Двусторонние общей сонной артерии в качестве адекватного Предварительная Стимул для стимуляции раннего Ишемический Толерантность к очаговой ишемии головного мозга

Резюме

Там накапливаются доказательства, что ишемического прекондиционирования (PC) - неповреждающих ишемического вызов мозга - дает защиту от переходных процессов в последующий уничтожающий ишемического инсульта. Мы установили двусторонние общей сонной артерии (BCCAO) в качестве предварительной стимул, чтобы вызвать раннее ишемическая толерантность (ИТ) в переходных очаговой ишемии головного мозга (индуцированные окклюзии средней мозговой артерии, MCAO) в C57Bl6 / J мышей.

Аннотация

Там накапливаются доказательства, что ишемического прекондиционирования - неповреждающих ишемического вызов мозга - дает защиту от переходных процессов в последующий уничтожающий ишемического инсульта. Мы установили двусторонние общей сонной артерии в качестве предварительной стимул, чтобы вызвать раннее ишемическая толерантность к переходным очаговой ишемии головного мозга в C57Bl6 / J мышей. В этом видео мы покажем, методологию, используемую для данного исследования.

Введение

Ишемический инсульт является заболеванием с высокой смертностью и огромным социально-экономическим бременем ^1. Несмотря на интенсивные экспериментальные и клинические научные усилия в течение последних десятилетий, варианты лечения острого ишемического инсульта пациенты остаются очень ограниченными ^2. В отличие от этого, увеличение доли пожилых людей в развитых странах резко увеличит заболеваемость и распространенность пациентов с ишемическим инсультом в ближайшие десятилетия ^3. Таким образом, существует настоятельная необходимость в разработке новых стратегий лечения больных с ишемическим инсультом.

Один из подходов заключается, чтобы получить дальнейшее понимание механизмов эндогенной адаптации мозга, чтобы справиться с разрушительным стимул. Это полученного из головного мозга нейропротекции также известен как ишемического прекондиционирования (PC) или ишемический толерантности (ИТ) и описываются явления, в которых не причинен ущерб болевые раздражители применяются к мозгу, вызывает переходное сопротивлениепротив последующего ишемического повреждения ⁴ оскорбление. Это происходит в двух разных окнах время: рано, это, которое происходит в течение нескольких минут до нескольких часов после того, как ПК и ИТ задержкой, которая нуждается в латентности пару часов, происходят ^4.

До сих пор исследования по нему в мозг сосредоточился на ИТ отложено. Гораздо меньше известно о механизмах раннего ИТ. Цель данного исследования заключается в установлении двусторонних общих сонных артерий (BCCAO), который является признанным стимулом, чтобы вызвать задержку ИТ, как адекватный раздражитель, чтобы вызвать ПК рано, это переходный очаговой ишемии головного мозга (индуцированные окклюзии средней мозговой артерии, MCAO) В C57Bl6 / J мышей.

Во время обоих хирургических процедур (BCCAO и MCAO), мониторинг мозговой кровоток (МК) по лазерной доплеровской флоуметрии (ЛДФ) проводили.

BCCAO проводили в наркоз и спонтанном дыхании мышей. Оба общих сонных артерий (ОСА), подвергают воздействиюи окклюзии в течение 60 секунд, затем 5 мин реперфузии. Это BCCAO / реперфузии последовательность повторяют дважды. После операции, мыши быстро оправился и не проявлял никаких признаков функциональной недостаточности. Для того, чтобы исключить, что BCCAO протокол, описанный выше, не приводит к задержке гибель клеток в мозге, мы провели ТДТ-опосредованной дУТФ-биотин Ник конце маркировки (TUNEL) окрашивание 72 часа после BCCAO (или фиктивных операций) в отдельную группу.

