Cryosectioning קהילות שמרים לבחינת דפוסי פלואורסצנטי

Babak Momeni; Wenying Shou

doi:10.3791/50101

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Summary

אנו מציגים פרוטוקול להקפאה וcryosectioning קהילות שמרים להתבונן דפוסים הפנימיים של תאי ניאון. השיטה מסתמכת על מתנול, תיקון ואוקטובר הטבעה-לשמר את הפיזור המרחבי של תאים ללא inactivating חלבוני ניאון בתוך קהילה.

Abstract

חיידקים בדרך כלל לגור ביישובים. הארגון המרחבי של תאים בתוך קהילה הוא האמין כדי להשפיע על ההישרדות והתפקוד של הקהילה ^1. שיטות אופטיות, כולל חתך מיקרוסקופיה confocal ושני פוטונים, הוכיחו שימושיות להתבוננות ארגון המרחבי של קהילות חיידקים וarchaeal ^2,3. שילוב של הדמית confocal וחתך פיזי של מושבות שמרים חשף ארגון הפנימי של תאים ^4. עם זאת, חתך אופטי ישיר באמצעות מיקרוסקופיה confocal או שני פוטונים הצליח רק להגיע לכמה שכבות תאים עמוקים לתוך מושבות שמרים. מגבלה זו עשויה בגלל פיזור אור חזק מתאי שמרים ^4.

כאן, אנו מציגים שיטה המבוססת על התיקון וcryosectioning להשיג פיזור המרחבי של תאי ניאון בתוך קהילות cerevisiae Saccharomyces. אנו משתמשים במתנול כסוכן מקבעכדי לשמר את הפריסה המרחבית של תאים. קהילות קבועות הם הסתננו עם מתחם אוקטובר, קפוא, וcryosectioned בcryostat. דימות פלואורסצנטי מהסעיפים חושפת את הארגון הפנימי של תאי ניאון בקהילה.

דוגמאות לקהילות שמרים הכוללות זנים המבטאים חלבוני ניאון אדומים וירוקים מדגימות את הפוטנציאל של שיטת cryosectioning כדי לחשוף את הפיזור המרחבי של תאי ניאון כמו גם זה של ביטוי גנים במושבות שמרים ^2,3. למרות ההתמקדות שלנו הייתה בקהילות cerevisiae Saccharomyces, באותה השיטה יכולה באופן פוטנציאלי להיות מיושמת לבחון קהילות חיידקים אחרות.

Protocol

1. תיקון קהילות שמרים

לגדול קהילות שמרים על קרום מסנן (למשל, Millipore MF קרום מסנן; 2A איור). פרוטוקול זה מתאים לקהילה טיפוסית של פחות מ 2x10 ⁸ תאים במסנן 6 מ"מ בקוטר הממברנה.
השתמש בפיסת נייר סינון Whatman 541 כדי לכסות את תחתית סנטימטר בקוטר 1 היטב (איור 2 ב '). נייר Whatman זה ישמש כנישא להעברת הקהילה בשלבים מאוחר יותר. הוסף 1 המ"ל מתנול 100% לטובים, ולהשאיר גם ב-20 ° C לטמפרטורה לאזן.
שים נוזל N ₂ בדיואר. הקפא קהילה בחנקן נוזלי על ידי טבילת הקהילה במשך לפחות 15 שניות בנוזל N ₂ באמצעות פינצטה (האיור 2C).
להעביר את הקהילה קפוא לטוב של מתנול -20 מעלות צלזיוס (האיור 2D). להבטיח שהקהילה נשמרת אופקי כאשר השקיע אותה במתנול.חכה 20 דקות. MF קרום המסנן מתחיל להתפורר במתנול.
להעביר את הקהילה באמצעות מוביל נייר סינון Whatman 541 ממתנול גם לצלחת פטרי קרה כל זמן ב -20 ° C לאידוי מתנול (2E איור). בעת ההעברה, לשמור על הקהילה על גבי מנשא Whatman מסנן ולהתרחק טיפין נוספות של מתנול באמצעות פיסת נייר אחר Whatman עבה לפני לשים בצלחת פטרי הקרה. זה יבטיח כי זמן האידוי הוא עקבי ממדגם למדגם.
חכה 4-6 שעות עד לאידוי מנשא Whatman המסנן נראה יבש. האידוי משאיר מספיק מתנול שיורים אשר מפריע לחתך. במהלך ייבוש סדקים ועיוות גורמת בקהילות.
קח דוגמה מ-20 ° C במקפיא. לחתוך נייר סינון Whatman 541 אינן מכוסה על ידי קהילה.
הפוך מכל מעוקב מלבני אלומיניום רדיד שהוא גדול מספיק כך שהמדגם יש לפחות ~ שולי מ"מ 2 מכל צד (האיור 2F). הנח את הקהילה על המשטח התחתון של מכל אלומיניום הרדיד; לכסות את המדגם עם אוקטובר עד 3 ~ 4 מ"מ מעל גובה הקהילה באופן מיידי. אם חשוב, הנטייה של המדגם יכולה להיות מותאמת בשלב זה בכל הנוגע לצדדים של המכל. חכה 10 דקות.
הנח את דוגמא אוקטובר-מוטבע על צלחת מתכתית בקרח יבש להקפאה. אחסן את הקהילות קפואות ב -20 ° C או C ° מקפיא -80.

2. קטגוריות קיימים קהילות קפואות לדימות פלואורסצנטי

הגדר את הטמפרטורה של חדר cryosection ל-25 ° C ולהשאיר את הדגימות בחדר עד שהטמפרטורה שלו מגיעה לטמפרטורה של החדר.
הר המדגם על cryo-Mount לאחר החלת ירידה של אוקטובר בהר. מורח אוקטובר אחיד בצד של מדגם בנייר נחשף Whatman מסנן (חלק תחתון של המכל) כך שעובי אוקטובר הוא 2-3 מ"מ. בואו הקפאת אוקטובר בתוך חדר cryostat לפני sectioning. הבטחת רווחיות אוקטובר של 2-3 מ"מ על כל הצדדים של המדגם עוזרת לשמור על שלמות חלקים.
הדפנות של בלוק מדגם אוקטובר ניתן להשתמש כדי ליישר את המדגם. אם המדגם אינו מיושר ביחס ללהב, חתך יתחיל מפינה או בצד של המדגם. התאם את ההר כדי להבטיח שהלהב חותך להפליא את פנים אנכיות (או אופקי) של גוש המדגם.
חלקים אופייניים עבור קהילות שמרים הם ~ 14 מיקרומטר בעובי. לאחר חיתוך מקטע, להשתמש שקופית מיקרוסקופ נשמר בטמפרטורת חדר כדי לאסוף את הסעיף, על ידי התקרבות לשקופית לאט לסעיף הקיצוץ. הסעיף יתמוסס ולהעביר לשקופית מיקרוסקופ. עד 18 סעיפים ניתן להעביר על גבי שקופית אחת.
אחסן את השקופיות בטמפרטורות קרות, רצוי -20 ° C, לפני ההדמיה. אובדן האות הוא מינימאלי כאשר שמרו במשך שבוע אחד ב 4 ° C. לאות פלואורסצנציה מרבית, הדמיה נעשתה רצוי מייד לאחר החתך.