초점 대뇌 국소 빈혈에 조기 허혈성 공차를 유도하기 위해 적절한 전처리 자극으로 양측 경동맥 동맥 폐색

요약

증거가 축적되고, 그 허혈 (PC) - 뇌에 대한 비 손상 허혈성 도전 - 후속 손상 허혈성 모욕을 과도 전압 보호 기능을 부여. 우리는 C57BL6 / J 생쥐의 일시적인 국소 대뇌 허혈 (중간 대뇌 동맥 폐색, MCAO에 의한)에 초기 허혈 내성 (IT) 유도 컨디셔닝 자극으로 양측 경동맥 폐색 (BCCAO)를 설립했다.

초록

증거가 축적되고, 그 허혈 - 뇌에 대한 비 손상 허혈성 도전 - 후속 손상 허혈성 모욕을 과도 전압 보호 기능을 부여. 우리는 C57BL6 / J 생쥐의 일시적인 국소 대뇌 허혈에 초기 허혈 내성을 유도하는 사전 조건 자극으로 양측 경동맥 폐색을 설립했다. 이 비디오에서는, 우리는이 연구에 사용되는 방법을 보여줍니다.

서문

허혈성 뇌졸중은 높은 사망률과 막대한 사회 경제적 부담이 ¹ 병이다. 최근 수십 년에 걸쳐 집중적 인 실험 및 임상 과학적인 노력에도 불구하고, 급성 허혈성 뇌졸중 환자에 대한 치료 ^옵션이 매우 제한 남아 있습니다. 그와는 대조적으로, 선진국의 노인의 비율 증가는 크게 다음 수십 년 ³ 허혈성 뇌졸중 환자의 발생률과 유병률이 증가합니다. 따라서 허혈성 뇌졸중 환자의 새로운 치료 전략을 눌러 필요가있다.

한 가지 방법은 손상 자극에 대처하는 뇌의 내인성 적응 메커니즘 더욱 이해를 얻을 것입니다. 이 뇌 유래 신경 보호는 허혈 (PC) 또는 허혈성 공차 (IT)로 알려진 뇌에 적용되는 비 피해 유해 자극은 일시적인 저항을 유도하는 현상을 설명합니다이후 손상 허혈성 모욕 ^4에. IT 초기 PC 후 몇 시간 분 이내에 발생하며 ⁴ 발생 몇 시간의 대기 시간을 필요로하는 IT 지연 : IT는 두 개의 서로 다른 시간 창에 발생합니다.

지금까지 뇌의 IT에 대한 연구는 IT 연기에 초점을 맞추고있다. 훨씬 덜은 IT 초기의 메커니즘에 알려져있다. 본 연구의 목적은 적절한 PC 자극으로, IT를 지연 유도하기 위해 설립 자극 유도하는 양측 경동맥 폐색 (BCCAO)를 설정하는 것입니다 일시적인 국소 대뇌 허혈 (중간 대뇌 동맥 폐색에 의해 유도, MCAO)에 서둘러 C57BL6에 / J 생쥐.

두 수술시 (BCCAO 및 MCAO), 레이저 도플러 flowmetry (LDF)에 의한 뇌 혈류의 모니터링 (CBF)가 수행되었다.

BCCAO는 마취와 자발적 호흡 생쥐에서 수행되었다. 두 경동맥 (CCA)가 노출되었다60에 대한 폐색 초 재관류 5 분 뒤에. 이 BCCAO / 재관류 순서는 두 번 반복되었다. 수술 후, 마우스는 빨리 회복 및 기능 손상의 흔적을 보여 주었다. BCCAO 프로토콜은 뇌의 지연 세포의 죽음을 초래하지 않았다 위에서 설명한 것을 배제하기 위해, 우리는에 BCCAO 후 72 시간 염색 TDT-중재 dUTP-비오틴 닉 엔드 라벨 ​​(TUNEL) (또는 가짜 수술) 시행 별도 그룹입니다.

MCAO ^5-7 설치류의 국소 대뇌 허혈의 유도 널리 사용되는 모델입니다. 수술 절차는 표준 운영 절차 (SOP) ^8을 사용하여 수행 하였다. 왼쪽 CCA를 노출 한 후, 실리콘으로 덮인 모노 필라멘트는 그로 인하여 전방 대뇌 동맥 (ACA)까지 윌리스의 원형으로 내부 경동맥 (ICA)를 통해 진행하고 말초 CCA, 중간 대뇌 동맥의 기원 (에 도입되었다 MCA)은 정의 된 시간 동안 폐색되었다. 본 연구에서는일반적으로 선조체와 피질 뇌 영역을 포함 MCA 영토에서 허혈성 병변의 결과 MCAO의 사용 45 분.

본 연구에서는, 우리는 초기 IT는 PC 자극으로 BCCAO를 사용하는 임시 프로필을 분석 하였다. 우리의 데이터 BCCAO와 MCAO 사이의 최적의 시간 지연이 IT 30 분, 조기 유도하는 것을 지적했다.

이 비디오에서는, 우리는 모두 수술, 즉 BCCAO 및 MCAO의 데모를 제공합니다.

프로토콜

이 문서에서 설명하는 모든 절차는 Landesamt FÜR 아퍼 싶게 Soziales, 베를린, 독일의 지침과 규정에 따라 수행되었다.

수술 전 절차

1. 필라멘트의 제조

1. 강내 필라멘트의 준비를 위해, 8-0 나일론 모노 필라멘트 봉합사를 사용하였고 13mm 각의 길이로 절단 하였다.
2. 모노 필라멘트의 코팅, Xantopren M 점막 (헤라우스 Kulzer GmbH를, 우, 독일) 활성제 용액 (활성제, 범용 플러스, 헤라우스 Kulzer GmbH를, 우, 독일)의 하락을 추가하여 활성화 사용되었다.
3. 그것은 완전히 덮여 때까지 모노 필라멘트는 천천히 실리콘을 뽑아되었다. 이렇게하면 필라멘트가 균일하게 실리콘으로 덮여 될 것이다. 활성화 된 코팅 물질을 신속 확고하고 건조되기 때문에 너무 오래 대기하지 마십시오.
4. 실리콘 응고 시작하기 전에, 그것은 종이에 그것을 잡아 당겨 필라멘트에서 과도한 실리콘을 제거하는 것이 좋습니다. 이렇게함으로써, 실리콘 층은 200 ㎛의 대략적인 두께로 솎아 할 수 있습니다.
5. 실리콘 덮인 모노 필라멘트의베이스가 하룻밤 건조하게하기 위하여 점토에 붙어 있었다.

코멘트 : 이상적으로, 단지 멸균 또는 적어도 소독 모노 필라멘트는 수술 부위에 무균을 보장하기 위해 사용되어야한다. 모노 필라멘트의 품질이 ⁹ 악화시킬 수 있기 때문에 실제로 손으로 만든 모노 필라멘트의 살균이나 소독은 매우 어렵습니다. 따라서 대신 시판 살균 모노 필라멘트를 사용하는 것이 바람직 할 수 있습니다.

2. 수술 도구와 동물의 준비

1. 모든 수술기구는 70 % 에틸 알콜에 보관 하였다. 또한, 이전에 각각의 새로운 수술 절차, 모든 수술기구는 신중하게 청소했다ND 70 % 에틸 알코올을 사용하여 소독.
2. 수술 영역은 철저하게 절개하기 전에 모든 동물에서 70 % 에틸 알코올을 사용하여 소독 하였다. 소독 사이트는 완전히 절개를 수행하기 전에 건조하도록 허용 하였다. 이 microabrasions 이후의 피부 염증 ⁹ 일으킬 수 있으므로 모피의 추가 클리핑이 수행되지 않았습니다.

수술

3. LDF 프로브 및 LDF 모니터링의 위치

1. 마취 유도를 들어, 마우스는 기화기를 사용하여 30 % 산소, 70 % N ₂ O 2.5 % isoflurane을 구성된 혼합 기체에 노출되었다. 마취의 유지 보수를 위해, isoflurane을 농도는 1.5 %로 감소 하였다. 마우스는 수술을 통해 마스크를 호흡을 통해 자발적 호흡했다.
2. 직장 온도 프로브가 삽입 된 생쥐는 정수리 머리를 노출 정위 프레임에 고정되었다. 수술하는 동안 마우스에 휴식했다온도 제어 난방 패드, ± 0.5 ° C. 37.0의 일정한 핵심 온도를 보장 시상 정중선 절개 (1 ~ cm 길이) 정수리 두개골을 노출 하였다.
3. 두개골의 왼쪽을주의 깊게 박리 및 광섬유 프로브는 즉시 접착제를 사용하여 브레 그마에서 두개골 2mm 꼬리와 5mm 측면에 직접 해결되었습니다. 그 후, 상처 가장자리는 신중하게 뇌 저체온뿐만 아니라 감염을 방지하기 위해 적용되었다.
4. 마우스는 목의 복부 측면을 노출하는 정도가되었습니다. 광섬유 프로브는 프로브 어댑터 (, 팔라, 스웨덴 석사 프로브 418-1, PERIMED) 연결을 통해 LDF 장치 (PeriFLUX 시스템 5000 PERIMED, 팔라, 스웨덴)에 연결되었다.

