ספיגה דו צדדי משותף עורק תרדמה כגירוי נפשית מראש מספיק כדי לגרום סובלנות איסכמי מוקדמת לאיסכמיה מוחית מיקוד

Summary

יש מצטבר ראיות, שנפשי מראש איסכמי (PC) - אתגר איסכמי שאינו מזיק למוח - מעניק הגנה זמנית לעלבון איסכמי מזיק שלאחר מכן. הקמנו הבילטרלי חסימת עורק תרדמה משותפת (BCCAO) כגירוי נפשית מראש כדי לגרום לסובלנות איסכמי מוקדם (IT) לאיסכמיה מוחית מוקדי חולפים (הנגרם על ידי חסימה של עורק מוח אמצעי, MCAO) בC57BL6 / י עכברים.

Abstract

יש מצטבר ראיות, שנפשי מראש איסכמי - אתגר איסכמי שאינו מזיק למוח - מעניק הגנה זמנית לעלבון איסכמי מזיק שלאחר מכן. הקמנו חסימת עורק תרדמה משותפת דו צדדית כגירוי נפשית מראש כדי לגרום לסובלנות איסכמי מוקדם לאיסכמיה מוחית חולפת במוקד C57BL6 / עכברי J. בסרטון הזה, נדגים את המתודולוגיה ששמשה למחקר זה.

Introduction

שבץ איסכמי הוא מחלה עם תמותה גבוהה וניטל כלכלי וחברתי עצום ^1. למרות מאמצים מדעיים ניסיוניים וקליניים אינטנסיביים ברחבי העשורים אחרונים, אפשרויות טיפול בחולי שבץ איסכמי חריפים נשארות מוגבלות מאוד ^2. בניגוד לכך, עלייה באחוז של קשישים במדינות מפותחות באופן דרמטי להגדיל את שכיחות ושכיחות של חולים עם שבץ מוחי איסכמי בעשורים הקרובים ^3. לכן, יש צורך דחוף באסטרטגיות טיפול חדשות בחולים עם שבץ מוחי איסכמי.

גישה אחת היא להשיג הבנה נוספת במנגנוני הסתגלות אנדוגני של המוח להתמודד עם גירוי מזיק. neuroprotection המוח המופק מזה ידוע גם בשם נפשית מראש איסכמי (PC), או סובלנות איסכמי (IT), ומתאר תופעה, שבו גירוי מזיק שאינם מזיק להחיל את המוח, גורם להתנגדות חולפתנגד ⁴ עלבון איסכמי מזיק שלאחר מכן. היא מתרחשת בשני חלונות זמן שונים: מוקדם זה, המתרחש בתוך דקות עד כמה שעות לאחר מחשב ועיכבו את ה-IT, אשר צריך השהיה של כמה שעות להתרחש ^4.

עד כה, מחקר על זה במוח התמקד בעכב אותו. הרבה פחות ידוע על המנגנונים של תחילת ה-IT. מטרתו של מחקר זה היא לבסס דו צדדי חסימת עורק תרדמה משותפת (BCCAO) שהיא גירוי כדי לגרום לעיכוב זה, כמו גירוי מחשב נאות הוקם כדי לגרום לתחילת ה-IT לאיסכמיה מוחית מוקדי חולפים (הנגרם על ידי חסימה של עורק מוח אמצעי, MCAO) בC57BL6 / עכברי ג'יי.

במהלך שני הניתוחים (BCCAO וMCAO), ניטור של זרימת דם במוח (CBF) על ידי לייזר דופלר Flowmetry (LDF) בוצע.

BCCAO בוצע בעכברים מורדמים ונושמים באופן ספונטני. שני עורקי התרדמה משותפים (CCA) נחשפווהאפילו על 60 שניות ואחרי 5 דקות של reperfusion. רצף / reperfusion BCCAO זה חזר על עצמו פעמיים. לאחר ניתוח, עכברים התאוששו במהירות ולא הראו שום סימנים של ירידה תפקודית. כדי לשלול, כי פרוטוקול BCCAO מתואר לעיל לא לגרום למוות של תאים במוח מתעכב, ביצענו תיוג TdT בתיווך dUTP-ביוטין ניק סוף (Tunel) מכתים 72 שעות לאחר BCCAO (או ניתוח דמה) ב קבוצה נפרדת.

MCAO הוא מודל נרחב הוקם לזירוז של איסכמיה המוחית מוקדי במכרסמים ^5-7. הניתוחים בוצעו באמצעות נהלי עבודה אחידים (SOP) ^8. לאחר חשיפת המרכז לאמנות עכשווית שמאל, חוט חד סיליקון מכוסה הוכנס המרכז לאמנות העכשווית דיסטלי, התקדמה דרך עורק התרדמה הפנימי (הרשפ"ת) למעגל וויליס ועד עורק המוח הקדמי (ACA) ובכך, מקורו של עורק המוח האמצעי ( MCA) היה האפיל לתקופה מוגדרת של זמן. במחקר זה, שאנובשימוש 45 דקות של MCAO, שתוצאתה בדרך כלל בנגע איסכמי בטריטוריה של MCA אזורים במוח מעורב striatal וקליפת המוח.

במחקר שלנו, נתחנו את הפרופיל הזמני של תחילת IT באמצעות BCCAO כגירוי מחשב. הנתונים שלנו מצביעים, כי עיכוב הזמן האופטימלי בין BCCAO וMCAO לגרום מוקדם זה הוא 30 דקות.

בסרטון הזה, אנו נותנים הדגמה של שני הניתוחים, כלומר BCCAO וMCAO.

Protocol

כל ההליכים המתוארים במאמר זה בוצעו בהתאם להנחיות והתקנות של Landesamt für גזונטהייד und Soziales, ברלין, גרמניה.

הליכים טרום ניתוחיים

1. הכנת הניילון Monofilament

1. להכנת חוטי intraluminal, 8-0 תפרי monofilament ניילון שמשו ונחתכו לאורך של 13 מ"מ כל אחת.
2. לציפוי של monofilaments, Xantopren M רירית, (Heraeus Kulzer GmbH, הנאו, גרמניה) הייתה בשימוש הופעלה על ידי הוספת ירידה של activator פתרון (Activator, יוניברסל ועוד, Heraeus Kulzer GmbH, הנאו, גרמניה).
3. החוט חד היה משוך באיטיות דרך סיליקון עד שהיה מכוסה כולו עם זה. בעשותם כך, monofilament יהיה מכוסה באופן שווה עם סיליקון. הימנע מחכה יותר מדי זמן, כי חומר הציפוי הופעל יהפוך מוצק ויבש במהירות.
4. לפני סיליקון מתחיל לבסס את, מומלץ להפשיט את סיליקון מוגזם מהנימים על ידי משיכתו על דף נייר. בעשותם כך, יכולה להיות דלילה שכבת סיליקון לעובי משוער של 200 מיקרומטר.
5. הבסיס של החוט חד סיליקון המכוסה היה תקוע בפלסטלינה כדי לתת לו להתייבש במשך הלילה.

הערה: באופן אידיאלי, רק עיקור או לפחות אמור לשמש monofilaments עבר חיטוי על מנת להבטיח סטריליות באתר כירורגית. בפועל, עיקור או חיטוי של monofilaments בעבודת היד הוא קשה מאוד בגלל האיכות של monofilaments עלולה להחמיר ^9. לכן, זה עשוי להיות עדיף להשתמש monofilaments סטריליים זמין מסחרי במקום.

2. הכנה של מכשירי ניתוח ושל בעלי חיים

1. כל מכשירי הניתוח הוחזקו ב70% אתיל אלכוהול. בנוסף, לפני כל הליך כירורגי חדש, כל מכשירי הניתוח נוקו בקפידהND לחטא בעזרת אלכוהול 70% אתיל.
2. אזור הניתוח היה לחטא באופן יסודי באמצעות אלכוהול 70% אתיל בכל בעלי החיים לפני חיתוך רוחב. אתרי החיטוי הורשו להתייבש לחלוטין לפני ביצוע החתכים. גזיר נוסף של הפרווה לא בוצע מאחר והדבר עלול לגרום לדלקת בעור וmicroabrasions לאחר ^9.

