Cryosectioning comunidades de leveduras para o exame de padrões de fluorescência

Babak Momeni; Wenying Shou

doi:10.3791/50101

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Resumo
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Resumo

Nós apresentamos um protocolo para congelamento e cryosectioning comunidades de leveduras para observar padrões internos de células fluorescentes. O método baseia-se na fixação de metanol e OCT-incorporação de preservar a distribuição espacial das células sem inactivar proteínas fluorescentes dentro de uma comunidade.

Resumo

Micróbios geralmente vivem em comunidades. A organização espacial das células dentro de uma comunidade é acreditado para impactar a sobrevivência e função da comunidade ^1. Ópticos técnicas de seccionamento, incluindo microscopia confocal e de dois fótons, têm se mostrado útil para observar a organização espacial das comunidades de bactérias e archaea ^2,3. Uma combinação de imagem confocal e seccionamento física de colónias de levedura revelou a organização interna de celas ^4. No entanto, seccionamento óptico direto em microscópio confocal ou dois fótons foi apenas capaz de atingir algumas camadas de células profundas em colônias de leveduras. Esta limitação é provavelmente devido à dispersão de luz forte a partir de células de levedura ^4.

Aqui, apresentamos um método baseado na fixação e cryosectioning para obter uma distribuição espacial de células fluorescentes dentro de comunidades de Saccharomyces cerevisiae. Usamos metanol como agente fixadorpara preservar a distribuição espacial das células. Comunidades fixos são infiltradas com OCT composto, congelados, e cryosectioned num criostato. Imagens de fluorescência das seções revela que a organização interna das células fluorescentes dentro da comunidade.

Exemplos de comunidades de leveduras consistindo em estirpes que expressam as proteínas de vermelho e verde fluorescente demonstrar as potencialidades do método cryosectioning para revelar a distribuição espacial de células fluorescentes, bem como a expressão de genes dentro de colónias de levedura ^2,3. Mesmo que o foco tem sido sobre as comunidades de Saccharomyces cerevisiae, o mesmo método pode ser potencialmente aplicada a examinar outras comunidades microbianas.

Protocolo

1. Fixação de comunidades de leveduras

Crescer comunidades de leveduras em um filtro de membrana (por exemplo, Millipore MF filtro de membrana; Figura 2A). Este protocolo corresponde a uma comunidade típico inferior a 2x10 ⁸ células sobre um filtro de membrana de 6 mm de diâmetro.
Utilizar um pedaço de papel Whatman 541 filtro para cobrir o fundo de um 1 cm de diâmetro bem (Figura 2B). Este papel Whatman será usado como um transportador para transferir a comunidade em fases posteriores. Adicionar 1 ml de metanol a 100% para o poço, e deixar o bem em -20 ° C para a temperatura equilibrar.
Coloque N2 _líquido num dewar. Congelar comunidade em nitrogênio líquido por imersão a comunidade por pelo menos 15 segundos em N2 _líquido usando uma pinça (Figura 2C).
Transferir comunidade congelado para o bem de -20 ° C de metanol (Figura 2D). Garantir que a comunidade seja mantido na horizontal quando submergindo-o no metanol.Espere 20 min. O filtro de membrana de MF começa a desintegrar-se em metanol.
Transferir comunidade usando o transportador 541 de papel de filtro Whatman partir do metanol bem para uma placa de Petri frio manteve a -20 ° C para a evaporação de metanol (Figura 2E). Ao transferir, manter a comunidade no topo da transportadora Whatman filtro e afastar gotas extras de metanol usando outro pedaço de papel Whatman grossa antes de colocar a placa de Petri frio. Isto irá assegurar que o tempo de evaporação é consistente de amostra para amostra.
Espere 4-6 horas para a evaporação até que o transportador de filtro Whatman parece seca. Evaporação insuficiente deixa metanol residual que interfere com o corte. Excesso de secagem causas rachaduras e deformações nas comunidades.
Tome o exemplo de -20 ° C congelador. Corte o papel Whatman 541 filtro não cobertos pela comunidade.
Fazer um contentor rectangular de folha de alumínio-cúbico que é suficientemente grande tal que a amostra possui pelo menos 2 mm ~ margem decada um dos lados (Figura 2F). Coloque a comunidade sobre a superfície do fundo do recipiente de folha de alumínio; cobrir imediatamente a amostra com OCT para 3 ~ 4 mm acima altura comunidade. Se importante, a orientação da amostra pode ser ajustada neste passo em relação aos lados do recipiente. Esperar 10 min.
Coloque a amostra outubro embutida em uma placa metálica em gelo seco para congelar. Armazenar as comunidades congelados a -20 ° C ou -80 ° C congelador.

2. Seccionamento Comunidades congelada por Fluorescência de imagem

Ajuste a temperatura da câmara de criocorte para -25 ° C e deixar as amostras na câmara até que a sua temperatura atinge a temperatura da câmara.
Monte a amostra para um crio-montagem após a aplicação de uma gota de outubro no monte. Espalhe outubro uniformemente sobre o lado da amostra com papel de filtro Whatman exposto (fundo do recipiente), de modo que a espessura da OCT é de 2-3 mm. Vamos congelar outubro dentro da câmara antes de se criostatoctioning. Assegurar uma margem de outubro de 2-3 mm em todos os lados da amostra de ajuda a preservar a integridade das secções.
Os lados do bloco de amostras de outubro pode ser usada para alinhar a amostra. Se a amostra não está alinhada em relação à lâmina, seccionando vai começar a partir de um canto ou lado da amostra. Regular a montagem para assegurar que a lâmina corta um rosto perfeitamente vertical (ou horizontal) do bloco de amostra.
Seções típicas para comunidades de leveduras são ~ 14 um de espessura. Após o corte de uma secção, a utilizar uma lâmina de microscópio mantido à temperatura ambiente para recolher a secção, pelo que se aproximava lentamente a lâmina para o corte. A seção vai derreter e transferir para a lâmina de microscópio. Até 18 seções podem ser transferidos para um slide.
Armazenar as lâminas a baixas temperaturas, de preferência -20 ° C, antes da imagiologia. A perda de sinal é mínima quando mantidos durante uma semana a 4 ° C. Para sinal de fluorescência máxima, a imagem é de preferência feito imediatamente após o corte.