Bilaterale occlusione comune Arteria carotide come uno stimolo precondizionamento in grado di indurre tolleranza ischemica precoce di focale Ischemia Cerebrale

Riepilogo

Esistono evidenze, che il precondizionamento ischemico (PC) - una sfida ischemica non-dannoso per il cervello - conferisce una protezione transitoria a un successivo insulto ischemico dannoso. Abbiamo stabilito bilaterale dell'arteria carotide comune occlusione (BCCAO) come stimolo di precondizionamento per indurre la tolleranza ischemica precoce (IT) di ischemia cerebrale focale transitoria (indotta da occlusione dell'arteria cerebrale, MCAO) in C57Bl6 / J topi.

Abstract

Esistono evidenze, che precondizionamento ischemico - una sfida ischemica non-dannoso per il cervello - conferisce una protezione transitoria a un successivo insulto ischemico dannoso. Abbiamo stabilito bilaterale comune occlusione dell'arteria carotide come stimolo di precondizionamento di indurre presto la tolleranza ischemica di ischemia cerebrale focale transitoria C57Bl6 / J topi. In questo video, dimostreremo la metodologia utilizzata per questo studio.

Introduzione

L'ictus ischemico è una malattia con un alto tasso di mortalità e di un enorme peso socio-economico ^1. Nonostante gli intensi sforzi scientifici sperimentali e clinici nel corso degli ultimi decenni, le opzioni di trattamento per i pazienti con ictus ischemico acuto rimane molto limitato ^2. In contrasto a ciò, aumento della percentuale di persone anziane nei paesi sviluppati aumenterà drasticamente incidenza e prevalenza di pazienti con ictus ischemico nei prossimi decenni ^3. Pertanto, vi è un urgente bisogno di nuove strategie di trattamento nei pazienti con ictus ischemico.

Un approccio è di guadagnare ulteriore comprensione nei meccanismi di adattamento endogena del cervello per far fronte a uno stimolo dannoso. Questo neuroprotezione brain-derived è anche noto come precondizionamento ischemico (PC) o la tolleranza ischemica (IT) e descrive un fenomeno, in cui uno stimolo nocivo non dannoso applicato al cervello, induce una resistenza transitoriacontro una successiva dannosa insulto ischemico ^4. Essa si verifica in due diverse finestre temporali: primi IT, che si verifica in pochi minuti a qualche ora dopo PC e ritardate IT, che ha bisogno di una latenza di un paio d'ore a verificarsi ^4.

Finora, la ricerca su di essa nel cervello si è concentrata sulla ritardata IT. Molto meno si sa sui meccanismi della precoce IT. L'obiettivo di questo studio è di stabilire bilaterale dell'arteria carotide comune occlusione (BCCAO), che è uno stimolo istituito per indurla ritardo, come un adeguato stimolo PC di indurre presto IT di ischemia cerebrale focale transitoria (indotta da occlusione dell'arteria cerebrale media, MCAO) in C57BL6 topi / J.

Durante entrambe le procedure chirurgiche (BCCAO e MCAO), è stato eseguito il monitoraggio del flusso sanguigno cerebrale (CBF) mediante flussimetria laser Doppler (LDF).

BCCAO è stata eseguita in topi anestetizzati e in respiro spontaneo. Entrambe le arterie carotidi comuni (CCA) sono stati espostie occluse per 60 secondi seguiti da 5 minuti di riperfusione. Questo BCCAO sequenza / riperfusione è stata ripetuta due volte. Dopo l'intervento chirurgico, i topi recuperato velocemente e non hanno mostrato segni di compromissione funzionale. Al fine di escludere, che il protocollo BCCAO sopra descritto non ha provocato la morte cellulare ritardata nel cervello, abbiamo effettuato una dUTP-biotina nick etichettatura fine TdT-mediated (TUNEL) colorazione 72 ore dopo BCCAO (o ambulatorio finto) in un gruppo separato.

MCAO è un modello ampiamente stabilito per l'induzione di ischemia cerebrale focale in roditori ^5-7. Le procedure chirurgiche sono state effettuate utilizzando procedure operative standard (SOP) ^8. Dopo aver esposto sinistra CCA, un monofilamento di silicio ricoperto stato introdotto nel CCA distale, avanzato attraverso l'arteria carotide interna (ICA) nel circolo di Willis fino cerebrale anteriore (ACA) e quindi, l'origine della arteria cerebrale media ( MCA) è stato occluso per un periodo di tempo definito. In questo studio abbiamousato 45 min di MCAO, che in genere si traduce in una lesione ischemica nel territorio MCA coinvolge aree cerebrali striatali e corticali.