ניתוחים

3. מיקום של חללית LDF וניטור LDF

1. לאינדוקציה של הרדמה, עכברים נחשפו לתערובת גזים בהיקף של 30% חמצן, 70% N ₂ O ו -2.5% isoflurane שימוש במכשיר אידוי. לצורך התחזוקה של הרדמה, ריכוז isoflurane הופחת ל -1.5%. עכברים היו לנשום באופן ספונטני דרך נשימת מסכה לאורך כל ההליך כירורגי.
2. בדיקה טמפרטורה רקטלית והוכנסה עכברים היו קבועים למסגרת stereotactic חושפת הראש הקודקודית. במהלך ניתוח, עכברים היו מונחים עלתרמוסטט שליטת כרית חימום, על מנת להבטיח טמפרטורת ליבה מתמדת של 37.0 ± 0.5 מעלות צלזיוס חתך קו האמצע sagittal (~ אורך 1 ס"מ) בוצע כדי לחשוף את הגולגולת הקודקודית.
3. בצד השמאל של הגולגולת היה גזור בקפידה ובדיקת סיב אופטי הייתה קבועה ישירות לגולגולת 2 מ"מ והזנב 5 מ"מ לרוחב מגבחת באמצעות דבק מיידי. לאחר מכן, קצות פצע הותאמו בקפידה כדי להימנע מהיפותרמיה המוח, כמו גם זיהומים.
4. העכבר היה הסתובב כדי לחשוף את הצד הגחוני של הצוואר. הבדיקה הסיב האופטי שמחוברת למכשיר LDF (PeriFLUX מערכת 5000, Perimed, Jarfalla, שוודיה) באמצעות חיבור מתאם בדיקה (מאסטר 418-1 Probe, Perimed; Jarfalla, שוודיה).

הערה: בעוד מפנה את העכבר מסביב, הבדיקה הסיב האופטי צריכה להיות כפופה בזהירות על מנת למנוע שהוא משתתק מהגולגולת.

5. מכשיר LDF היה מחובר למחשב נייד computer. הקלטה רציפה של ערכי LDF נערך ביוזמת באמצעות PeriSoft עבור Windows (גרסת 2.50, Jarfalla, שוודיה). איור 1 מדגימה כמובן CBF הממוצע המתקבלים מעשר הקלטות LDF במהלך BCCAO וreperfusion.

