Floresans Desenler incelenmesi için Maya Toplulukları Cryosectioning

Babak Momeni; Wenying Shou

doi:10.3791/50101

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

Özet
Özet
Protokol
Sonuçlar
Tartışmalar
Açıklamalar
Teşekkürler
Malzemeler
Referanslar
Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

Biz floresan hücrelerin iç kalıplarını gözlemlemek maya topluluklar donma ve cryosectioning için bir protokol mevcut. Yöntem metanol-sabitleme dayalıdır ve bir topluluk içinde floresan proteinleri inaktive olmadan hücrelerinin mekansal dağılımını korumak için OCT-katıştırma.

Özet

Mikroplar genellikle topluluklar yaşıyor. Bir topluluk içinde hücrelerin mekansal organizasyon topluluğu ¹ hayatta kalma ve fonksiyon etkisi olduğuna inanılmaktadır. Konfokal ve iki foton mikroskopi dahil Optik kesit teknikleri, bakteri ve arke topluluklarının ^2,3 mekansal organizasyon gözlemlemek için yararlı olduğu kanıtlanmıştır. Konfokal görüntüleme ve maya kolonileri fiziksel kesit kombinasyonu hücreleri ⁴ iç organizasyonu ortaya koymuştur. Ancak, konfokal veya iki foton mikroskopi kullanılarak doğrudan optik kesit maya kolonileri içine derin bir kaç hücre tabakaları ulaşmak için sadece mümkün olmuştur. Bu sınırlama nedeniyle maya hücreleri ⁴ ışık güçlü saçılma muhtemeldir.

Burada, sabitleme ve Saccharomyces cerevisiae topluluklar içinde floresan hücrelerin mekansal dağılımını elde etmek için cryosectioning dayalı bir yöntem sunuyoruz. Biz sabitleştirici ajan olarak metanol kullanımıhücrelerinin mekansal dağılımını korumak. Sabit topluluklar Kriyostaz OCT bileşiği, dondurulmuş ve cryosectioned ile infiltre edilir. Bölümlerin Floresans görüntüleme toplum içinde floresan hücrelerin iç organizasyonunu ortaya koymaktadır.

Kırmızı ve yeşil floresan protein eksprese eden maya suşu oluşan toplulukların örnekleri de mantar kolonileri ^2.3 içinde gen ekspresyonunun bu gibi floresan hücrelerinin uzaysal dağılımının ortaya çıkarmak için cryosectioning yöntem potansiyellerini göstermek. Bizim odak Saccharomyces cerevisiae topluluklar olmuştur rağmen, aynı yöntem potansiyel olarak diğer mikrobiyal topluluklar incelemek için uygulanabilir.

Protokol

1. Maya Topluluklar Tespit

Bir membran filtreden (; Şekil 2A, örneğin Millipore MF membran filtre) mayaya topluluklar büyütün. Bu protokol, bir 6 mm çapındaki membran filtre üzerinde daha az 2x10 ⁸ hücrelerin, tipik bir topluluk karşılık gelir.
Iyi bir 1 cm çaplı (Şekil 2B) alt kapak 541 Whatman filtre kağıdı parçası kullanın. Bu whatman kağıt sonraki aşamalarda topluluk aktarmak için bir taşıyıcı olarak kullanılacaktır. De 1 ml% 100 metanol ekleyin ve dengelemek için sıcaklık -20 ° C de bırakın.
Bir Dewar sıvı N ₂ koyun. Sıvı içinde en az 15 saniye boyunca topluluk daldırma N ₂ bir cımbız (Şekil 2C) kullanılarak sıvı azot içinde topluluk dondurun.
-20 ° C metanol (Şekil 2B) ve de dondurulmuş topluluk aktarın. Metanol içinde batış zaman toplumun yatay tutulur emin olun.20 dakika bekleyin. MF Membran filtre metanol içinde parçalanmaya başlar.
De metanol buharlaşma (Şekil 2E) için -20 ° C'de muhafaza soğuk bir Petri kabı metanol topluluk taşıyıcı kullanılarak Whatman 541 filtre kağıdı aktarın. Aktarırken, taşıyıcı whatman filtrenin üstüne topluluk tutmak ve soğuk Petri kabı koymadan önce kalın whatman kağıt başka bir parça kullanılarak metanol ilave damla uzaklaştıracağım. Bu buharlaşma süresi numuneden numuneye tutarlı olmasını sağlayacaktır.
Taşıyıcı whatman filtre kuru görünüyor kadar buharlaşma için 4-6 saat bekleyin. Yetersiz buharlaşma kesit engelleyen kalıntı metanol bırakır. Topluluklarda nedenler çatlak ve deformasyon üzerinde kuruyan.
-20 ° C dondurucu örnek çıkarın. Toplum tarafından kapsanmayan whatman 541 filtre kağıdı kesip.
Numune en az ~ 2 mm kenar var böyle büyüklükte bir dikdörtgen küp alüminyum folyo konteyner Yapher iki tarafında (Şekil 2F). Alüminyum folyo konteyner alt yüzeyinde topluluk yerleştirin; hemen 3 OCT ile örnek ~ topluluk yüksekliği yukarıda 4 mm kapsamaktadır. Önemli ise, örnek yönünü kabın yanlarına ile ilgili olarak, bu adımda ayarlanabilir. 10 dakika bekleyin.
Dondurmak için kuru buz üzerinde metal bir plaka üzerinde OCT-gömülü örneği yerleştirin. -20 ° C veya -80 ° C derin dondurucu da donmuş topluluklar saklayın.

2. Floresans Görüntüleme için Dondurulmuş Toplulukları Kesit

-25 ° C ila cryosection odasının sıcaklığı ayarlanır ve sıcaklık odasının bir sıcaklığa ulaşıncaya kadar oda içinde örnekleri bırakın.
Montaj üzerine OCT bir damla uygulandıktan sonra kriyo-montaj üzerine numune monte edin. Ekim kalınlığı 2-3 mm olacak şekilde maruz Whatman filtre kağıdı (konteynerin alt) ile numune yan tarafında eşit Ekim yayılır. Se önce kriyostat odacıkta Ekim donma edelimctioning. Örneğin her iki tarafta 2-3 mm olan bir OCT kenar bölümleri sağlanması bütünlüğünü korumaya yardımcı olur.
OCT örnek bloğun iki numune hizalamak için kullanılabilir. Örnek bıçağı ile ilgili olarak hizalı değilse, kesit örnek bir köşesine veya yan başlayacaktır. Bıçak örnek blok bir mükemmel dikey (veya yatay) yüz keser emin olmak için montaj ayarlayın.
Maya topluluklar için tipik bölümler ~ 14 mikron kalınlığında vardır. Bir bölüm kestikten sonra, yavaş yavaş kesik bölümüne slaydı yaklaşarak, bölüm toplamak için oda sıcaklığında bir mikroskop slaydı kullanır. Bölümü eritmek ve mikroskop lamı transfer olacak. Dakikada 18 bölüm, bir slayttan aktarılabilir.
Tercihen -20 soğuğa, ° C, görüntüleme önce de slaytlar saklayın. 4 ° C'de bir hafta tutulduğunda sinyal kaybı minimal Maksimum floresans sinyali için, görüntüleme tercihen kesit hemen sonra yapılır.