PRP כגישה חדשה למניעת זיהום: הכנה ו<em&gt; במבחנה</em&gt; מאפיינים מיקרוביאלית של PRP

Summary

זיהום שתל הקשורים הוא סיבוך קליני משמעותי. מחקר זה מתאר גישה באמצעות פלזמה עשירה בטסיות (PRP) כדי למנוע זיהומים הקשורים שתל, מציג את הפרוטוקול להכנת PRP עם ריכוז טסיות דם קבוע, ומדווח על נכסים שזוהו לאחרונה מיקרוביאלית של PRP ופרוטוקולים הקשורים לבחינת מאפיינים מיקרוביאלית כאלה במבחנה.

Abstract

זיהום שתל הקשורים הופך להיות יותר ויותר מאתגר לתעשיית הבריאות עולמי בשל הגדלת עמידות לאנטיביוטיקה, העברה של חיידקים עמידים לאנטיביוטיקה בין חיות ובני אדם, ועלות הגבוהה של טיפול בזיהומים.

במחקר זה, אנו חושפים את אסטרטגיה חדשה שעשויה להיות יעילים במניעת שתל הקשורים זיהום על בסיס התכונות מיקרוביאלית הפוטנציאליות של פלזמה עשירה בטסיות (PRP). בשל תכונותיו, למדו היטב לקידום ריפוי, PRP (מוצר ביולוגי) כבר משמש יותר ויותר ליישומים קליניים כוללים ניתוחים אורתופדיים, ניתוחי חניכיים ופה, ניתוחי לסת, ניתוחים פלסטיים, רפואת ספורט, וכו '

PRP יכול להיות חלופה מתקדמת לטיפולים אנטיביוטיים קונבנציונליים במניעת זיהומים הקשורים שתל. השימוש בPRP עשוי להיות יתרון בהשוואה לטיפולים אנטיביוטיים קונבנציונליים siNCE PRP הוא פחות סביר לגרום לעמידות לאנטיביוטיקה וPRP של מיקרוביאלית ותכונות ריפוי מקדם עשויים להיות השפעה סינרגיסטית על מניעת זיהום. זה ידוע היטב כי פתוגנים ותאי אדם הם מירוץ למשטחי שתל, והמאפיינים של PRP ריפוי קידום יכולים לשפר מצורף תא אנושי ובכך להפחית את הסיכויים לזיהום. בנוסף, PRP הוא מטבעו ביולוגי, ובטוח וחופשי מהסיכון למחל העברה.

למחקר שלנו, יש לנו נבחרו מספר זני חיידקים קליניים שמצויים לרוב בזיהומים אורתופדיים ובדקו האם יש בPRP מאפיינים מיקרוביאלית מבחנה נגד חיידקים אלה. הכנו PRP באמצעות גישת צנטריפוגה פעמים אשר מאפשרת את אותו ריכוז טסיות כדי להתקבל לכל המדגמים. השגנו ממצאים מיקרוביאלית עקביים ומצאנו שיש לו חזק בPRP מאפיינים מיקרוביאלית מבחנה נגד חיידקים כמו methiaureus רגיש-cillin והעמיד methicillin סטפילוקוקוס, קבוצת סטרפטוקוקוס, וNeisseria gonorrhoeae. לכן, השימוש בPRP יכול להיות פוטנציאל למניעת הזיהום ולהפחית את הצורך בטיפול יקר שלאחר ניתוח שתל של זיהומים הקשורים.

Introduction

זיהום שתל הקשורים הוא סיבוך קליני משמעותי. סטפילוקוקוס אוראוס (ס aureus) הוא אחד ממיקרואורגניזמים הנפוצים ביותר שבודדו מזיהומים הקשורים שתל. הוא מסוגל לייצר biofilm המכסה את פני השטח של שתלים ועלולים להוביל לזיהום ^1,2 עמיד לאנטיביוטיקה. טיפול בזיהום נלווה שתל-לעתים קרובות דורש אשפוז ארוך טווח לdebridements החוזרים ונשנים וטיפול אנטיביוטי ממושך Parenteral. במקרים עמידים לאנטיביוטיקה, הסרת השתל עשויה להיות נחוצה. ההתנגדות הגוברת של חיידקים לאנטיביוטיקה יש גם מכונה על ידי המרכז לבקרת מחלות ומניעתן (CDC), "אחד מבעיות הבריאות הקשות ביותר בעולם." עם זמן, ללא התפתחות של טיפולים חדשים ויעילים מיקרוביאלית, זה אפשרי כי פתוגנים עמידים לשילוב תרופות יהיו חשוכים עם אנטיביוטיקה קונבנציונלית. מניעת שתל הקשוריםזיהום לכן חשוב וסוכנים מניעתי רומן או גישות יש צורך למניעת זיהומים כאלה.

פלזמה טסיות דם עשיר (PRP) היא ריכוז של דם אוטולוגית המכיל מעל 30 גורמי גדילה אשר יכול לסייע בריפוי עצם ושתל עצם ^3-5. היישום של PRP כדי לשפר את התחדשות עצם ורקמות רכות התבגרות דווח יותר ויותר במרפאות בגלל הריכוז הגבוה של גורמי גדילה שונים שפורסמו על ידי טסיות.

כמה מאפיינים של PRP PRP עולים כי יכול להיות גם מאפיינים מיקרוביאלית ^6-9. PRP מכיל מספר גדול של טסיות דם, ריכוז גבוה של תאי דם לבנים (שעשוי להחזיק פעולות מארח הגנה נגד חיידקים ופטריות), ופפטידים מיקרוביאלית מרובים ^7,8,10. במחקר שנערך לאחרונה בעוקבה גדולה של חולים ניתוחיים לב, התגלה כי שימוש intraoperative של PRP ג'ל במהלך סגירת הפצע signifירידת icantly השכיחות של זיהום עצם חזה שטחי ועמוק ^11. המסיבות והתצפיות הללו, שערו כי PRP, מלבד תכונותיו, למדו היטב ריפוי המקדם, יש מאפיינים מיקרוביאלית. היתרונות הפוטנציאליים של שימוש PRP כדי למנוע זיהום יכולים לכלול: (i) PRP הוא פחות סביר לגרום להתנגדות בהשוואה לטיפולים אנטיביוטיים קונבנציונליים. (Ii) PRP יש גם תכונות שמקדמות ריפוי אשר עשוי להיות השפעה סינרגיסטית על מניעת זיהום; המאפיינים של PRP ריפוי המקדם יכולים לספק חותם כדי למנוע עיקול חיידקים ובכך להפחית את הסיכויים לזיהום כפתוגנים ותאי אדם הם מירוץ למשטחי שתל ^{12 , 13.} (Iii) PRP הוא מטבעו ביולוגי, ובטוח וחופשי מהסיכון למחל העברה.

המטרה שלנו לטווח הארוך היא להשתמש PRP כגישה חדשה למניעת שתל הקשורים infectiתוספות. מטרת מחקר זה היה להכין PRP באמצעות גישת צנטריפוגה פעמים, כדי לבחון PRP של נכסים במבחנת מיקרוביאלית, וכדי לתאר את הפרוטוקולים להערכת מאפיינים מיקרוביאלית כאלה.

Protocol

1. הכנה והפעלה של PRP

להקיז דם 1.1

1. הרדם ארנב על ידי שאיפה של isoflurane (2% בO ₂ לזירוז ו1% לתחזוקה).
2. צייר 2 0.129 ציטראט המ"ל M תלת נתרן (פתרון anticoagulent) לתוך מזרק מ"ל 20. פתרון ציטראט תלת נתרן הוא הוכן על ידי המסת 1.897 ציטראט תלת נתרן גרם ב 50 המ"ל המזוקק H ₂ O וסינון עם מסנן 0.22 מיקרומטר סטרילי.
3. לחטא את אוזן הארנב באמצעות אתנול 70%.
4. להקיז דם (5 מ"ל לדוגמה) מוריד אוזן הארנב באמצעות מחט פרפר (25-G) מחובר למזרק.
5. מערבב את הדם עם פתרון ציטראט תלת נתרן על ידי תסיסה עדינה. יחס הנפח של תמיסת ציטרט תלת נתרן בדם והוא 09:01.

1.2 הכנת PRP (איור 1)

1. העברת דם anticoagulated לצינור פלסטיק צנטריפוגה מ"ל 50. קח aliquot של 10 μlדם כדי לקבוע את ספירת הטסיות הבסיסית באמצעות hemocytometry.
2. צנטריפוגה הדם ב 300 XG למשך 10 דקות בטמפרטורת חדר (RT) בצנטריפוגה עם הרוטור נדנדה החוצה. הגדר את התאוצה ומהירות בלם לנמוך (איור 1).
3. לאחר צנטריפוגה, הדם מתחלק לשלוש שכבות. השכבה התחתונה היא תאי דם אדומים בעיקר, השכבה האמצעית (המכונה גם "מעייל באפים") מורכבת מטסיות דם ותאי דם לבנים מרוכזים, והשכבה העליונה היא בעיקר פלזמה, המהווה את המרכיב הנוזלי של דם, וטסיות דם ( איור 1). בזהירות להעביר את צינור צנטריפוגה למכסת מנוע תרבית תאים; לא להפריע את השכבות. להעביר את כל הפלזמה, מעייל באפים, ושכבת 2-3 מ"מ עובי תאי דם אדומה לתוך צינור פלסטיק 15 מ"ל באמצעות pipettor פלסטיק 1 מ"ל.
4. צנטריפוגה המדגם הועבר בפעם שנייה ב3000 XG במשך 15 דקות בRT. השכבה העליונה (supernatant) נחשבת עניה פלזמת טסיות דם (PPP)ד מועבר לצינור חדש.
5. השג PRP ידי התאמת ריכוז טסיות הדם בדגימת הדם שנותרה באמצעות PPP להשיג 10 x 2.0 ⁶ טסיות / μl (נקבע על ידי hemocytometry).

1.3 הפעלת PRP

1. הכן את פתרון הפעלת PRP ידי המסת תרומבין שור 5000 יחב"ל עם מ"ל 10% כלוריד 5 סידן לריכוז העבודה של 1,000 יחב"ל / מ"ל.
2. הוסף את הפתרון להפעלה וPRP-PPP, ומערבב את הפתרון על ידי pipetting שוב ושוב כדי ליצור PRP-PPP ו- ג. יחס הנפח של הפתרון להפעלת PRP או PPP הוא 01:04.

2. במבחן Antimicrobial מבחנה של PRP השימוש Assay Curve Kill (איור 2)

1. באמצעות לולאת inoculating סטרילי, להוסיף כמה מושבות של ס ' סטפילוקוקוס מתרבות צלחת הלילה שלה לתוך 5 מ"ל של מרק מילר הינטון (MHB) בצינור פלסטיק. מערבולת קצרה ואז דגירת המדגם עבור 2 שעות ב 37 ° C. הבא, הצפיפות האופטית של תקשורת החיידקים נקבעה באמצעות ספקטרופוטומטר והותאמה לצפיפות שווה ל ~ 1 אופטית x 10 ⁸ CFU / מ"ל על בסיס העקום הסטנדרטיות שנקבע מראש.
2. הפוך דילול 100x באמצעות PBS להשיג 1 x 10 ⁶ CFU / מ"ל ולמקם את inoculums על קרח.
3. להגדיר ולתייג 5 שפופרות סטריליות, חד פעמיות מיליליטר ישבן עגול קלקר, ולהכין את הקבוצות לדוגמא הבאות, שהוזכרו בטבלת המס '1 לנפח סופי של 2 מ"ל בכל מבחנה.
4. הוסף PRP, PPP, או PBS ראשון שצינורות הקלקר, ואחריו פתרון תרומבין לצורך ההפעלה (היווצרות קריש). בשלב בא, ולאחר מכן להוסיף MHB ס inoculums aureus (1 x 10 ⁶ CFU / מ"ל) להשיג ריכוז הסופי של 1 x 10 ⁵ CFU / מ"ל.
5. דגירת הצינורות על 37 מעלות צלזיוס עם תסיסת הקפה ב 150 סל"ד.
6. בנקודתי זמן שנקבעו מראש (לדוגמה 0, 1, ו2 שעות), לערבב את הפתרונים בכל צינור באמצעות pipetting החוזר (זההצעד חשוב שכן עשויים להיות לכודי חיידקים בתוך הג'ל PRP). קחו 10 μl של מדגם, לדלל סדרתי עם מי מלח 0.9% סטרילית, ופיפטה aliquot 100 μl של כל דילול על אגר סויה Tryptic (TSA, עם 5% דם כבשים) צלחת לספירת CFU.
7. תרבות את הצלחות אגרו הלילה על 37 מעלות צלזיוס, ואז תספורנה ולהקליט מושבות הצלחת. נתוני עלילה בקנה מידת logarithimic עם זמן (שעות) על ציר ה-X וCFU / מ"ל ​​על ציר y.

תוצאות

PRP מוכן reproducibly באמצעות גישת צנטריפוגה פעמים (איור 1). PRP נמצא להציג חזק (ירידה של עד 100-לקפל בCFUs) במאפיינים מיקרוביאלית מבחנה נגד methicillin העמיד ס סטפילוקוקוס (MRSA) (איור 3), הנמצא בדרך כלל בבתי חולים ברחבי עולם ^14. כמו כן, PRP יש מאפיינים מי?...

Discussion

פלזמה טסיות דם עשיר כבר בשימוש יותר ויותר ליישומים קליניים בשל מאפייניה ריפוי המקדם ^15-17. במחקר הנוכחי, PRP הוצג כגישה חדשה למניעת זיהום. PRP נמצא יש מאפיינים מיקרוביאלית חזקים נגד MRSA, MSSA, הקבוצה סטרפטוקוקוס, וNeisseria gonorrhoeae. היתרונות העיקריים של PRP, בהשוואה לטיפול...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Bovine thrombin	King Pharmaceuticals, Inc	60793-215-05	Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride	King Pharmaceuticals, Inc	60793-215-05	10% calcium chloride
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Isoflurane	Baxter	1001936060
Mueller Hinton broth	Becton, Dickinson and Company	275710
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	D8662
Tri-sodium citrate	Sigma-Aldrich	W302600
Tryptic soy agar	Fisher Scientific	R01202
Centrifuge	Kendro Laboratory Products	750043077
Syringe filter	Millipore	SLGP033RS