4. חסימת עורק תרדמה משותפת דו צדדית

1. הרדמה נשמרה כמתואר בסעיף 3.1. עכבר הונח על גבו. הזנב וכפותיו של בעל החיים היו קבועים לכרית החימום באמצעות סרט דבק. חתך קו האמצע הגחון sagittal (~ 1 סנטימטר אורך) בוצע.
2. שתי בלוטות salivatory הופרדו בזהירות והתגייסו כדי להמחיש את המרכז לאמנות עכשווית של בסיס.
3. גם המרכז לאמנות עכשווית של הופרדו בזהירות מעצבי המחנק בהתאמה והוורידים נלווים מבלי לפגוע במבנים אלה. מניפולציות של עצבי המחנק עלולות להוביל לבעיות בתפקוד זמניים או קבועים של מערכת העצבים הפאראסימפתטית, שבו יש את הפוטנציאל להתרחשות של עיבוד לב משמעותיhythmia או דום לב אף בלתי הפיך. לכן, זה הכרחי כדי למנוע מניפולציות של עצבי המחנק. לולאת תפר משי 5-0 רופפת נעשתה מסביב לכל המרכז לאמנות עכשווית.
4. צינורות סיליקון קטנים (קוטר 2 מ"מ) הוכנס בין המרכז לאמנות העכשווית, ואת תפרי משי בכל צד. צינור זה שימש כקיבוע של מרכז לאמנות העכשווית של על מנת למנוע נזק לדפנות העורקים, כאשר התפרים הוחמרו (איור 4).
5. גם המרכז לאמנות עכשווית שלהם האפילו למשך דקה אחת על ידי הידוק תפרי משי. עכברים בלבד, שבו אות LDF הופחתה ל <10% של אות תחילת המחקר נכללו במחקר. לאחר פתיחתו מחודשת של המרכז לאמנות עכשווית של שניהם, תקופת חמש דקות reperfusion הייתה יזם. על ידי LDF reperfusion שלמה הייתה מובטחת. חיות עם reperfusion שלמה (התאוששות <90%, כלומר של CBF בהשוואה לתחילת המחקר CBF) הוצאו מהמחקר. הרצף של דקה אחת של BCCAO וחמש דקות של reperfusion חזר על עצמו פעמיים עבור סכום כולל BCCAO duratiעל של 3 דקות. איור 1 מציג את קורס CBF הממוצע המתקבל מעשר הקלטות LDF במהלך BCCAO וreperfusion. במהלך ההליך, מומלץ לשמור על צוואר הפצע רטוב באמצעות מלח רגיל.
6. לאחר reperfusion שעברה, כל צינורות והתפרים, כמו גם הבדיקה הסיב האופטי המחוברת לגולגולת הוסרו, את הפצעים שנתפרו ומשחת לידוקאין (2% Xylocain; חברת AstraZeneca GmbH, Wedel, גרמניה) היה להחיל את הפצעים שוב ושוב לפי צורך, עבור ניהול analgetic.
7. עכברים הועברו למחוממים מראש (30 מעלות צלזיוס) תיבת התאוששות (MediHEAT. PecoServives בע"מ בראף, קאמבריה, בריטניה) עד שחזרו להכרה מלאה. לאחר מכן, עכברים הוחזרו לכלובי בעלי החיים שלהם.

5. חסימת עורק מוח אמצעית

1. עכברים מורדמים מחדש, בדיקה טמפרטורה רקטלית הוכנסה עכברים והוצבו על כרית חימום כדי לחשוף את הצד הגחוני של הצוואר. אחר כך, הם wפה קבוע כמתואר בסעיף BCCAO.
2. קשירת קבע באמצעות תפר משי 7-0 ארוך נעשתה סביב המרכז לאמנות העכשווי הפרוקסימלי שמאל ואת החוט בעדינות משכה caudally באמצעות מהדק יתוש (איור 4).
3. עוד מייתר קבוע נעשה סביב עורק התרדמה השמאלי החיצוני (ECA) ואת החוט שמשך לכיוון צד ימין של בעלי החיים (איור 4).
4. רקמות חיבור המקיפות את ICA השמאל גויסה בזהירות ועצב hypoglossal בעדינות הרים כדי לקבל סקירה כללית טובה של הקורס הדיסטלי של ICA. מתכופף שמאל ICA משמאל ואילו עורק pterygopalatine (PPA) עוקב אחרי מסלול הרשפ"ת הפרוקסימלי ימינה (איור 4).

הערה: יש עורק נוסף שניתן לזהות בו פונה ימינה לכיוון הזנב. זהו העורק העורפי, שמקורו variably או מהסתעפות המרכז לאמנות עכשווית או מיחסי הציבורחלק oximal של ECA (איור 4).