코멘트 : 주위에 마우스를 돌리면서, 광섬유 프로브는 두개골에서 끊기는 것을 방지하기 위해주의 구부려해야합니다.

5. LDF 장치는 노트북 컴에 연결되어퓨터. LDF 값의 연속 녹화는 Windows (버전 2.50, 팔라, 스웨덴)에 대한 PeriSoft을 사용하여 시작되었다. 그림 1 BCCAO 및 재관류 동안 열 LDF 녹음에서 얻은 평균 CBF 과정을 보여줍니다.

4. 양측 경동맥 동맥 폐색

1. 3.1에 ​​설명 된대로 마취를 유지 하였다. 마우스의 뒷면에 배치되었다. 동물의 꼬리와 발은 접착 테이프를 사용하여 가열 패드에 고정되었다. 시상 복부 정중선 절개 (~ 1cm 길이)을 시행 하였다.
2. 두 salivatory 땀샘은 신중하게 분리하고 기본 CCA의를 시각화하기 위해 동원되었다.
3. 두 CCA의은 신중하게 이러한 구조를 해치지 않고 각각의 미주 신경과 동반 정맥에서 분리되었다. 미주 신경의 조작이 중요한 심장 한가지의 발생에 대한 가능성이 부교감 신경 시스템의 일시적 또는 영구적 장애로 이어질 수도hythmia 또는 돌이킬 수없는 심장 마비. 따라서 미주 신경의 조작을 방지하기 위해 중요합니다. 느슨한 5-0 실크 봉합사 루프는 각 CCA 주위에 만들어졌다.
4. 작은 실리콘 튜브 (직경 2mm)는 CCA와 각면에 실크 봉합사 사이에 삽입되었다. 이 튜브는 봉합 (그림 4) 강화되었을 때 동맥 벽의 손상을 방지하기 위해 CCA의의 부목으로 사용되었다.
5. 두 CCA의은 실크 봉합을 강화하여 한 분 동안 결찰 하였다. LDF 신호가 기준 신호의 <10 %로 감소 된 만 쥐가 연구에 포함되었다. 두 CCA의의 재개 후 5 분 재관류 기간이 시작되었습니다. LDF에 의해 완전한 재관류가 보장되었다. 완전 재관류 (기준 CBF에 비해 CBF 즉 <90 % 복구)를 가진 동물은 제외 하였다. BCCAO의 1 분 재관류 5 분의 순서는 총 BCCAO durati에 대해 두 번 반복3 분의합니다. 그림 1은 BCCAO 및 재관류 동안 열 LDF 녹음에서 얻은 평균 CBF 과정을 보여줍니다. 절차를 수행하는 동안, 그것은 목 생리 식염수를 사용하여 젖은 상처 유지하는 것이 좋습니다.
6. 최근 재관류 후 모든 배관 및 봉합뿐만 아니라 두개골에 부착 된 광섬유 프로브가 제거 된 상처는 봉합되었고, 리도카인 연고 (Xylocain 2 %, 아스트라 제네카 GmbH에, 베델, 독일)의 필요에 따라 반복적으로 상처에 적용 analgetic 관리.
7. 마우스가 예열로 옮겨졌다 (30 ° C) 복구 박스 (MediHEAT.는 영국 회사 브라우, 컴 브리아, PecoServives) 그들은 완전한 의식을 회복 할 때까지. 그 후, 마우스들은 동물의 케이지에 반환되었다.

5. 중간 대뇌 동맥 폐색

1. 쥐가 다시 마취, 직장 온도 프로브가 삽입 된 생쥐는 목의 복부 측면을 노출 가열 패드에 배치되었다. 그 후, 그들은 w감수는 BCCAO 절에 설명 수정.
2. 긴 7-0 실크 봉합사를 사용하여 영구 합자 좌측 근위부 CCA 주위에 만들어진 및 스레드 부드럽게 모기 클램프 (그림 4)를 사용하여 꼬리 쪽 당겨졌다.
3. 또 다른 영구 합자는 왼쪽 외부 경동맥 동맥 (ECA)와 실 (그림 4) 동물의 우측으로 당겨졌다 주위에 만들어졌다.
4. 왼쪽 ICA를 둘러싼 결합 조직은 신중하게 동원되고 설하 신경은 부드럽게 ICA의 원심 물론 좋은 개요를 얻을 해제되었다. 왼쪽으로 왼쪽 ICA 굴절 pterygopalatine 동맥 (PPA)이 오른쪽 (그림 4)에 근위부 ICA의 과정을 따라하면서.

코멘트 : 꼬리 방향으로 오른쪽으로 회전하는 식별 할 수있는 또 다른 동맥이 있습니다. 이 가변적 CCA의 분기점이나 홍보에서 어느 발생한 후두 동맥이며,ECA의 oximal 부분 (그림 4).

5. 느슨한 봉합 루프는 5-0 실크 실을 사용하여 근위부 ICA 주위에 만들어졌다.
6. 작은 미세 혈관 클램프 사용하여 ICA가 일시적으로 5-0 느슨하게 봉합 루프 (그림 4)에 원심 가려했다.
7. 작은 절개 단지 혈관 가위 (그림 4)를 사용하여 CCA의 분기점 전에 CCA의 원위부에서 만들어졌습니다.
8. 미리 선택된 실리콘으로 덮인 모노 필라멘트는 작은 절개를 통해 CCA에 도입 해 미세 혈관 클램프 (그림 4)에서 정지 할 때까지 ICA에 밀어되었다.
9. 는 (그림 4) 정지 할 때까지 모노 필라멘트는 ICA에 깊은 전진하는 동안 microclamp은 신중하게, ICA에서 제거되었습니다. 코멘트 : 당신은 펜처럼 보유하지 수 있도록이 시점에서, 왼손 집게를 플립. 이보다 쉽게​​ 집게로 필라멘트를 잡아하는 데 도움이됩니다.클램프 주걱 혈관이 오른쪽 손에 개최되어야한다. 그것은 거의 절개 측면에서 출혈을 방지하기 위해 ICA 주변의 느슨한 5-0 봉합사를 강화해야 할 수 있습니다.
10. 모노 필라멘트 끝의 정확한 위치는 ICA에되지 PPA로 이동 한 경우 확인하는 확인되었다. 모노 필라멘트 끝이 인접 PPA에 도입 된 경우, 필라멘트 부드럽게 그냥 ICA / PPA 분기 전에 철수했다. 그것은 부드럽게 오른쪽으로 근위부 ICA에게 조금 당기면서 다시 ICA에 모노 필라멘트 발전을 시도 하였다. 이렇게함으로써, 원위부 ICA의 자연적인 과정은 쉽게 ICA에 액세스하고 시뮬레이션 하였다.
11. 필라멘트가 거의 완전히 ICA에 진출 한 후, 근위부 ICA 주변의 느슨한 5-0 봉합사 루프가 제자리에 필라멘트를 개최하기 위해 강화되었다. 그 후, 모든 실크 스레드가 단축되었고, 피부에 상처 봉합 하였다.
12. 수술하는 동안 유체 손실은 replen되었다그것은 완전한 의식을 회복 할 때까지 이후 식염수의 IP 1.0 mL를 주입하여 모델로 인해, 마우스는 예열 복구 상자로 옮겨졌다.
13. 재관류를 들어, 마우스 재 마취되었고 모노 필라멘트주의 깊게 근위부 ICA 주위에 5-0 실크 봉합사를 풀어 후 제거 하였다. 그 후, 5-0 봉합사는 출혈을 방지하기 위해주의 깊게 다시 강화되었다.
14. 완전한 지혈 확인 후, 목에 상처 봉합 하였다.
15. 통증 완화를 위해 필요한 리도카인 연고가 반복적으로 피부에 로컬로 적용하고 완전한 의식을 회복 복구 상자까지 마우스는 미리 온수 (30 ° C)로 옮겨졌다.
16. 성공적인 MCAO 절차에 대한 첫 번째 힌트, 동물의 도는 방향이 관찰되었다대로. 기능 적자의 심각성은 쥐 ^10에 대한 수정 Bederson 점수를 사용하여 정량 하였다. 이 수정 Bederson 점수에 따라, 신경 스코어 우리0 (정상 운동 기능), 1 (마우스 꼬리 해제 된 몸통과 반대쪽 앞발의 굴곡), 2 (마우스는 평평한 표면에 꼬리 개최되었을 때 반대편에 돌고 있지만, 일반 : 다시 다음과 같이 등급 휴식 자세), 3 (나머지 반대편에 기대어), 4 (아무 자발적인 운동 활동 또는 사망).

6. BCCAO 위장 수술

BCCAO 가짜 절차는, 마우스가 진짜 BCCAO의 PC 절차의 기간 동안 마취 있었다, 타액 분비가 동원되었고, CCA의이 노출되었다. 그것은 경동맥이나 미주 신경에 직접 조작이 가짜 절차를 수행하는 동안 피할 것이 중요합니다. CCA의 조작은 내피 세포 또는 동맥 내강 내 지역 혈전증을 유발에서 혈관 활성 물질의 방출을 초래할 수있는 자사의 내피 층을 손상시킬 수 있습니다. 결과적으로, 혈전 색전증은 가짜 수술 후 발생할 수 있습니다. 이 일의 주요 교란 될 것이다E 절차를. 한편, 미주 신경의 조작이 중요한 심장 부정맥 또는 돌이킬 수없는 심장 마비의 발생에 대한 가능성이 부교감 신경 시스템의 일시적 또는 영구적 장애로 이어질 수 있습니다. 따라서 BCCAO 동안 미주 신경의 조작을 방지하기 위해 중요합니다.

수술 후 절차

7. 볼륨 측정 경색

경색 크기의 평가를 들어, 마우스 MCAO 후 72 시간 동안 살아 남았습니다. 그 후 동물이 깊은 마취, 뇌가 제거되었다 경색 부피 측정 헤 마톡 실린 (Papanicolau의 프로토콜을 사용하여)와, methylbutan 스냅인 냉동 절편과 스테인드. 뇌 섹션은 이미지 분석기 (MCID 코어 7.0 Rev.2.0에, GE 헬스 케어 나이아가라 Inc의)를 사용하여 결정 린 등의 방법에 따라 부종 수정 된 600 μm의 간격과 경색 볼륨에서 수집 하였다. ^7,11 을 먹다.

8. 선정 기준

우리는 세 가지 BCCAO 에피소드 각각의 기간 동안 90 % 이상 LDF-측정 CBF 감소했다 만 동물 포함되어 있습니다. 이상적으로, LDF 모니터링은 BCCAO 동안 두 대뇌 반구에서 수행해야합니다. 실용성을 위해, 우리는 나중에 MCAO의 대상이되는 왼쪽 반구에 LDF 모니터링을 수행 하였다. 이 방법은 ^6,12 전에 설명했습니다. 각 BCCAO 에피소드 후 재관류 (기본 값 즉, 귀국일) 완료해야했습니다. 기간 쥐가 마취를 유지 하였다 시간을 줄이는 이유로, 우리는 MCAO 수술 중에 CBF를 모니터하지 않았다. 그러나 동물의 별도의 그룹 파일럿 연구에서, 우리는 MCAO 수술 중에 LDF으로 CBF를 모니터링. 생쥐의이 그룹에, 우리는 지속적으로 CCA 폐색 전 기준에 비해 90 %로 CBF의 감소를 측정 하였다. 또한, 모노 필라멘트 CBF의 제거 후 각각의> 90 %로 회복CCA 폐쇄 후 초기 값을 표시합니다. 이 LDF 기준은 일관성 경색 볼륨 ^7의 문학과 결과에 설립되었습니다. 우리는 적어도 MCAO 후 마취에서 회복 후 1의 Bederson 점수를 가지고 동물을 포함되어 있습니다. 또한, MCAO 그리고 그 후 72 시간 동안 살아남은 유일한 동물은 두개 내 출혈의 흔적이 연구에 포함되지 않았다 보였다.

결과

두 CCA의 (그림 1) 폐색되었을 때 우리 BCCAO 프로토콜 (> 90 %) 즉각적이고 심오한 CBF의 감소의 결과. CCA의 재개는 LDF (그림 1)에 의해 모니터로 재관류를 완료했다있어. PC 후에, 동물은 기능 장애의 흔적을 보여 주었다. 또한, 아무 사망은 없었다. TUNEL 염색은 동물 별도의 그룹에 BCCAO 후 72 시간 수행이 BCCAO (데이터 표시되지 않음) 후 뇌의 지연 세포 죽음의 흔적을 보여 주었?...

토론

본 연구에서는, 우리는 BCCAO 세 시퀀스, 각각의 분 지속과 5 분 재관류 다음은, 서둘러을 유도하는 적절한 허혈성 PC 자극 것으로 나타났습니다.

또한, 우리는 사용 된 컨디셔닝 프로토콜이 더 주목할만한 수술 후 이환율과 함께 안전하고 사소한 침략 절차, 뇌 세포 사멸없이 사망의 흔적임을 증명하고있다. 여러 가지 컨디셔닝 프로토콜은 이전 ^6-7,12 설명하고있다. 기?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the instrument	Company	Catalogue number/model
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	SteREO CL 1500 ECO
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	David Kopf	Model 930
Scissors	FST	91460-11
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Mircovascular clamp	FST	00398-02
Clamp applicator	FST	00072-14
Springscissors	FST	15372-62
Needle holder	FST	12010-14
Needles	Feuerstein, Suprama	BER 562-20
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama