蛍光パターンを調査するための凍結セクショニング酵母コミュニティ

Babak Momeni; Wenying Shou

doi:10.3791/50101

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この記事について

要約
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要約

我々は、蛍光細胞の内部のパターンを観察するために酵母コミュニティを凍結および凍結セクショニングするためのプロトコルを提示します。この方法は、メタノール固定に依存しており、コミュニティ内での蛍光タンパク質を不活性化することなく、細胞の空間的な分布を維持するために10月エンベディング。

要約

微生物は、一般的に地域社会に住んでいます。コミュニティ内での細胞の空間的な組織は、コミュニティ¹の生存と機能に影響を及ぼすと考えられている。焦点と二光子顕微鏡を含む光学セクショニング技術は、細菌や古細菌群集^2,3の空間組織を観察するために有用であることが証明されています。酵母のコロニーの共焦点イメージングおよび物理的なセクショニングの組み合わせは、セル⁴の内部組織を明らかにした。しかし、共焦点や2光子顕微鏡を用いた直接的な光学セクショニングは、酵母のコロニーの奥深くまで少数の細胞層に到達することができるだけであった。この制限があるため⁴酵母細胞からの光の強い散乱の可能性があります。

ここでは、固定及びSaccharomyces cerevisiaeのコミュニティ内で蛍光細胞の空間分布を得るために、凍結セクショニングに基づく方法を提案する。我々は、定着剤としてメタノールを使用細胞の空間分布を保存する方法について説明します。固定されたコミュニティはクライオスタットにおけるOCT化合物、冷凍、および凍結切片を浸透されています。セクションの蛍光イメージングは、コミュニティ内の蛍光細胞の内部組織を明らかにする。

赤と緑の蛍光タンパク質を発現する株から成る酵母コミュニティの例としては、同様に酵母のコロニー^2,3内の遺伝子発現の場合と蛍光細胞の空間分布を明らかにするために凍結セクショニング法の可能性を実証している。我々の焦点は、Saccharomyces cerevisiaeのコミュニティになっているにもかかわらず、同じ方法を用いて、潜在的に他の微生物群集を検討するために適用することができる。

プロトコル

1。酵母のコミュニティを修正

メンブレンフィルター（; 図2A 例えば 、ミリポアMF膜フィルター）に酵母のコミュニティを育てています。このプロトコルは、6mm径のメンブレンフィルター上の未満2×10 ^8個の細胞の典型的な地域に対応しています。
ウェル1センチ直径（ 図2B）の底をカバーする541ワットマン濾紙を使用しています。このワットマン紙は後の段階でコミュニティを転送するためのキャリアとして使用されます。ウェルに1ミリリットル100％メタノールを追加し、平衡化するために、温度を-20でよく℃を残す。
デュワーに_液体窒素_を入れ_{てください} 。ピンセット（ 図2C）を使用して、液体N ₂中で少なくとも15秒間コミュニティを浸漬することにより、液体窒素中でコミュニティをフリーズします。
-20℃メタノール（ 図2D）のウェルに凍結コミュニティを転送します。メタノールでそれを浸すとき社会が水平に保たれていることを確認します。20分待ってください。 MF膜フィルターは、メタノール中で崩壊し始めます。
よくメタノールの蒸発（ 図2E）は-20℃で保た冷たいペトリ皿にメタノールからコミュニティの担体を用いて541ワットマンろ紙を転送します。転送する場合は、キャリアWhatmanフィルターの上にコミュニティを維持し、寒いペトリ皿に入れる前に厚いワットマン紙の別の部分を用いてメタノールの余分な水滴を離れて描画します。これは蒸発時間は、サンプルとサンプルの間の一貫性があることを保証します。
キャリアWhatmanフィルターが乾燥して見えるまで蒸発のために4から6時間待ちます。不十分な蒸発はセクショニングと干渉残留メタノールを残します。過乾燥は、地域社会に亀裂や変形が生じる。
-20℃の冷凍庫からサンプルを取り出します。コミュニティで覆われていないワットマン541濾紙を切り取った。
サンプルはから少なくとも約2 mmのマージンを持っているような十分な大きさの長方形の立方体のアルミ箔コンテナを作るそれぞれの側（ 図2F）。アルミ箔容器の底面にコミュニティを置き、すぐに3〜10月でサンプル〜コミュニティの高さ上記4ミリメートルをカバーしています。重要な場合は、試料の配向が容器の側面に関連して、このステップで調整することができます。 10分待ってください。
凍結するドライアイス上に金属板の上に10月包埋サンプルを置きます。 -20℃または-80℃の冷凍庫で凍結コミュニティを保管してください。

2。蛍光イメージング用冷凍コミュニティセク

-25℃に凍結切片室の温度を設定し、その温度が室内の温度に達するまでチャンバー内のサンプルのままにしておきます。
台紙に10月のドロップを適用した後にクライオマウントにサンプルをマウントします。 10月の厚さが2-3 mmであるように、露出したワットマン濾紙（容器の底部）で試料の側面に均一に10月を広げた。 10月はSE前クライオスタット室の内部に凍結しましょうctioning。サンプルのすべての側面に2〜3mmの10月のマージンを確保することは、セクションの整合性を維持するのに役立ちます。
10月のサンプルブロックの辺はサンプルを整列させるために使用することができます。サンプルがブレードに対して位置合わせされていない場合は、セクション化は、サンプルのコーナーやサイドからスタートします。ブレードはサンプルブロックの完全に垂直（もしくは水平）面をカットしていることを確認するためにマウントを調整します。
酵母のコミュニティのための典型的なセクションでは、〜14μmの厚さである。セクションをカットした後、ゆっくりと切断部にスライドを接近して、セクションを収集するために室温に保っ顕微鏡スライドを使用しています。セクションでは、溶融し、顕微鏡スライドに移ります。最大18のセクションには、1つのスライドに転写することができる。
好ましくは-20低温、℃、イメージングの前でスライドを格納します。 4℃で1週間保持する際、信号の損失が最小限に抑えられます最大蛍光シグナルは、イメージングは、好ましくは、セクショニングの直後に行われます。