5. לולאת תפר רופפת נעשתה סביב הרשפ"ת הפרוקסימלי באמצעות חוט משי 5-0.
6. באמצעות מהדק כלי הדם קטן, הרשפ"ת באופן זמני הייתה האפילה distally ללולאת התפר הרופף 5-0 (איור 4).
7. חתך קטן נעשה בחלק הדיסטלי של המרכז לאמנות עכשווית רק לפני הסתעפות המרכז לאמנות עכשווית באמצעות מספריים כלי הדם (איור 4).
8. חוט חד סיליקון מכוסה נבחר מראש הוכנס למרכז לאמנות העכשווית דרך החתך הקטן ודחף לתוך הרשפ"ת עד שהוא עצר במהדק כלי הדם (איור 4).
9. Microclamp הוסר בזהירות מהרשפ"ת, תוך monofilament היה מתקדם עמוק יותר לתוך הרשפ"ת עד שהוא הפסיק (איור 4). הערה: בשלב זה, להפוך את המלקחיים ביד השמאל, כך שאתה לא מחזיק אותו כמו עט. זה עוזר לתפוס את חוט הלהט עם המלקחיים בקלות רבה יותר.מהדק-מוליך כלי הדם צריך להיות מוחזקים ביד ימין. יתכן שיהיה צורך כמעט להדק 5-0 תפר הרופף סביב הרשפ"ת על מנת למנוע דימום מהצד החתך.
10. המיקום של קצה החוט חד המדויק זוהה כדי לבדוק אם הוא התקדם לתוך יק"א ולא בקטע של PPA. אם קצה החוט חד הוכנס PPA הפרוקסימלי, החוט בעדינות היה משוך לאחור רק לפני הסתעפות הרשפ"ת / PPA. זה היה ניסיון לקדם את החוט חד לרשפ"ת שוב, תוך משיכת עדינות הרשפ"ת הפרוקסימלי קצת לצד ימין. בעשותם כך, המהלך הטבעי של הרשפ"ת הדיסטלי היה מדומה שהופך אותו קל יותר לגשת ליק"א.
11. לאחר שהתקדם לתוך החוט חד הרשפ"ת כמעט לחלוטין, את לולאת תפר 5-0 הרופפת סביב הרשפ"ת הפרוקסימלי הודקה על מנת להחזיק את חוט הלהט במקום. לאחר מכן, כל חוטי המשי קוצרו ופצע העור נתפר.
12. איבוד הנוזלים במהלך הניתוח היה replenished על ידי הזרקת 1.0 מ"ל של תמיסת מלח הרגיל IP לאחר מכן, העכבר הועבר להתאוששות התיבה המחוממת מראש עד שהוא חזר להכרה מלאה.
13. לreperfusion, עכברים היו מחדש מורדמים והחוט חד הוסר לאחר התרופפות תפר 5-0 משי סביב הרשפ"ת הפרוקסימלי בזהירות. לאחר מכן, תפר 5-0 הודק שוב בזהירות על מנת למנוע דימום.
14. לאחר אישור של hemostasis המלא, הפצע בצוואר נתפר.
15. משחה לידוקאין יושמה שוב ושוב באופן מקומי על העור בהתאם לצורך להקלה על כאב והעכבר הועבר ל( 30 מעלות צלזיוס) המחומם מראש תיבת התאוששות עד שהוא חזר להכרה מלאה.
16. כרמז ראשון להליך MCAO מוצלח, חג כיוון השעון של בעלי החיים נצפה. חומרת הגירעון הפונקציונלי הייתה לכמת באמצעות ציון Bederson שונה לעכברים ^10. על פי ציון זה שונה Bederson, ציוני הנוירולוגיותמחדש ידורג כדלקמן: 0 (תפקוד מוטורי נורמלי), 1 (כיפוף של פלג גוף עליון וforelimb הנגדי כאשר העכבר הוסר בזנב), 2 (חג לצד הנגדי, כאשר העכבר נערך בזנבו על משטח שטוח, אבל נורמלי יציבה במנוחה), 3 (נשען לצד הנגדי במנוחה), ו4 (ללא פעילות מוטורית ספונטנית או מת).

6. ניתוח דמה BCCAO

עבור פרוצדורות דמה BCCAO, עכברים היו מורדמים למשך הליך מחשב BCCAO אמיתי, בלוטות הפרשת הרוק גויסו ומרכז לאמנות העכשווית של נחשפו. זה חיוני כי מניפולציות ישירות לעורקי הראש או העצבים מחנק נמנעות במהלך הליך העמדת פנים. מניפולציות של המרכז לאמנות העכשווית יכולות לפגוע בשכבת האנדותל שלה, מה שעלול לגרום לשחרורו של תרכובות vasoactive מהאנדותל או לגרום לפקקת מקומית בתוך לומן עורקים. כתוצאה מכך, אירועים תרומבואמבוליים עלולים להתרחש לאחר ניתוח דמה. זה יהיה confounder עיקרי של הדואר הליך. מצד השני, מניפולציות של עצבי המחנק עלולות להוביל לבעיות בתפקוד זמניים או קבועים של מערכת העצבים הפאראסימפתטית, שבו יש את הפוטנציאל להתרחשות של הפרעות קצב לב או דום לב משמעותיים אף בלתי הפיך. לכן, זה הכרחי כדי למנוע מניפולציות של עצבי המחנק במהלך BCCAO.

הליכים לאחר הניתוח

7. אוטם מדידות נפח

להערכת גדלים אוטמים, עכברים שרדו במשך 72 שעות לאחר MCAO. אחר כך בעלי החיים היו בהרדמה עמוקה, המוח הוסר, בהצמדה קפוא בmethylbutan, מחולק ומוכתם עם hematoxylin (באמצעות הפרוטוקול של Papanicolau) למדידות נפח אוטם. חלקים במוח שנאספו ב 600 מיקרומטר מרווחים ונפחי אוטם נקבעו באמצעות מנתח תמונה (MCID ליבת Rev.2.0 7.0, GE Healthcare מפלי Inc) ותיקן לבצקת לפי השיטה של לין ואח'. ^7,11 .

8. קריטריונים להכללה

אנחנו כללנו בעלי חיים היחידים שהיו ירידה של CBF LDF-נמדדה על ידי יותר מ -90% בכל אחד משלושת פרקי BCCAO. באופן אידיאלי, ניטור LDF צריך להתבצע בשתי אונות המוח במהלך BCCAO. לממשיות, ביצענו ניטור LDF רק בחצי המוח השמאליים, אשר יהיה כפופים לMCAO מאוחר יותר. גישה זו תוארה לפני ^6,12. Reperfusion אחרי כל פרק BCCAO הייתה נדרשה כדי להיות שלם (כלומר חזרה לערכי בסיס). מסיבות של צמצום זמן משך עכברים הוחזקו בהרדמה, לא לפקח על CBF במהלך ניתוח MCAO. במחקר פיילוט עם קבוצה נפרדת של בעלי חיים עם זאת, אנו במעקב על ידי CBF LDF במהלך ניתוח MCAO. בקבוצה זו של עכברים, מדדנו ירידה בCBF ב -90% בהשוואה לתחילת מחקר לפני חסימת המרכז לאמנות עכשווית באופן עקבי. בנוסף, לאחר הסרת monofilaments CBF התאושש ל> 90% בהתאמהערכי בסיס לאחר חסימת המרכז לאמנות עכשווית. קריטריוני LDF אלה הוקמו בספרות ובתוצאה בכרכי אוטם עקבי ^7. אנחנו כלל בעלי חיים אשר היו ציון Bederson של לפחות של 1 לאחר התאוששות מהרדמה לאחר MCAO בלבד. יתר על כן, בעלי החיים היחידים ששרדו במשך 72 שעות לאחר MCAO ואשר לא הראו שום סימנים של דימום תוך גולגולתי נכללו במחקר.

תוצאות

פרוטוקול BCCAO שלנו הסתיים בירידות CBF מיידיות ועמוקות (> 90%), כאשר שניהם היו המרכז לאמנות עכשווית של האפיל (איור 1). פתיחתו מחדש של המרכז לאמנות העכשווית שהובילה להשלמת reperfusion כפיקוח על ידי LDF (איור 1). לאחר מחשב, בעלי חיים לא הראו סימנים של נכות תפקודית. ית...

Discussion

במחקר שלנו, שהראינו כי שלושה רצפים של BCCAO, שכל אחד שנמשך לרגע אחד ואחריו reperfusion במשך חמש דקות, הם גירוי מחשב איסכמי מספיק כדי לגרום לתחילת ה-IT.

יתר על כן, יש לנו הראינו כי פרוטוקול preconditioning משמש הוא הליך בטוח וקטין פולשני ללא תחלואה ל?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the instrument	Company	Catalogue number/model
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	SteREO CL 1500 ECO
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	David Kopf	Model 930
Scissors	FST	91460-11
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Mircovascular clamp	FST	00398-02
Clamp applicator	FST	00072-14
Springscissors	FST	15372-62
Needle holder	FST	12010-14
Needles	Feuerstein, Suprama	BER 562-20
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama