis генома предназначен для составляющих 1КБ вверх по течению от целевого гена, APHA-3 гена, кодирующего белок канамицину и 1-кб ниже целевого гена. Три комплекта F1/R1 грунтовки, F2/R2, и F3/R3, соответственно, разработан и синтезирован в 96-луночный планшет формата для ПЦР-амплификации из этих трех компонентов каждого удаления построить. Грунтовки R1 и F3 содержат 25-BP последовательности, которые являются дополнением к регионам APHA-3 гена в конце их 5. Крупномасштабных ПЦР-амплификации APHA-3 гена выполняется один раз для создания всех одно-генных конструкций удаления. Промоутер APHA-3 гена изначально исключены чтобы свести к минимуму потенциальные полярный эффект кассетного канамицин. Для создания конструкции гена удаления, высокой пропускной ПЦР-амплификации и очистки осуществляется в 96-луночный планшет формата. Линейные рекомбинантного ампликона ПЦР для каждого гена удаление будет составлен через четыре реакции ПЦР с использованием высококачественных ДНК-полимеразы. Первоначальный EXPONдифференциальной фазы роста S. sanguinis культивировали в Todd Hewitt бульоне с добавлением 2,5% инактивированной лошадиной сыворотки используется для повышения компетенции для преобразования ПЦР-рекомбинантной конструкции. При этом условии до 20% С. sanguinis клетки могут быть трансформированы ~ 50 нг ДНК. Основываясь на этом подходе, 2048 мутанты с одного гена удаления в конечном итоге были получены из 2270 генов S. sanguinis учета ORFs четыре гена, целиком в рамках других ORFs в S. sanguinis SK36 и 218 потенциальных существенных генов. Техника на создание конструкции ген удаления высокой пропускной способностью и может быть легко использовать в генома одного удаления гена для любого трансформируемые бактерий.

протокол

1. Primer Design

1. Грунтовки предназначены использования в доме сценарии основаны на S. sanguinis SK36 последовательность генома. Три набора праймеров, F1/R1, F2/R2, и F3/R3 предназначены для усиления 1-кб перед последовательностью гена-мишени, APHA-3 ген, кодирующий устойчивость к канамицину (Km ^г) белка ³ и 1 КБ вниз по течению последовательности гена-мишени, соответственно (рис. 1). Среди этих праймеров, F1 и R3 разработана с использованием ePrimer3 в EMBOSS набор программ ( http://emboss.sourceforge.net/apps/cvs/emboss/apps/index.html ) для усиления фланкирующие области выше или ниже целевого ген. Гена специфических праймеров, R1 и F3, разработаны основанные на 5 'и 3' последовательности гена-мишени. R1 и F3 праймеры содержат 25-BP адаптер последовательностей в конце их 5 ', которые являются дополнением к APHA-3ген. Температура плавления каждого праймера были разработаны, чтобы быть как можно ближе к 60 ° C, чтобы разрешить использование единой температуры отжига для всех ПЦР-реакции в 96-луночный.
2. F1, R1, R3 F3 и праймеры синтезированы в 96-луночные планшеты на основе генного порядка. Каждая пластина содержит один вид грунтовки в том же порядке ген. Развести праймеров в 96-и рабочих грунтовки пластины до конечной концентрации 10 мкМ для ПЦР-амплификации помощью многоканальной пипетки.

2. Высокая пропускная способность ПЦР-амплификации и очистки

1. Для высокой пропускной способностью усиливать 1-кб выше или ниже целевого С. sanguinis генов, собрать смесь ПЦР коктейлей на льду в 15-мл коническую трубку с 1640 мкл DDH ₂ O, 250 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 200 мкл 10 мМ смеси дНТФ, 100 мкл 50 мМ MgSO _4, 100 мкл 10 нг / мкл С. sanguinis SK36 геномной ДНК и 10 мкл Taq ДНК Платиновый polymeрасе высокой точностью и передачи 23 мкл смеси в каждую лунку в 96-луночный ПЦР планшет помощью многоканальной пипетки. Передача 1 мкл каждого F1 и R1 (или F3 и R3) от 10 мкМ праймера рабочей пластины к пластине ПЦР с использованием многоканальной пипетки. Печать ПЦР планшет и выполнять усиления при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 54 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 1,5 мин.
2. Подготовьте 1% агарозном геле, содержащем бромистый этидий с 48 скважин установки загрузки многоканальной пипетки. Смешайте 4 мкл продукта ПЦР с 1 мкл буфера загрузки 5xDNA на 96-луночный планшет и загрузить образцы на агарозном геле с использованием 10-мкл многоканальной пипетки. Выполнить электрофорез при 135 В в течение 30 мин. Изучите полосы на геле в UVP документации и анализа системы.
3. Очищают продуктов ПЦР по PureLink 96 ПЦР-комплект очистки с использованием центрифугирования в соответствии с инструкцией завода-изготовителя. Для элюирования ДНК, добавить 40 мкл стерильной DDH ₂ O в яме бinding пластины.
4. Случайно выбрать несколько очищенных ампликонов на пластине для изучения ДНК концентраций с использованием NanoDrop спектрофотометр. Отрегулируйте концентрацию ампликонов на тарелке ~ 10 нг / мкл.
5. Плазмиды, содержащей Km ^г кассеты переваривается использованием EcoR я как шаблон ПЦР. Переваривается плазмиды очищают QIAquick набора для очистки ПЦР и линейной плазмидной ДНК доводят до конечной концентрации ДНК 10 нг / мкл. Соберите 25 мкл смеси для Km ^г кассеты ампликона, в том числе 16,4 мкл DDH ₂ O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO _4, 1 мкл 10 мкМ F2, 1 мкл 10 мкМ R2, 1 мкл линейной плазмидной ДНК и 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. Выполните ПЦР-амплификации при 94 ° С в течение 1 мин, 30 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° С в течение 1 мин. Изучить продукт ПЦР помощью гель-электрофореза в 1% агарозном. Pooла большую часть кассеты Km ^г ампликона из 10 отдельных ПЦР очищали с помощью набора для очистки QIAquick ПЦР. Отрегулируйте ампликона концентрации до 10 нг / мкл.
6. Для получения окончательного линейного рекомбинантного ампликонов PCR, три ПЦР ампликонов сочетаются друг с 1 мкл (почти в равных молярных количествах) в одной ПЦР планшет также ПЦР шаблона. Другие компоненты ПЦР добавлены в том числе 14,4 мкл DDH ₂ O, 2,5 мкл 10xHigh Fidelity PCR буфера, 2 мкл 10 мМ дНТФ смеси, 1 мкл 50 мМ Mg SO _4, 1 мкл 10 мкМ F1, 1 мкл 10 мкМ R3, 0,1 мкл Taq Платиновый ДНК-полимераза с высокой точностью. ПЦР-амплификации проводят при 94 ° С в течение 2 мин, 30 циклов при 94 ° C в течение 30 сек 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин.
7. Изучите ПЦР ампликонов на агарозном геле. Очищают и количественной ПЦР ампликонов как описано выше. Замораживание рекомбинированные ампликонов PCR при -20 ° C.

3. ComПодготовка компетентных клетках

1. Тодд Хьюитт бульон готов, скорректированная рН до 7,6 с помощью 10 N NaOH, нагревают до кипения, а затем охлаждают до комнатной температуры и стерилизовать с использованием 0,22 мкм полистирола фильтр ^4. Добавить 300 мкл инактивированной сыворотки лошади (конечная концентрация 2,5%) до 11,7 мл бульона Todd Hewitt в 15-мл коническую трубку составить TH + HS среды. Алиготе TH + HS среду в 2 мл и 10 мл в пробирки.
2. Инокулировать 5 мкл на складе С. sanguinis SK36 замораживали при -80 ° C в 2 мл TH средний + HS и инкубировать в течение ночи с культурой укупорки плотно при 37 ° С, сопровождается предварительной инкубации 10 мл-TH + HS трубку.
3. После ночи, трансфер 50 мкл культуры в 10 мл TH + HS и инкубировать в трубке при 37 ° C в течение 3 часов (соответствует OD ₆₆₀ из 0,07-0,08), сразу же использовать для преобразования.

4. Трансформации клеток и Антибиотик выбора

1. Добавить 2 мкл 70 нг С. sanguinis SK36 компетенцийществования стимулирующий пептид (CSP) и 2 мкл линейного рекомбинантного ПЦР ампликона (~ 50 нг), чтобы Эппендорфа на 96-луночный блок и предварительно нагреть их при температуре 37 ° C. Передача 330 мкл 3 час-инкубационных SK36 культуры в каждую пробирку. Инкубировать при 37 ° С в течение 1 часа. Заменить ДНК стерильной DDH ₂ O в качестве контроля.
2. Установите блок на льду и распространился 100 мкл каждого преобразования на мозг сердце инфузии (BHI) агар пластины с 500 мкг / мл канамицина. Инкубируйте пластины при температуре 37 ° C в течение 2 сут при микроаэробных условиях.

5. Мутант подтверждения и хранения

1. Для каждой замены мутант, случайно подхватывать 2 отдельных колоний, привить колонии в 5 мл BHI, содержащий 500 мкг / мл канамицина и инкубировать посевной microaerobically течение ночи при 37 ° C. Криоконсервируют каждой культуре в 30% глицерине при -80 ° C
2. Чтобы изучить вопрос о мутанта содержащий ген ожидается замена, выполнить ПЦР колоний для каждого мутанта с помощью F1 и R3праймеров в 96-луночный планшет ПЦР. О 1-мкл ночной культуры из отдельных колоний используют в качестве ДНК-матрицы в 25-мкл ПЦР-реакции амплификации. ПЦР проводят при 94 ° C в течение 5 мин, 35 циклов 94 ° C в течение 30 сек, 55 ° C в течение 30 сек и 68 ° C в течение 3,5 мин, и, наконец, 68 ° C в течение 4 мин.
3. Чтобы точно определить двойной группой мутантов или загрязнения ампликона ПЦР, ПЦР изучить ампликона с помощью электрофореза в течение 4 часов на> 12 см длиной 2% агарозном геле с окрашиванием этидийбромидом. В соответствии с этим условием электрофореза в агарозном геле, любой ампликонов с разницей ≥ 100 б.п. были четко определены. Когда полосы в результате усиления кассеты ^г Km и дикий тип гена, как ожидается, отличаются <100 б.п., внутреннего праймера T1 используется для определения, является ли ген дикого типа могут быть обнаружены с помощью ПЦР.
4. Для дальнейшего подтверждения удаления ампликонов очищают PureLink 96 набора для очистки ПЦР и секвенировали с использованием P1 праймер,связывается с кассетой ^г Км. Хранить только правильные мутантов подтвердить путем секвенирования.

Результаты

После ПЦР-амплификации с использованием праймеров F1 и R1, и F3 и R3, около 1-кб до и после каждого S. sanguinis генов были получены в 96-луночный, соответственно (рис. 2A). В наших условиях ПЦР и использовании предназначен грунтовки, конкретный продукт был амплифицирован из S. sanguinis ?...

Обсуждение

Чтобы свести к минимуму возможные полярные эффекты замены одного целевого гена с экзогенного гена антибиотиков на соседние гены, две шаги при начальном проектировании грунтовки. Для большинства удалены гены, праймеры R1 и F3 предназначены для удаления кодирующей области от 6 б.п. после с...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Primer F2	Комплексная ДНК-технологии	TGACTAACTAGGAGGAATAAATG GCTAAAATGAGAATAT
Primer R2	Там же	CATTATTCCCTCCAGGTACTAAAA CAATTCATCCAGT
Primer F2p	Там же	GATAAACCCAGCGAACCATTTGA
Primer P1	Там же	GCTTATATACCTTAGCAGGAGACA
Primer P2	Там же	GTATGACATTGCCTTCTGCGTCC
Primer 5 'end_R1_seq	Там же	GCCATTTATTCCTCCTAGTTAGTCA
Primer 5 'end_F3_seq	Там же	GTTTTAGTACCTGGAGGGAATAATG
Primer 5 'end_R1p_seq	Там же	CCTCAAATGGTTCGCTGGGTTTATC
CSP	Synprep	Последовательность: NH2-DLRGVPNPWGWIFGR-COOH
ДНК-полимеразы	Invitrogen	11304-102	Platinum Taq ДНК-полимеразы High Fidelity
EcoRI	New England Biolabs Inc	R0101S	Рестрикционный
Агар	Американские Биоаналитическая	AB01185
Агароза	Promega	V3125
BHI	BD Biosciences	237500	Brain сердца Инфузионная
Лошадиной сыворотки	Fisher Scientific	SH3007403	Лошадиной сыворотки
Km	Fisher Scientific	BP906-5	Канамицин
TH бульоне	BD Biosciences	249240	Todd Hewitt бульоне
PureLink 96	Invitrogen	K310096	PureLink 96 ПЦР-комплект очистки
QIAquick	Qiagen	28106	QIAquick ПЦР-комплект очистки
Фильтр	Corning	431117	0,22 мкм полистирола фильтр
Anoxomat системы	Mart микробиологии BV	Anoxomat Mark II
Настольные центрифуги	Thermo Scientific	75004377	Sorvall Legend RT Plus планшет ротором
Гель Документация	UVP ООО	BioDoc-It 210
Инкубатор	Fisher Scientific	11-690-625D	Isotemp
Labnet по Gel XL	Labnet	E0160	Labnet по Gel XL
Микроцентрифуга	Eppendorf	22621408	Микроцентрифуга 5415 R
Многоканальные пипетки	Thermo Scientfic	4661040, 4661020	Finnpipette F1
Термоциклер	Applied Biosystems Инк	N805-0200	GeneAmp ПЦР-системы 9700