MCAO является широко известной модели для индукции очаговой ишемии головного мозга у грызунов ^5-7. Хирургические процедуры проводили с использованием стандартных операционных процедур (СОП) ^8. После выдержки левой CCA, кремний покрытых моноволокно было введено в дистальном CCA, не продвинулись через внутреннюю сонную артерию (ICA) в Круг Уиллис до передней мозговой артерии (ПМА) и, таким образом, происхождение средней мозговой артерии ( MCA) пережимают в течение определенного периода времени. В данном исследовании мыиспользовали 45 мин MCAO, что обычно приводит к ишемическим поражением на территории MCA участием полосатого и областей коры мозга.

В нашем исследовании мы проанализировали временной профиль раннего использования ИТ BCCAO как PC стимул. Наши данные показали, что оптимальное время задержки между BCCAO и MCAO чтобы вызвать раннее Он находится в 30 мин.

В этом видео, мы дадим демонстрации как хирургические процедуры, то есть BCCAO и MCAO.

протокол

Все процедуры, описанные в этой статье, были проведены в соответствии с руководящими принципами и правилами Landesamt für Gesundheit унд Soziales, Берлин, Германия.

Предварительно хирургических процедур

1. Подготовка Лески

1. Для приготовления внутрипросветного нитей 8-0 нейлоновые швы были использованы и разрезали на отрезки длиной 13 мм каждый.
2. Для покрытия из мононитей, Xantopren M слизистой оболочки (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Germany) был использован активированный добавлением капли активатор раствор (активатор, Universal плюс, Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Germany).
3. Мононити медленно протягивается через силиконовые, пока он не был полностью покрыт с ним. Поступая таким образом, мононити будет равномерно покрыта силиконом. Не ждать слишком долго, потому активированный материал покрытия станет твердым и сухим быстро.
4. Перед силиконовой начинает затвердевать, Рекомендуется содрать чрезмерное силиконовые от нити, потянув ее на листе бумаги. Поступая таким образом, силиконовый слой может быть поредели с толщиной приблизительно 200 мкм.
5. Основание силиконовые покрытых мононити вонзился в пластилин для того, чтобы дать ему высохнуть в течение ночи.

Комментарий: В идеале, только стерилизовать или по крайней мере дезинфекции мононити должны быть использованы для обеспечения стерильности в операционном. На практике, стерилизации или дезинфекции ручной мононити очень трудно, потому что качество может ухудшиться мононити ^9. Таким образом, было бы предпочтительнее использовать коммерчески доступные стерильные вместо мононити.

2. Подготовка Хирургические инструменты и животные

1. Все хирургические инструменты были сохранены в 70% этиловом спирте. Кроме того, перед каждой новой хирургической процедуры, все хирургические инструменты были тщательно очищеный дезинфицировать 70% этилового спирта.
2. Хирургической области был тщательно продезинфицировать 70% этилового спирта у всех животных до перерезки. Дезинфицированная сайтов было разрешено полностью высушить перед выполнением разрезов. Дополнительные вырезку мех не был выполнен, так как это может привести к microabrasions и последующего воспаления кожи ^9.

Хирургические процедуры

3. Положение зонда и LDF LDF мониторинга

1. Для индукции анестезии, мыши подвергались воздействию газообразной смеси, содержащей 30% кислорода, 70% N ₂ O и 2,5% изофлуран использованием испарителя. Для поддержания анестезии, изофлуран концентрация была снижена до 1,5%. Мышей спонтанном дыхании через дыхательные маски всей хирургической процедуры.
2. Ректального датчика температуры была вставлена ​​и мышах были прикреплены к стереотаксической кадра подвергая теменной голову. Во время операции, мышам покоится натермостатом грелку, обеспечивая постоянную температуру ядра 37,0 ± 0,5 ° С. Сагиттальной срединный разрез (~ 1 см длиной) проводили подвергать теменной черепа.
3. На левой стороне черепа тщательно рассекали и волоконно-оптический зонд, установленный непосредственно на череп 2 мм каудально и 5 мм латерально от темени с помощью программы мгновенного клея. Затем края раны были тщательно адаптированы, чтобы избежать гипотермии мозга, а также инфекции.
4. Мышь повернулась, чтобы разоблачить брюшной стороне шеи. Волоконно-оптический зонд был подключен к устройству LDF (PeriFLUX System 5000, Perimed, Järfälla, Швеция) через соединительный Адаптер пробников (Master Probe 418-1, Perimed; Järfälla, Швеция).

Комментарий: При повороте мыши вокруг, волоконно-оптический зонд должен быть согнут с осторожностью, чтобы избежать, что она обрывается из черепа.

5. Устройство LDF было подключить к ноутбуку COMкомпьютер. Непрерывная запись ЛДФ значения был инициирован использованием PeriSoft для Windows (версия 2.50, Järfälla, Швеция). На рисунке 1 показано среднее конечно CBF получены от десяти записей LDF во BCCAO и реперфузии.

4. Двусторонние общей сонной артерии

1. Поддержание наркоза, как описано в разделе 3.1. Мышь помещали на спине. Хвост животного и лапы прикреплена к грелку с помощью клейкой ленты. Сагиттальной срединный разрез вентральной (~ 1 см длины) была выполнена.
2. Оба слюнных желез были тщательно отделить и мобилизовали для визуализации основных КСТР.
3. Оба ОСО были тщательно отделены от соответствующих блуждающие нервы и сопровождающих вен без ущерба для этих структур. Манипуляции блуждающего нервов может привести к временной или постоянной дисфункции парасимпатической нервной системы, которая имеет потенциал для возникновения значительной сердечной обрhythmia или даже необратимые остановки сердца. Поэтому, крайне важно, чтобы избежать любых манипуляций блуждающего нервов. Свободные 5-0 шелковых шва петля была сделана около каждого ОСО.
4. Труб малого кремния (диаметр 2 мм) был вставлен между ССА и шелковыми швами по бокам. Этот трубопровод был использован в качестве Шинирование CCA для того, чтобы избежать повреждения стенок артерий, когда швы были ужесточены (рис. 4).
5. Оба КСТР закупоривали в течение одной минуты, затянув шелковыми швами. Только мыши, в котором сигнал LDF был уменьшен до <10% от исходного сигнала, были включены в исследование. После возобновления как КСТР пять минут периода реперфузии была инициирована. По LDF полной реперфузии была обеспечена. Животные с неполной реперфузии (т.е. <90% восстановления CBF по сравнению с исходным CBF), были исключены. Последовательность одной минуты BCCAO и пять минут реперфузии повторяли дважды на общую BCCAO duratiна 3 мин. 1 приведены средние НБВ Конечно, полученных из десяти записи LDF во время BCCAO и реперфузии. Во время процедуры, рекомендуется держать шею наматываться увлажненными, получавшей физиологический раствор.
6. После последнего реперфузии, все трубки и швов, а также волоконно-оптического зонда прикреплен к черепу были удалены, раны зашивали и лидокаин мазь (Xylocain 2%; AstraZeneca GmbH, Wedel, Германия) многократно применяются к ранам, сколько необходимо для обезболивающим управления.
7. Мыши были переданы в предварительно нагретую (30 ° C) восстановление коробку (MediHEAT. PecoServives ООО Бро, Камбрия, Великобритания), пока они не восстановили полное сознание. Затем мышей возвращали в их клетки животного.

5. Окклюзии средней мозговой артерии

1. Мыши были вновь под наркозом, ректального датчика температуры была вставлена ​​и мышей были помещены на грелку, чтобы разоблачить брюшной стороне шеи. После этого они сопрежде чем фиксируется как описано в разделе BCCAO.
2. Постоянное лигатуры с помощью длинной 7-0 шелковых шва было сделано вокруг левого проксимального ОАС и нити осторожно вытащил каудально помощью комаров зажим (рис. 4).
3. Другой постоянный лигатуры было сделано вокруг левой наружной сонной артерии (ЕСА), и нить была разобрана к правой стороне животного (рис. 4).
4. Соединительная ткань, окружающая левой ВСА было тщательно мобилизованы и подъязычный нерв осторожно поднял, чтобы получить хороший обзор дистальной ход ICA. Левая изгибов ВСА влево в то время как крылонебную артерию (PPA) следует ходе проксимальных ICA вправо (рис. 4).

Комментарий: Существует еще одна артерия, которые будут определены которая поворачивает направо в каудальном направлении. Это затылочная артерия, которая берет свое начало переменно либо из бифуркации CCA или PRoximal часть ECA (рис. 4).

5. Свободную петлю шва было сделано около проксимальных ICA помощью 5-0 шелковой нитью.
6. С помощью небольшой микрососудистые зажим, ICA была временно окклюзии дистальнее 5-0 свободную петлю шва (рис. 4).
7. Небольшой разрез был сделан в дистальной части ОСО непосредственно перед использованием бифуркации ОСО микрососудистые ножницами (рис. 4).
8. В выбранной силиконовым покрытием мононити был введен в ОСО через небольшой разрез и толкнул в ICA, пока он не остановился на капиллярном зажим (рис. 4).
9. Microclamp была тщательно очищена от ICA, а леска была продвинулись в глубь ICA, пока он не остановился (рис. 4). Комментарий: На данный момент, переверните щипцами в левую руку так, что вы не держите его, как перо. Это помогает захватить нити пинцетом легче.Зажим-сосудистой аппликатора должна быть проведена в правой руке. Это может быть необходимо почти зафиксируйте все 5-0 шва вокруг ICA, чтобы предотвратить кровотечение из разреза стороны.
10. Точное местоположение мононити наконечник был идентифицирован, чтобы проверить, если она была выдвинута в ICA, а не в PPA. Если мононити наконечник был введен в проксимальных PPA, нить осторожно отстранился как раз перед ICA / PPA бифуркации. Была сделана попытка продвижения мононити в ICA снова, в то время осторожно потянув за проксимальных ICA немного на правую сторону. Поступая таким образом, естественный ход дистальной ICA была смоделирована облегчая доступ к ICA.
11. После того, как леска была выдвинута в ICA почти полностью, свободные 5-0 шва петлю вокруг проксимальных ICA затянулось, чтобы держать нить на месте. Впоследствии, все шелковые нити были укорочены, кожную рану зашивают.
12. Потери жидкости во время операции был replenбедных и обнищавших слоев путем инъекции 1,0 мл физиологического раствора внутрибрюшинно раствор Затем мышь была переведена в предварительно нагретой восстановление коробки, пока не восстановили полное сознание.
13. По реперфузионное, мыши были повторно анестезировали и мононити была удалена после тщательного ослабления 5-0 шелковой нити вокруг проксимальных ICA. После этого 5-0 шва затянулся еще раз внимательно, чтобы предотвратить кровотечение.
14. После подтверждения полный гемостаз, шее рану зашивали.
15. Лидокаин мазь повторно применять местно на кожу по мере необходимости для облегчения боли и мышь была переведена в предварительно нагретую (30 ° C) извлечение коробки, пока не восстановили полное сознание.
16. В качестве первой подсказки для успешного прохождения процедуры MCAO, часовой облет животных наблюдалось. Тяжесть функционального дефицита количественно, используя счет Бедерсон модифицированы для мышей ^10. По этому поводу модифицированных Бедерсон, неврологические оценки мыповторно оцениваются следующим образом: 0 (нормальная двигательная функция), 1 (сгибание туловища и контралатеральной передней конечности, когда мышь была снята за хвост), 2 (полет по кругу на противоположной стороне, когда мышь была проведена за хвост на плоской поверхности, но нормальные позы в состоянии покоя), 3 (опираясь на противоположной стороне в состоянии покоя), и 4 (Нет спонтанную двигательную активность или мертвый).

6. BCCAO Шам хирургии

Для BCCAO процедуры обман, мышей анестезировали в течение реального процедура ПК BCCAO, слюноотделение железы были мобилизованы и ОСО были подвержены. Очень важно, что прямые манипуляции с сонных артерий или блуждающего нервов избегать во время процедуры обман. Манипуляции с CCA может повредить его эндотелиальный слой, что может привести к выбросу вазоактивных веществ из эндотелия или вызывать локальный тромбоз внутри просвета артерии. Как следствие, тромбоэмболических событий может произойти после операции обман. Это будет основным вмешивающимся йэлектронной процедуре. С другой стороны, манипуляции с блуждающие нервы может привести к временной или постоянной дисфункции парасимпатической нервной системы, что может повлечь за собой возникновение значительных сердечной аритмии или даже необратимые остановки сердца. Поэтому, крайне важно, чтобы избежать любых манипуляций блуждающий нервы во время BCCAO.

После хирургических процедур

7. Измерения объема инфаркта

Для оценки размеров инфаркта, мыши выжили в течение 72 ч после МСАО. Затем животные были глубоко под наркозом, мозг удаляют, быстро замораживают в метилбутан, срезы и окрашивали гематоксилином (с использованием протокола по Папаниколау) для измерения объема инфаркта. Срезы головного мозга, были собраны в 600 мкм интервалы и объем инфаркта были определены с использованием анализатора изображени (MCID основной 7,0 Rev.2.0, GE Healthcare Ниагара Inc) с поправкой на отек в соответствии с методом Lin и др.. ^7,11 .

8. Критерии включения

Мы включены только животных, которые были LDF измеренных CBF снижение более чем на 90% в течение каждого из трех серий BCCAO. В идеале, LDF мониторинга должны выполняться в обоих полушарий головного мозга во время BCCAO. Для практичности, мы провели мониторинг LDF только в левом полушарии, которое будет подвергаться MCAO позже. Этот подход был описан до ^6,12. Реперфузии после каждого эпизода BCCAO был, должно быть полным (то есть возвращение к исходным значениям). В целях сокращения времени продолжительности мыши содержались под наркозом, мы не контролировали CBF MCAO во время операции. В пилотном исследовании с отдельной группой животных однако, мы провели мониторинг по CBF LDF MCAO во время операции. В этой группе мышей мы последовательно измеренных снижение церебрального кровотока на 90% по сравнению с исходным до CCA окклюзии. Кроме того, после удаления из мононитей CBF восстановились до> 90% от соответствующейисходных после ОСО окклюзии. Эти LDF критериев, установленных в литературе и в результате последовательной объема инфаркта ^7. Мы включены только животных, которые имели показатель Бедерсон по крайней мере из 1 после выхода из наркоза после MCAO. Кроме того, только животных, которые выжили в течение 72 ч после MCAO и который проявлял никаких признаков внутричерепного кровоизлияния не были включены в исследование.

Результаты

Наши BCCAO протокола привели к немедленной и глубокие (> 90%) сокращение CBF, когда оба были ОСО окклюзии (рис. 1). Возобновление КСТР привела к полной реперфузии как контролируется LDF (рис. 1). После ПК, животные не проявлял никаких признаков функциональной инвалидности. Кром?...

Обсуждение

В нашем исследовании мы показали, что три последовательности BCCAO, каждая из которых длится в течение одной минуты и последующей реперфузии в течение пяти минут, являются адекватным ишемического стимула PC, чтобы вызвать раннее ИТ.

Кроме того, мы показали, что предваритель...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the instrument	Company	Catalogue number/model
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	SteREO CL 1500 ECO
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	David Kopf	Model 930
Scissors	FST	91460-11
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Mircovascular clamp	FST	00398-02
Clamp applicator	FST	00072-14
Springscissors	FST	15372-62
Needle holder	FST	12010-14
Needles	Feuerstein, Suprama	BER 562-20
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama