著者
お問い合わせ

サインイン

このコンテンツを視聴するには、JoVE 購読が必要です。 サインイン又は無料トライアルを申し込む。

この記事について

  • 要約
  • 要約
  • 概要
  • プロトコル
  • 結果
  • ディスカッション
  • 開示事項
  • 謝辞
  • 資料
  • 参考文献
  • 転載および許可

要約

インプラント関連感染は重要な臨床合併症である。この研究は、インプラント関連感染を防ぐために、多血小板血漿（PRP）を用いたアプローチを説明し、一定の血小板濃度でPRPを調製するためのプロトコルを提示して、PRPの新たに同定された抗菌性や抗菌性を調べるための関連プロトコルを報告。

要約

インプラント関連感染が増加して抗生物質耐性、動物と人間の間に抗生物質耐性菌の伝送、および感染症の治療コストの高さに起因する世界的なヘルスケア産業にますます困難になってきています。

そこで本研究では、多血小板血漿（PRP）の潜在的な抗菌特性に基づいてインプラント関連感染の予防に有効である可能性がある新たな戦略を開示している。治癒を促進するためのよく研究された特性のために、PRP（生物学的製剤）はますます整形外科手術、歯と口腔の手術、顎顔面手術、整形手術、スポーツ医学などを含む臨床応用に使用されている

PRPはインプラント関連感染の防止に従来の抗生物質治療に高度な代替手段である可能性があります。 PRPを使用することにより、従来の抗生物質治療Siに比べて有利であるかもしれないPRPのNCE抗生物質耐性を誘導する可能性が低いとPRPの抗菌と癒しの促進特性は感染予防上の相乗効果があるかもしれません。それも病原体とヒトの細胞がインプラント表面のためにレースをしていることが知られており、治癒を促進するのPRPのプロパティには、それによって感染の確率を減らす人間の細胞接着を向上させることができます。また、PRPは本質的に、生体適合性、安全かつ伝染性疾患の危険性から自由である。

我々の研究のために、私たちは一般的に整形外科の感染症で発見され、PRPは、in vitroでこれらの細菌に対する抗菌性を持っているかどうかを検討されているいくつかの臨床菌株を選択しました。我々は、同じ血小板濃度がすべてのサンプルを得ることができるようになり二回遠心分離のアプローチを使用してPRPを用意しました。我々は、一貫性のある抗菌性の調査結果を達成し、PRPは、in vitroでメティのような細菌に対する抗菌性を強いていることを発見したウイルスバスター感受性およびメチシリン耐性黄色ブドウ球菌、A群連鎖球菌 、および淋菌 。したがって、PRPの使用は、感染を防ぐために、インプラント関連感染の高価な術後治療の必要性を低減する可能性を秘めているかもしれません。

概要

インプラント関連感染は重要な臨床合併症である。 黄色ブドウ球菌 （ 黄色ブドウ球菌 ） は、インプラント関連感染症から分離された最も一般的な微生物の一つである。これは、インプラントの表面をカバーし、抗生物質耐性感染1,2につながる可能性がバイオフィルムを製造することができる。インプラント関連感染症の治療は、頻繁に繰り返さdebridementsかつ長期の非経口抗生物質治療のために長期入院を必要とします。抗生物質耐性例では、インプラントの除去が必要になることがあります。抗生物質に対する細菌の耐性が上昇するとしても、疾病管理予防センター（CDC）によって参照されている "世界で最も緊急の健康問題の一つ。"時間では、新しい効果的な抗菌治療法の開発がなければ、多剤耐性病原体は、従来の抗生物質による治療不可能となる可能性があります。インプラント関連の防止感染症は、ことが重要であると新規予防剤またはアプローチはこのような感染症を予防するために必要とされる。

多血小板血漿（PRP）は、骨と骨移植の治癒3から5を助けることができる30以上の成長因子が含まれている自己血の濃度である。骨再生や軟組織の成熟を高めるために、PRPの応用はますますため血小板がリリースし、様々な成長因子のその高濃度の診療所で報告されています。

PRPのいくつかの特徴では、PRPも抗菌特性6-9を持っているかもしれないことを示します。 PRPは、血小板の数が多い、白血球の高濃度（細菌および真菌に対する宿主防御アクションを持っているかもしれない）、複数の抗菌ペプチド7,8,10が含まれています。心臓外科患者の大規模コホートの最近の研究では、創傷閉鎖signif時PRPゲルの術中使用することが明らかになったicantly浅と深い胸骨感染11の発生率を減少させた。これらの理由及び観察のために、私たちは、PRPは、そのよく研究された治癒促進特性以外にも、抗菌特性を持っているという仮説を立てた。感染を防ぐためにPRPを使用しての潜在的な利点があり得る：（i）PRPが従来の抗生物質治療に比べて抵抗性を誘発する可能性が低くなります。 （ⅱ）PRPがまた感染予防に相乗効果があるかもしれ治癒を促進する性質をもっています。PRPの治癒促進特性は、病原体とヒトの細胞がインプラント表面12にはレースをしていると感染の確率を減らすことにより、細菌の付着を防止するためにシールを提供することができます、13。 （ⅲ）PRPは本質的に、生体適合性、安全かつ伝染性疾患のリスクがない。

私たちの長期的な目標は、インプラント関連infectiを防ぐための新たなアプローチとして、PRPを使用することですアドオン。本研究の目的は、PRP は 、in vitro抗菌特性の PRPのを調べるために、二回遠心分離のアプローチを使用して、そのような抗菌性を評価するためのプロトコルを記述するために準備することでした。

プロトコル

1。 PRPの作製とその活性化

1.1採血

  1. イソフルランの吸入（誘導のためのO 2中2％、保守のための1％）でウサギを麻酔。
  2. 20mlのシリンジに2ミリリットル0.129 Mのクエン酸三ナトリウムを（anticoagulentソリューション）を描画します。クエン酸三ナトリウム溶液を50 mlの蒸留H 2 O中の1.897グラムクエン酸三ナトリウムを溶解し、0.22μmの滅菌フィルターで濾過することによって調製される。
  3. 70％エタノールを用いてウサギの耳を殺菌。
  4. 翼状針（25g）をシリンジに接続を介して、ウサギの耳静脈から（ 例えば 5ミリリットル）の血を引く。
  5. 穏やかな攪拌によってクエン酸三ナトリウム溶液を用いて血液を混ぜる。血液とクエン酸三ナトリウム水溶液の体積比は9:1である。

1.2 PRPの調製（ 図1）

  1. 50mlプラスチック遠心管に抗凝固処理血液を転送します。 10μlのアリコートを取る血球計算法を用いてベースライン血小板数を決定するために、血液。
  2. スイングアウトローター付き遠心機で室温（RT）で10分間、300×gで血液を遠心分離します。低い（ 図1）への加速とブレーキの速度を設定します。
  3. 遠心後、血液は3層に分かれています。底層は、中間層（一般的に "バフィーコート"と呼ばれる）は、主に赤血球で濃縮血小板や白血球から構成され、最上位層は、主に血液の液体成分である血漿、血小板である（ 図1）。細胞培養用フードに遠心管を慎重に輸送;層を乱すことがありません。 1ミリリットルプラスチックピペットを用いて、15​​ mlプラスチックチューブに、血漿、バフィーコート、および2-3 mm厚赤血球層のすべてを転送します。
  4. 室温で15分間3000 xgで転送サンプルをもう一度遠心します。上層（上清）を乏血小板血漿（PPP）と見なされますdは、新しいチューブに移す。
  5. 2.0×10 6血小板/μlを（血球計算法によって決定される）を得るために、PPPを使用して、残りの血液サンプル中の血小板濃度を調整することによって、PRPを得る。

1.3 PRPの活性化

  1. 1,000 IU / mlの濃度になるように取り組んで5ミリリットル10％塩化カルシウムで5,000 IUウシトロンビンを溶解させることによって、PRPの活性化溶液を調製します。
  2. PRPとPPPにライセンス認証ソリューションを追加して、繰り返して、PRP-およびPPP-ゲルを形成するために、ピペッティングにより溶液を混ぜて使用する。 PRPまたはPPPへの活性化溶液の体積比は1:4です。

2キルカーブアッセイを使用して、PRP の in vitro抗菌試験（ 図2） では、

  1. 無菌接種ループを使用して、Sのいくつかのコロニーを追加プラスチックチューブでミューラーヒントンブロス（MHB）5mlにその晩平板培養から黄色ブドウ球菌 。 Vortexは簡潔にしてから、37℃で2時間サンプルをインキュベート次の、細菌のメディアの光学濃度を分光光度計を用いて決定し、予め決められた標準曲線に基づいて〜1×10 8 cfu / mlに等しい光学密度に調整した。
  2. 1×10 6 CFU / mlを取得し、氷の上で接種を配置するPBSを用いて100倍希釈を作る。
  3. セットアップおよび滅菌、使い捨て5ミリリットル丸底ポリスチレンチューブにラベルなど、各チューブに2 mlの最終容積については、 表1に示されている以下のサンプル·グループを準備。
  4. 活性化のためのトロンビン溶液（ゲル形成）が続いポリスチレンチューブにPRP、PPP、またはPBSを最初に追加します。次に、MHBを追加してから、S.球菌接種（1×10 6 CFU / ml）を1×10 5 CFU / mlの最終濃度を得ることができる。
  5. ℃で150rpmで攪拌​​しながら軌道37でチューブをインキュベートする。
  6. 予め決められた時点（ 例えば 0,1、および2時間）で、繰り返しピペッティング（これを経由して各チューブ内の溶液を混合細菌は、PRPゲルの内部に閉じ込められるかもしれないので、ステップ）が重要である。 、サンプルの10μlを取り滅菌0.9％生理食塩水で順次希釈し、トリプシン大豆寒天（TSA、5％羊血液付き）CFUカウントのためのプレート上に各希釈液の100μlアリコートをピペット。
  7. 37℃で一晩培養寒天プレート°Cは、その後プレートのコロニーをカウントし、記録します。 y軸上のx軸およびCFU / mlの上の時間（hr）とlogarithimicスケールでデータをプロットします。

結果

PRPは、再現性回遠心分離法（ 図1）を用いて調製される。 PRPは、メチシリン耐性S.に対する in vitro抗菌特性で （CFUsで最大100倍の減少）は、強力な存在が判明した一般的に世界中の病院14に見られる黄色ブドウ球菌 （MRSA）（ 図3）。同様に、PRPはメチシリン感受性球菌に対して強い抗菌性を持って黄色ブドウ球菌 （MSSA）、A?...

ディスカッション

多血小板血漿は、ますますその治癒促進特性15から17に起因する臨床応用に使用されている。本研究では、PRPは、感染予防のための新しいアプローチとして提示された。 PRPは、MRSA、MSSA、A群連鎖球菌 、および淋菌に対しても強い抗菌性を有することが見出された。感染予防のための従来の抗生物質治療と比較して、PRPの主な利点は、以下を含む：（1）現在の抗生物質療?...

開示事項

著者らは、彼らが競合する経済的利益を持っていないことを宣言します。

謝辞

The authors thank Therwa Hamza, John E. Tidwell, Nina Clovis, and Suzanne Smith for experimental assistance and Suzanne Smith for proofreading. The authors also thank John Thomas, PhD for providing the bacterial clinical isolates and John B. Barnett, PhD for his support and the use of the biological safety lab at the Department of Microbiology, Immunology and Cell Biology at West Virginia University. The authors acknowledge financial support from the Osteosynthesis and Trauma Care Foundation and National Science Foundation (#1003907). Microscope experiments and image analysis were also performed in the West Virginia University Imaging Facility, which is supported in part by the Mary Babb Randolph Cancer Center and NIH grant P20 RR016440.

Animal use for blood draws were approved by the West Virginia University Institutional Animal Care and Use Committee. All experiments were executed in compliance with all relevant guidelines, regulations, and regulatory agencies.

資料

NameCompanyCatalog NumberComments
Name of Reagent/MaterialCompanyCatalog NumberComments
Bovine thrombinKing Pharmaceuticals, Inc 60793-215-05Thrombin (bovine origin)
Calcium chlorideKing Pharmaceuticals, Inc60793-215-0510% calcium chloride
EthanolSigma-AldrichE7023
IsofluraneBaxter1001936060
Mueller Hinton brothBecton, Dickinson and Company275710
Phosphate-buffered salineSigma-AldrichD8662
Tri-sodium citrateSigma-AldrichW302600
Tryptic soy agarFisher ScientificR01202
CentrifugeKendro Laboratory Products750043077
Syringe filterMilliporeSLGP033RS

参考文献

  1. Gristina, A. G. Biomaterial-centered infection: microbial adhesion versus tissue integration. Science. 237, 1588-1595 (1987).
  2. Gristina, A. G., Costerton, J. W. Bacterial adherence to biomaterials and tissue. The significance of its role in clinical sepsis. J. Bone Joint Surg. Am. 67, 264-273 (1985).
  3. Everts, P. A., et al. Reviewing the structural features of autologous platelet-leukocyte gel and suggestions for use in surgery. Eur. Surg. Res. 39, 199-207 (2007).
  4. Marx, R. E. Platelet-rich plasma (PRP): what is PRP and what is not PRP. Implant. Dent. 10, 225-228 (2001).
  5. Toscano, N., Holtzclaw, D. Surgical considerations in the use of platelet-rich plasma. Compend. Contin. Educ. Dent. 29, 182-185 (2008).
  6. Cieslik-Bielecka, A., Gazdzik, T. S., Bielecki, T. M., Cieslik, T. Why the platelet-rich gel has antimicrobial activity?. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 103, 303-306 (2007).
  7. Yeaman, M. R. The role of platelets in antimicrobial host defense. Clin. Infect. Dis. 25, 951-970 (1997).
  8. Tang, Y. Q., Yeaman, M. R., Selsted, M. E. Antimicrobial peptides from human platelets. Infect Immun. 70, 6524-6533 (2002).
  9. El-Sharkawy, H., et al. Platelet-rich plasma: growth factors and pro- and anti-inflammatory properties. J. Periodontol. 78, 661-669 (2007).
  10. Krijgsveld, J., et al. Thrombocidins, microbicidal proteins from human blood platelets, are C-terminal deletion products of CXC chemokines. J. Biol. Chem. 275, 20374-20381 (2000).
  11. Trowbridge, C. C., et al. Use of platelet gel and its effects on infection in cardiac surgery. J. Extra Corpor. Technol. 37, 381-386 (2005).
  12. Gristina, A. G., Naylor, P., Myrvik, Q. Infections from biomaterials and implants: a race for the surface. Med. Prog. Technol. 14, 205-224 (1988).
  13. Subbiahdoss, G., Kuijer, R., Grijpma, D. W., vander Mei, H. C., Busscher, H. J. Microbial biofilm growth vs. tissue integration: "the race for the surface" experimentally studied. Acta Biomater. 5, 1399-1404 (2009).
  14. Klevens, R. M., et al. Invasive methicillin-resistant Staphylococcus aureus infections in the United States. JAMA. 298, 1763-1771 (2007).
  15. Foster, T. E., Puskas, B. L., Mandelbaum, B. R., Gerhardt, M. B., Rodeo, S. A. Platelet-rich plasma: from basic science to clinical applications. Am. J. Sports Med. 37, 2259-2272 (2009).
  16. Carlson, N. E., Roach, R. B. Platelet-rich plasma: clinical applications in dentistry. J. Am. Dent. Assoc. 133, 1383-1386 (2002).
  17. Man, D., Plosker, H., Winland-Brown, J. E. The use of autologous platelet-rich plasma (platelet gel) and autologous platelet-poor plasma (fibrin glue) in cosmetic surgery. Plast. Reconstr. Surg. 107, 229-237 (2001).
  18. Fridkin, S. K., et al. Epidemiological and microbiological characterization of infections caused by Staphylococcus aureus with reduced susceptibility to vancomycin, United States, 1997-2001. Clin. Infect. Dis. 36, 429-439 (1997).
  19. Jackson, C. R., Fedorka-Cray, P. J., Davis, J. A., Barrett, J. B., Frye, J. G. Prevalence, species distribution and antimicrobial resistance of enterococci isolated from dogs and cats in the United States. J. Appl. Microbiol. 107, 1269-1278 (2009).
  20. Murray, C. K., et al. Recovery of multidrug-resistant bacteria from combat personnel evacuated from Iraq and Afghanistan at a single military treatment facility. Mil. Med. 174, 598-604 (2009).
  21. Durr, M., Peschel, A. Chemokines meet defensins: the merging concepts of chemoattractants and antimicrobial peptides in host defense. Infect Immun. 70, 6515-6517 (2002).
  22. Hancock, R. E. Peptide antibiotics. Lancet. 349, 418-422 (1997).
  23. Dohan Ehrenfest, D. M., Rasmusson, L., Albrektsson, T. Classification of platelet concentrates: from pure platelet-rich plasma (P-PRP) to leucocyte- and platelet-rich fibrin (L-PRF). Trends Biotechnol. 27, 158-167 (2009).
  24. Kalen, A., Wahlstrom, O., Linder, C. H., Magnusson, P. The content of bone morphogenetic proteins in platelets varies greatly between different platelet donors. Biochem. Biophys. Res. Commun. 375, 261-264 (2008).
  25. Weibrich, G., Kleis, W. K., Hafner, G., Hitzler, W. E. Growth factor levels in platelet-rich plasma and correlations with donor age, sex, and platelet count. J. Craniomaxillofac. Surg. 30, 97-102 (2002).
  26. Mazzucco, L., Balbo, V., Cattana, E., Guaschino, R., Borzini, P. Not every PRP-gel is born equal. Evaluation of growth factor availability for tissues through four PRP-gel preparations: Fibrinet, RegenPRP-Kit, Plateltex and one manual procedure. Vox Sang. 97, 110-118 (2009).
  27. Lei, H., Gui, L., Xiao, R. The effect of anticoagulants on the quality and biological efficacy of platelet-rich plasma. Clin. Biochem. 42, 1452-1460 (2009).
  28. Redler, L. H., Thompson, S. A., Hsu, S. H., Ahmad, C. S., Levine, W. N. Platelet-rich plasma therapy: a systematic literature review and evidence for clinical use. Phys. Sportsmed. 39, 42-51 (2011).
  29. Whitman, D. H., Berry, R. L., Green, D. M. Platelet gel: an autologous alternative to fibrin glue with applications in oral and maxillofacial surgery. J. Oral Maxillofac. Surg. 55, 1294-1299 (1997).
  30. Anitua, E. Plasma rich in growth factors: preliminary results of use in the preparation of future sites for implants. Int. J. Oral Maxillofac. Implants. 14, 529-535 (1999).
  31. Whitman, D. H., Berry, R. L. A technique for improving the handling of particulate cancellous bone and marrow grafts using platelet gel. J. Oral. Maxillofac. Surg. 56, 1217-1218 (1998).
  32. Currie, L. J., Sharpe, J. R., Martin, R. The use of fibrin glue in skin grafts and tissue-engineered skin replacements: a review. Plast. Reconstr. Surg. 108, 1713-1726 (2001).
  33. Nikulin, A. A. Effect of calcium, thrombin and nucleotides (ADP, cAMP, cGMP) on blood platelet glycolysis and energy metabolism. Farmakol. Toksikol. 43, 585-590 (1980).
  34. Hantgan, R. R., Taylor, R. G., Lewis, J. C. Platelets interact with fibrin only after activation. Blood. 65, 1299-1311 (1985).
  35. Hantgan, R., Fowler, W., Erickson, H., Hermans, J. Fibrin assembly: a comparison of electron microscopic and light scattering results. Thromb. Haemost. 44, 119-124 (1980).
  36. Li, B., Jiang, B., Boyce, B. M., Lindsey, B. A. Multilayer polypeptide nanoscale coatings incorporating IL-12 for the prevention of biomedical device-associated infections. Biomaterials. 30, 2552-2558 (2009).
  37. Li, B., Jiang, B., Dietz, M. J., Smith, E. S., Clovis, N. B., Rao, K. M. K. Evaluation of local MCP-1 and IL-12 nanocoatings for infection prevention in open fractures. J. Orthop. Res. 28, 48-54 (2010).
  38. Boyce, B. M., Lindsey, B. A., Clovis, N. B., Smith, E. S., Hobbs, G. R., Hubbard, D. F., Emery, S. E., Barnett, J. B., Li, B. Additive effects of exogenous IL-12 supplementation and antibiotic treatment in infection prophylaxis. J. Orthop. Res. 30 (2), 196-202 (2012).

転載および許可

このJoVE論文のテキスト又は図を再利用するための許可を申請します

許可を申請

さらに記事を探す

74

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

個人情報保護方針

利用規約

一般データ保護規則

お問い合わせ

図書館への推薦

JoVE ニュースレター

研究

教育

著者

図書館員

JoVEについて

Copyright © 2023 MyJoVE Corporation. All rights reserved