형광 패턴 검사를위한 효모 커뮤니티 Cryosectioning

요약

우리는 형광 세포의 내부 패턴을 관찰 할 효모 커뮤니티를 동결 cryosectioning을위한 프로토콜을 제시한다. 방법은 메탄올 - 고정에 의존하고 지역 사회 내에서 형광 단백질의 운영을 중지시키지 않고 세포의 공간 분포를 유지하기 위해 월 퍼가기.

초록

미생물은 일반적으로 지역 사회에 살고 있습니다. 지역 사회 내에서 세포의 공간적 조직은 지역 사회 ^(1)의 생존과 기능에 영향을 미칠 것으로되어 있습니다. 공 촛점과 두 광자 현미경 등의 광학 sectioning 기술, 박테리아 및 archaeal 지역 사회 ^2,3의 공간 조직을 관찰하는 데 유용 입증했습니다. 공 촛점 이미징 및 효모 식민지의 물리적 sectioning의 조합이 세포 ^4의 내부 조직을 밝혔다. 그러나, 공 촛점 또는 두 광자 현미경을 사용하여 직접 광학 sectioning는 효모 식민지에 깊은 몇 가지 세포 레이어에 도달 할 만 수있었습니다. 이 제한 때문에 효모 세포 ⁴ 빛의 강력한 분산의 가능성이 높습니다.

여기, 우리는 고정와 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회 내에서 형광 세포의 공간적 분포를 얻기 위해 cryosectioning에 따라 방법을 제시한다. 우리는 정착액 에이전트로 메탄올을 사용하여세포의 공간적 분포를 유지합니다. 고정 사회는 그라 이오 스탯에 10월 화합물, 냉동 및 cryosectioned으로 침투하고 있습니다. 섹션의 형광 이미징은 지역 사회의 형광 세포의 내부 조직을 드러내고있다.

빨간색과 녹색 형광 단백질을 표현 변종으로 구성된 효모 지역 사회의 예로는뿐만 아니라 효모 식민지 ^2,3에서 유전자 발현의 같은 형광 세포의 공간 분포를 표시하는 방법 cryosectioning 방법의 가능성을 보여줍니다. 우리의 초점을 Saccharomyces cerevisiae의 지역 사회에있다하더라도, 같은 방법은 잠재적으로 다른 미생물 커뮤니티를 검사하기 위해 적용 할 수 있습니다.

프로토콜

1. 효모 커뮤니티 해결

1. 막 필터 (, 그림 2A 예를 들어, Millipore MF 막 필터)에 효모 커뮤니티를 성장. 이 프로토콜은 6mm 지름의 멤브레인 필터에 미만 2x10 ⁸ 셀의 전형적인 지역 사회에 해당합니다.
2. 잘 1cm 지름 (그림 2B)의 하단을 충당하기 위해 워트 먼지 541 필터 종이를 사용합니다. 이 워트 먼지 용지는 나중에 단계에서 지역 사회를 전송하는 캐리어로 사용됩니다. 잘에 1 ML 100 % 메탄올을 추가하고 평형을 할 수있는 온도 -20에서 잘 ° C 둡니다.
3. dewar의 액체 N ₂ 놔. 액체에 적어도 15 초 동안 지역 사회를 찍어 N ₂ 트위터 (그림 2C)를 사용하여 액체 질소에 지역 사회를 멈춰 봐.
4. -20 ° C의 메탄올 (그림 2D)의 우물 냉동 사회를 전송합니다. 메탄올에 잠수 할 때 지역 사회가 수평 유지되어 있는지 확인합니다.20 분 동안 기다리십시오. MF 막 필터는 메탄올에서 분해하기 시작합니다.
5. 잘 메탄올의 증발 (그림 2E)에 -20 ° C에서 보관 감기에 페트리 접시에 메탄올의 커뮤니티 캐리어를 사용하여 워트 먼지 541 필터 종이를 전송합니다. 전송하면, 캐리어 워트 먼지 필터의 상단에있는 지역 사회를 유지하고 추위를 페트리 접시에 올려 놓기 전에 두꺼운 워트 먼지 용지의 다른 부분을 사용하여 메탄올의 추가 하락을 멀리립니다. 이 증발 시간이 샘플에서 샘플에 일관성이 있는지 확인합니다.
6. 캐리어 워트 먼지 필터가 건조해질 때까지 증발하는 데 4 ~ 6 시​​간 정도 기다립니다. 부족 증발 sectioning을 방해 잔류 메탄올을 남긴다. 지역 사회에 원인의 균열과 변형을 걸쳐 건조.
7. -20 ° C의 냉동고의 샘플을보세요. 커뮤니티에 포함되지 워트 먼지 541 필터 종이를 멀리 자른다.
8. 샘플은 적어도 ~ 2mm 여백에서이되도록 충분히 큰 사각형 입방 알루미늄 호일 컨테이너를 확인각면 (그림 2F). 알루미늄 호일 컨테이너의 바닥 표면에 커뮤니티를 놓고, 즉시 3 10월와 샘플 ~ 지역 사회의 높이 위의 4mm을 다룹니다. 중요한 경우, 샘플의 방향은 컨테이너의 측면과 관련하여이 단계에서 조정할 수 있습니다. 10 분 기다립니다.
9. 고정하는 드라이 아이스에 금속 접시에 월 임베디드 샘플을 놓습니다. -20 ° C 또는 -80 ° C의 냉동고에서 냉동 커뮤니티를 저장합니다.

2. 형광 이미징을위한 냉동 커뮤니티 Sectioning

1. -25 ° C에 cryosection 챔버의 온도를 설정하고 그 온도가 챔버의 온도를 도달 할 때까지 챔버에서 샘플을 둡니다.
2. 마운트에 10월 한 방울를 적용한 후에 cryo-마운트에 샘플을 탑재합니다. 10월 두께 2-3 MM이야 수 있도록 노출 워트 먼지 필터 종이 (컨테이너의 하단)와 시료의 측면에 균일하게 10월을 알리십시오. SE 전에 그라 이오 스탯 챔버 내부 10월 동결하자ctioning. 샘플의 모든 측면에 2~3밀리미터의 10월 마진을 보장하는 것은 섹션의 무결성을 유지하는 데 도움이됩니다.
3. 10월 샘플 블록의 측면은 샘플을 정렬하는 데 사용할 수 있습니다. 샘플이 블레이드에 대해 정렬되지 않은 경우 sectioning은 샘플의 구석 또는 측면에서 시작됩니다. 블레이드는 샘플 블록의 완벽한 수직 (또는 수평)의 얼굴을 잘라 수 있도록 마운트를 조정합니다.
4. 효모 지역 사회를위한 일반적인 섹션 ~ 14 μm 두께입니다. 섹션을 절단 한 후, 천천히 컷 섹션으로 슬라이드를 접근하여 섹션을 수집 실온에서 보관 현미경 슬라이드를 사용합니다. 섹션은 녹기과 현미경 슬라이드에 전송합니다. 18 섹션으로 하나의 슬라이드에 전송 할 수 있습니다.
5. 바람직하게는 -20 차가운 온도, ° C, 이미징 전에에서 슬라이드를 저장합니다. 4 ° C.에 1 주일 동안 보관했을 때 신호의 손실을 최소화합니다 최대 형광 신호를 들어, 영상은 바람직 sectioning 후 즉시 이루어집니다.

결과

붉은 색과 녹색으로 태그 경쟁력 인구에게 ^6를 포함하는 효모 지역 사회의 수직 교차 부분의 형광 이미지는 그림 3에 표시됩니다. 이러한 커뮤니티, 효모 및 공간 등의 공유 자원, 대한 경쟁의 두 prototrophic의 변종으로 구성되어 그들의 수직 교차 섹션에 표시 주상 패턴 ^7로 연결됩니다. 단일 셀 해상도 아래는 크로스 섹션에서 해결 할 수 있습니다. 그림 3은 그림 ...

토론

여기에 제시된 절차는 효모 지역 사회의 내부 구조를 검사 할 수있는 방법을 제공합니다. 메탄올 고정 단계 ⁸ 효모 식민지는 융통성하게하고 식민지의 무결성을 유지하지만, 또한 그 결과를 해석에 고려되어야 수축 ^8됩니다. 우리는 일반적으로 직접 ^구를 해결하지 않고 10월에 포함 된 식민지에 비해 효모 식민지의 높이에서 30 %의 수축을 참조하십시오.

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
시약의 이름	회사	카탈로그 번호	코멘트 (선택 사항)
100 % 메탄올	JT 베이커	9070-01
조직 - 테크 10월 컴파운드	Andwin 과학	4583
워트 먼지 학년 번호 541 수량 필터 종이	워트 먼지	1541-047
Millipore-MF 막 필터	Millipore	HAWP04700
그라 이오 스탯	Leica	CM 1510 S