Nel nostro studio, abbiamo analizzato il profilo temporale dei primi IT utilizzando BCCAO come stimolo PC. I nostri dati indicano che l'intervallo di tempo ottimale tra BCCAO e MCAO di indurre presto IT è 30 min.

In questo video, vi daremo una dimostrazione di entrambe le procedure chirurgiche, cioè BCCAO e MCAO.

Protocollo

Tutte le procedure descritte in questo articolo sono stati eseguiti in conformità con le linee guida ei regolamenti del Landesamt für Gesundheit und Soziales, Berlino, Germania.

Procedure di pre-chirurgiche

1. Preparazione del Monofili

1. Per la preparazione di filamenti intraluminale, nylon monofilamento 8-0 sono stati utilizzati e sono state tagliate ad una lunghezza di 13 mm ciascuna.
2. Per il rivestimento dei monofilamenti, Xantopren M mucosa, (Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Germania) è stato utilizzato attivato con l'aggiunta di una goccia di soluzione di attivatore (Activator, Universal plus, Heraeus Kulzer GmbH, Hanau, Germania).
3. Il monofilamento è stato lentamente tirato attraverso il silicone finché fu completamente coperto con esso. Così facendo, il monofilamento sarebbe uniformemente coperto con silicone. Evitate di aspettare troppo a lungo, perché il materiale di rivestimento attivato diventerà ferma e si asciugano rapidamente.
4. Prima che il silicone inizia a solidificare, Si raccomanda di togliere silicone eccessivo dal filamento tirandola sopra un foglio di carta. In questo modo, lo strato di silicone può essere assottigliato ad uno spessore approssimativo di 200 um.
5. La base del monofilamento di silicone coperto è stato bloccato in plastilina per lasciarlo asciugare durante la notte.

Commento: Idealmente, solo sterilizzati o almeno dovrebbero essere usati monofilamenti disinfettati per garantire la sterilità nel sito chirurgico. In pratica, sterilizzazione o disinfezione dei monofilamenti fatte a mano è molto difficile perché la qualità dei monofilamenti può peggiorare ^9. Pertanto, potrebbe essere preferibile utilizzare comuni monofilamenti sterili invece.

2. Preparazione di strumenti chirurgici e degli Animali

1. Tutti gli strumenti chirurgici sono stati conservati in alcool etilico al 70%. Inoltre, prima di ogni nuova procedura chirurgica, tutti gli strumenti chirurgici sono stati accuratamente puliti unaND disinfettato con alcool etilico al 70%.
2. L'area chirurgica è stata completamente disinfettato con alcool etilico al 70% in tutti gli animali prima della resezione. I siti disinfettati stato permesso di asciugare completamente prima di eseguire le incisioni. Ulteriori ritaglio di pelliccia non è stato eseguito in quanto ciò potrebbe causare microabrasioni e conseguente infiammazione della pelle ^9.

Le procedure chirurgiche

3. Posizionamento della sonda LDF e LDF monitoraggio

1. Per l'induzione di anestesia, topi sono stati esposti ad una miscela gassosa costituita da 30% di ossigeno, 70% N ₂ O e 2,5% isoflurano utilizzando un vaporizzatore. Per il mantenimento dell'anestesia, concentrazione isoflurano è stata ridotta a 1,5%. I topi sono stati respiro spontaneo con maschera di respirazione durante tutta la procedura chirurgica.
2. Una sonda di temperatura rettale è stata inserita e topi sono stati fissati al telaio stereotassico esponendo la testa parietale. Durante l'intervento chirurgico, i topi sono stati appoggiati su untermostato controllato rilievo di riscaldamento, garantendo una temperatura costante di 37,0 ± 0,5 ° C. Una incisione mediana sagittale (~ 1 cm di lunghezza) è stata eseguita per esporre il cranio parietale.
3. Il lato sinistro del cranio è stato dissezionato e accuratamente una sonda a fibre ottiche è stato fissato direttamente al cranio caudale 2 millimetri e 5 millimetri laterale dal bregma usando colla istantanea. In seguito, i bordi della ferita sono stati attentamente adattate per evitare l'ipotermia cerebrale così come le infezioni.
4. Il mouse è stato girato per esporre il lato ventrale del collo. La sonda a fibre ottiche è stata collegata al dispositivo LDF (PeriFlux System 5000, Perimed, Järfälla, Sweden) tramite adattatore di connessione per sonda (Master Probe 418-1, Perimed; Järfälla, Svezia).

Commento: Ruotando il mouse intorno, la sonda a fibre ottiche deve essere piegato con cura per evitare che esso si stacca dal cranio.

5. Il dispositivo LDF è stato collegato ad un com computer portatilecomputer. Registrazione continua di valori LDF è stato avviato utilizzando PeriSoft per Windows (versione 2.50, Järfälla, Svezia). Figura 1 dimostra il corso CBF medio ottenuto dieci registrazioni LDF durante BCCAO e riperfusione.

4. Bilaterale carotide comune di occlusione dell'arteria

1. L'anestesia è stata mantenuta come descritto in 3.1. Mouse è stato posto sulla sua schiena. Coda e le zampe dell'animale sono stati fissati per il rilievo di riscaldamento con del nastro adesivo. È stata eseguita una incisione mediana sagittale ventrale (~ 1 centimetro di lunghezza).
2. Entrambe le ghiandole salivatory stati accuratamente separati e mobilitati per visualizzare il sottostante del CCA.
3. Entrambi CCA di stati accuratamente separati dai rispettivi nervi vagali e vene di accompagnamento senza danneggiare queste strutture. Manipolazioni dei nervi vagali potrebbero portare a disfunzioni transitoria o permanente del sistema nervoso parasimpatico, che ha il potenziale per il verificarsi di significative arr cardiacohythmia o addirittura irreversibili arresto cardiaco. Pertanto, è fondamentale per evitare eventuali manipolazioni dei nervi vagali. Un sciolto 5-0 ciclo sutura di seta è stata fatta intorno ad ogni CCA.
4. Un piccolo tubo in silicone (diametro 2 mm) è stato inserito tra il CCA e le suture di seta su ogni lato. Questo tubo è stato utilizzato come splintaggio del CCA di onde evitare danneggiamento delle pareti arteriose quando sono stati serrati le suture (Figura 4).
5. Entrambi CCA è erano occluse per un minuto stringendo le suture di seta. Solo i topi, in cui il segnale LDF è stato ridotto a <10% del segnale di base sono stati inclusi nello studio. Dopo la riapertura di entrambi CCA di, è stato avviato un periodo di cinque minuti di riperfusione. Con LDF è stata assicurata una riperfusione completa. Sono stati esclusi gli animali con riperfusione incomplete (ovvero <90% di recupero di CBF rispetto al basale CBF). La sequenza di un minuto di BCCAO e cinque minuti di riperfusione è stata ripetuta due volte per un totale BCCAO duratisu di 3 min. Figura 1 mostra il corso CBF medio ottenuto dieci registrazioni LDF durante BCCAO e riperfusione. Durante la procedura, si raccomanda di mantenere il collo ferita umido mediante soluzione fisiologica.
6. Dopo l'ultimo riperfusione, tutti i tubi e suture ed anche la sonda a fibre ottiche attaccato al cranio sono stati rimossi, le ferite sono state suturate e lidocaina pomata (xylocaina 2%; AstraZeneca GmbH, Wedel, Germania) è stato ripetutamente applicati alle ferite come necessario per gestione analgesico.
7. I topi sono stati trasferiti in un pre-riscaldato (30 ° C) scatola di recupero (MediHEAT. PecoServives Ltd. Brough, Cumbria, Regno Unito) fino a che non aveva ripreso conoscenza completa. Successivamente, i topi sono stati restituiti alle loro gabbie per animali.

5. Occlusione dell'arteria cerebrale media

1. I topi sono stati ri-anestetizzato, una sonda di temperatura rettale è stato inserito e topi sono stati posizionati su una piastra elettrica per esporre il lato ventrale del collo. Successivamente, essi were fissato come descritto nella sezione BCCAO.
2. Una legatura permanente utilizzando una lunga sutura di seta 7-0 è stata fatta intorno sinistra prossimale CCA ed il filo è stato delicatamente tirato caudalmente utilizzando un morsetto zanzara (Figura 4).
3. Un'altra legatura permanente è stata fatta intorno carotide esterna sinistra (ECA) e il filo è stato tirato verso il lato destro dell'animale (Figura 4).
4. Il tessuto connettivo che circonda l'ICA sinistra è stata attentamente mobilitato e il nervo ipoglosso è stato delicatamente sollevato per avere una buona visione del corso distale ICA. L'ACI si piega a sinistra a sinistra, mentre l'arteria pterigopalatino (PPA), segue il corso del prossimale ICA a destra (Figura 4).

Commento: C'è un'altra arteria da identificare che si gira a destra in direzione caudale. Questa è l'arteria occipitale, che proviene variabile sia dalla biforcazione CCA o dalla proximal parte della Corte dei conti (Figura 4).

5. Un ciclo di sutura sciolto è stato fatto tutto il prossimale ICA utilizzando un filo di seta 5-0.
6. Usando una piccola pinza microvascolare, l'ICA è stato temporaneamente occlusa distalmente alla 5-0 allentato anello di sutura (Figura 4).
7. Una piccola incisione è stata fatta nella parte distale del CCA appena prima della biforcazione CCA usando forbici microvascolari (Figura 4).
8. Un preselezionata monofilamento silicone rivestito è stato introdotto nel CCA attraverso la piccola incisione e spinto nella ICA finché fermato al morsetto microvascolare (Figura 4).
9. Il microclamp stato accuratamente rimosso dalla ICA, mentre il monofilamento è stata avanzata più profondo nella ICA finché si è fermato (Figura 4). Commento: A questo punto, capovolgere la pinza nella mano sinistra in modo che non lo si tiene come una penna. Questo aiuta ad afferrare il filamento con la pinza più facilmente.La pinza vascolare-applicatore dovrebbero tenersi nella mano destra. Potrebbe essere necessario quasi stringere il allentata 5-0 sutura intorno alla ICA per impedire il sanguinamento dal lato incisione.
10. La posizione esatta della punta monofilo è stato identificato per verificare se è stata avanzata in ICA e non nel PPA. Se la punta monofilamento è stato introdotto nel prossimale PPA, il filamento è stato gentilmente tirato indietro appena prima della biforcazione ICA / PPA. Si è tentato di far avanzare il monofilo nella ICA di nuovo, mentre si tira delicatamente il prossimale ICA un po 'verso il lato destro. In questo modo, il corso naturale del distale della ICA è stato simulato rendendo più facile l'accesso alla ICA.
11. Dopo che il monofilo è stata avanzata nella ICA quasi completamente, a piede libero 5-0 sutura anello intorno alla prossimale ICA è stato rafforzato al fine di tenere il filo in posizione. In seguito, tutti i fili di seta sono stati accorciati e la ferita è stata suturata la pelle.
12. La perdita di liquidi durante l'intervento chirurgico è stato ricostitumentata iniettando 1,0 ml di una normale soluzione salina ip Successivamente, il topo è stato trasferito alla casella recupero preriscaldata fino ripreso conoscenza completa.
13. Per riperfusione, i topi sono stati ri-anestetizzati e il monofilo è stato rimosso dopo allentando la sutura 5-0 di seta intorno al prossimale ICA. Successivamente, la sutura 5-0 venne nuovamente serrato con attenzione per evitare il sanguinamento.
14. Dopo la conferma della completa emostasi, la ferita al collo è stata suturata.
15. Lidocaina unguento è stato ripetutamente applicato localmente sulla pelle come necessario per alleviare il dolore e il topo è stato trasferito alla pre-riscaldato (30 ° C) fino a che il recupero scatola riprese conoscenza completa.
16. Come è stato osservato una prima traccia per il procedimento MCAO successo, un orario circuitazione dell'animale. La gravità del deficit funzionale è stata quantificata utilizzando il punteggio Bederson modificato per topi ^10. Secondo questa Bederson punteggio modificato, punteggi neurologici noire classificati come segue: 0 (normale funzione motoria), 1 (flessione del tronco e degli arti anteriori controlaterale quando il mouse è stato sollevato per la coda), 2 (girando verso il lato controlaterale quando il mouse si è tenuta per la coda su una superficie piana, ma normale postura a riposo), 3 (appoggiandosi al lato controlaterale a riposo), e 4 (nessuna attività motoria spontanea o morti).

6. BCCAO Sham Chirurgia

Per BCCAO procedure sham, i topi sono stati anestetizzati per la durata di un vero e proprio procedimento PC BCCAO, le ghiandole salivazione sono stati mobilitati e il CCA di stati esposti. E 'fondamentale che le manipolazioni diretti alle arterie carotidi o nervi vagali sono evitati durante la procedura simulata. Manipolazioni del CCA possono danneggiare lo strato endoteliale, che può risultare in un rilascio di sostanze vasoattive da endotelio o indurre trombosi locale all'interno del lume arterioso. Come conseguenza, eventi tromboembolici potrebbero essere successiva ambulatorio finto. Questo sarebbe un importante fattore confondente di secoloprocedura e. D'altra parte, manipolazioni dei nervi vagali potrebbero portare a disfunzioni transitoria o permanente del sistema nervoso parasimpatico, che ha il potenziale per il verificarsi di aritmia cardiaca significativa o addirittura irreversibili arresto cardiaco. Pertanto, è fondamentale per evitare eventuali manipolazioni dei nervi vagali durante BCCAO.

Procedure di post-chirurgiche

7. Infarto misurazioni del volume

Per la valutazione delle dimensioni infarto, i topi sono sopravvissuti per 72 ore dopo MCAO. Successivamente gli animali sono stati anestetizzati profondamente, i cervelli sono stati rimossi, snap-frozen in metilbutan, sezionati e colorati con ematossilina (utilizzando il protocollo di Papanicolau) per misure di volume di infarto. Sezioni di cervello sono stati raccolti a 600 micron di intervalli e volumi infarto furono determinate mediante un analizzatore di immagini (MCID nucleo 7.0 Rev.2.0, GE Healthcare Niagara Inc) e corretta per l'edema secondo il metodo di Lin et al. ^7,11 .

8. Criteri di inclusione

Sono stati inclusi solo gli animali che hanno avuto un LDF-misurato CBF riduzione di oltre il 90% in ciascuno dei tre episodi BCCAO. Idealmente, il monitoraggio LDF dovrebbe essere eseguita in entrambi gli emisferi cerebrali durante BCCAO. Per praticità, abbiamo eseguito il monitoraggio LDF solo negli emisferi sinistro, che sarà sottoposto alla MCAO seguito. Questo approccio è stato descritto prima ^6,12. Riperfusione dopo ogni episodio BCCAO è stato richiesto di essere completa (cioè di ritorno ai valori basali). Per ragioni di riduzione dei tempi di durata topi sono stati tenuti sotto anestesia, non abbiamo monitoriamo CBF durante l'intervento MCAO. In uno studio pilota con un gruppo separato di animali tuttavia, abbiamo monitorato CBF da LDF MCAO durante la chirurgia. In questo gruppo di topi, abbiamo costantemente misurato una riduzione CBF del 90% rispetto al basale prima CCA occlusione. Inoltre, dopo la rimozione dei monofilamenti CBF recuperato al> 90% del rispettivovalori basali dopo circa occlusione. Questi criteri LDF sono stabiliti nella letteratura e causare consistenti volumi di infarto ^7. Sono stati inclusi solo gli animali che hanno avuto un punteggio Bederson di almeno di 1 dopo il recupero dall'anestesia dopo MCAO. Inoltre, solo gli animali che sono sopravvissuti per 72 ore dopo MCAO e che non hanno mostrato segni di emorragia intracranica sono stati inclusi nello studio.

Risultati

Il nostro protocollo BCCAO provocato immediato e profondo (> 90%) riduzioni CBF quando entrambi erano occluse del CCA (Figura 1). Riapertura del CCA LED per completare riperfusione come monitorato da LDF (Figura 1). Dopo PC, gli animali non hanno mostrato segni di disabilità funzionale. Inoltre, non vi era alcuna mortalità. Colorazione TUNEL eseguita 72 ore dopo BCCAO in un gruppo separato di animali non hanno mostrato segni di morte cellulare ritardata nel cervello dopo BCCAO (dat...

Discussione

Nel nostro studio, abbiamo dimostrato che tre sequenze di BCCAO, ciascuno della durata di un minuto e seguita da riperfusione per cinque minuti, sono un adeguato stimolo PC ischemico di indurre presto IT.

Inoltre, abbiamo dimostrato che il protocollo utilizzato precondizionamento è una procedura invasiva sicura e minori senza notevole morbilità postoperatoria, senza segni di apoptosi in cervello e nessuna mortalità. Diversi protocolli di precondizionamento diversi sono stati descritti pre...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of the instrument	Company	Catalogue number/model
Binocular surgical microscope	Zeiss	Stemi 2000 C
Light source for microscope	Zeiss	SteREO CL 1500 ECO
Heating pad with rectal probe	FST	21061-10
Stereotactic frame	David Kopf	Model 930
Scissors	FST	91460-11
Dumont forceps #5	FST	11251-10
Dumont forceps #7	FST	11271-30
Mircovascular clamp	FST	00398-02
Clamp applicator	FST	00072-14
Springscissors	FST	15372-62
Needle holder	FST	12010-14
Needles	Feuerstein, Suprama	BER 562-20
5-0 silk suture	Feuerstein, Suprama
7-0 silk suture	Feuerstein,Suprama
8-0 silk suture	Feuerstein, Suprama