준비를 한 다음 감염을 방지하기 위해 새로운 접근 방식으로 PRP<em&gt; 체외에서</emPRP의&gt; 항균 속성

요약

임플란트 - 관련 감염은 중요한 임상 합병증입니다. 이 연구는 임플란트 - 관련 감염을 방지하기 위해 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)를 사용하여 접근 방식을 설명 지속적인 혈소판 농도와 PRP를 준비 프로토콜을 제시하고, PRP의 새로 확인 된 항균 특성 및 항균 특성을 조사에 대한 관련 프로토콜을보고 체외 인치

초록

임플란트 - 관련 감염 항생제 저항, 동물과 인간 사이의 항생제 내성 박테리아의 전송과 감염을 치료의 높은 비용을 증가로 인해 점점 더 의료 산업에 더 도전 세계적되고 있습니다.

본 연구에서는, 우리는 혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)의 잠재적 인 항균 특성을 바탕으로 임플란트 - 관련 감염을 예방에 효과가있을 수 있습니다 새로운 전략을 공개. 치유를 촉진위한 잘 연구 특성으로 인해, PRP는 (생물 제품) 점점 정형 외과 수술, 치주 및 구강 수술, 악안면 수술, 플라스틱 수술, 스포츠 의학 등 임상 응용에 사용되었습니다

PRP는 임플란트 - 관련 감염을 예방 기존의 항생제 치료에 대한 고급 대안이 될 수 있습니다. PRP의 사용은 기존의 항생제 치료시에 비해 유리할 수있다PRP는 항생제 저항을 유도 할 수 있고 PRP의 항균 및 치료 - 홍보 속성이 감염 예방에 시너지 효과가있을 수 있습니다 적은 가능성이 nce. 그것은 잘 병원균과 인간의 세포가 이식 표면에 경주하는 알려져 있으며, 홍보 치유의 PRP의 속성함으로써 감염 가능성을 줄여 인간의 세포 첨부 파일을 향상 수 있습니다. 또한, PRP는 본질적으로 biocompatible하고, 안전하고 전도 할 수있는 질병의 위험에서 무료입니다.

우리의 연구를 들어, 우리는 일반적으로 정형 외과 감염에서 발견하고 PRP이 박테리아에 대한 체외 항균 속성에 있는지 여부를 검사 몇 가지 임상 박테리아 변종을 선택했습니다. 우리는 같은 혈소판 농도가 모든 샘플에 대해 얻을 수 할 수있는 두 번 원심 분리 방식을 사용하여 PRP를 준비했습니다. 우리는 일관성있는 항균 결과를 달성하고 PRP는 methi 같은 세균에 대한 시험 관내 항균 속성에 강한 것으로 나타났습니다cillin에 민감한와 methicillin - 내성 황색 포도상 구균, 그룹 연쇄상 구균과 Neisseria gonorrhoeae. 따라서, PRP의 사용은 감염을 예방하고 임플란트 - 관련 감염의 비용이 많이 드는 수술 치료의 필요성을 줄일 수있는 가능성이있을 수 있습니다.

서문

임플란트 - 관련 감염은 상당한 임상 합병증입니다. 포도상 구균 (S. 구균)이 임플란트 - 관련 감염으로부터 격리 가장 흔한 미생물 중 하나입니다. 그것은 임플란트의 표면을 커버하고 항생제 내성 감염 ^1,2으로 이어질 수있는 biofilm을 생산 할 수 있습니다. 임플란트 - 관련 감염의 치료가 자주 반복 ​​debridements과 장기간 비경 항생제 치료 장기 입원이 필요합니다. 항생제 내성의 경우, 보형물의 제거가 필요할 수 있습니다. 항생제에 대한 박테리아의 증가 저항도 등의 질병 통제 및 예방 (CDC)의 센터에 의해 참조되었습니다 "세계에서 가장 급박 한 건강 문제 중 하나입니다." 시간이, 새로운과 효과적인 항균 요법의 개발없이, 그것은 다중 약물 내성 병원균은 기존의 항생제와 untreatable 될 가능성이 있습니다. 임플란트 - 관련 예방감염 것이 중요하며, 새로운 예방 대리인 또는 접근 방법은 이러한 감염을 예방하기 위해 필요합니다.

혈소판이 풍부한 혈장 (PRP)은 뼈와 뼈 이식 치료 ^3-5으로 도움을 줄 수 30 성장 요인을 포함 autologous 혈액의 농도이다. 뼈 재생과 부드러운 조직 성숙을 향상시키는 PRP의 응용 프로그램이 점점 때문에 혈소판에 의해 발표 다양한 성장 요인의 높은 농도의 병원에서보고되었습니다.

PRP의 여러 특성은 PRP는 항균 특성에게 ^6-9있을 수 있습니다 것으로 나타났습니다. PRP는 혈소판의 큰 번호, 백혈구의 높은 농도 (세균 및 곰팡이에 대한 호스트 방어 동작을 가지고 할 수있는), 그리고 여러 항균 펩티드 ^7,8,10가 포함되어 있습니다. 심장 수술 환자의 큰 일대의 최근 연구에서,이 드러났다 그 상처 폐쇄 signif 동안 PRP-젤의 intraoperative 사용icantly 표면과 깊은 가슴 감염 ^(11)의 발생률을 감소. 이러한 이유와 관찰의 경우, 우리는 PRP는 그 잘 공부 치료 - 추진 특성 외에, 항균 특성을 가지고 가상. 감염을 방지하기 위해 PRP를 사용하는 잠재적 인 장점이 포함될 수 있습니다 :은 (i) PRP는 기존의 항생제 치료에 비해 저항을 유도 할 가능성이 적습니다. PRP의 치료 - 홍보 특성은 병원균과 인간의 세포가 이식 표면 ¹² 질주를하고 같이함으로써 감염 가능성을 줄여 세균 첨부 파일을 방지하기 위해 인감을 제공 할 수 경우, (ii) PRP는 감염 예방에 시너지 효과가있을 수 있습니다 치유를 촉진 속성을 가지고 있습니다 ^13. (III) PRP는 본질적으로 biocompatible하고, 안전하고 전도 할 수있는 질병의 위험에서 무료입니다.

우리의 장기 목표는 임플란트 - 관련 infecti을 방지하기 위해 새로운 접근 방법으로 PRP를 사용하는 것입니다기능. 본 연구의 목적은 체외 항균 속성에 PRP의를 검사하기 위해, 두 번 원심 분리 방식을 사용하여 PRP를 준비하고, 이러한 항균 속성을 평가하기위한 프로토콜을 설명하는 것이 었습니다.

프로토콜

1. 준비와 PRP의 활성화

1.1 혈액 무승부

1. isoflurane의 흡입 (유도를위한 O ₂ 2 % 유지 보수 1 %)에서 토끼를 마취.
2. 20 ML의 주사기로 2 ML 0.129 M 트라이 - 나트륨 구연산을 (anticoagulent 솔루션)립니다. 트라이 나트륨 구연산 솔루션은 50 ML 증류수 H ₂ O에 1.897 g 트라이 - 나트륨 구연산을 용해하고 0.22 μm 살균 필터로 필터링하여 준비가되어 있습니다.
3. 70 % 에탄올을 사용하여 토끼 귀를 살균.
4. 나비 바늘 (25 G) 주사기에 연결을 통해 토끼 귀 정맥에서 (예를 들면 5 ML) 혈액을 그립니다.
5. 부드러운 교반하여 트라이 나트륨 구연산 솔루션으로 피를 섞는다. 혈액 및 트라이 - 나트륨 구연산 솔루션의 볼륨 비율이 9시 1분입니다.

1.2 PRP 준비 (그림 1)

1. 50 ML 플라스틱 원심 분리기 튜브에 anticoagulated 혈액을 전송합니다. 10 μl의 나누어지는 해hemocytometry를 사용하여 기준 혈소판 수를 확인하기 위해 혈액.
2. 스윙 아웃 로터와 원심 분리기에 실온에서 10 분 (RT) 300 XG에서 혈액을 원심 분리기. 낮은 가속 및 브레이크 속도 (그림 1)을 설정합니다.
3. 원심 분리 후, 피가 3 층으로 분리된다. 아래 층은 주로 적혈구이며, 중간 층 (일반적으로 '버피 코트 "이라한다) 농축 혈소판과 백혈구로 구성하고, 상단 층은 주로 혈액의 액체 성분이 플라즈마, 그리고 혈소판 (입니다 그림 1). 세포 배양 후드에 원심 분리기 튜브를 조심스럽게 수송, 레이어를 방해하지 않습니다. 1 ML 플라스틱 pipettor를 사용하여 15 ML 플라스틱 튜브에 플라즈마의 모든 버피 코트, 그리고 2~3밀리미터 두께 적혈구 레이어를 전송합니다.
4. RT에서 15 분 3,000 XG에서 이전 샘플 두 번째 시간을 원심 분리기. 상단 층 (표면에 뜨는)는 혈소판 가난한 플라즈마 (PPP)로 간주됩니다D는 새로운 튜브로 전송됩니다.
5. PPP 2.0 X 10 ⁶ 혈소판 / μl를 (hemocytometry에 의해 결정)을 획득하는 데 사용 나머지 혈액 샘플에서 혈소판 농도를 조정하여 PRP를 구합니다.

1.3 PRP 활성화

1. 1000 IU / ML의 작업 농도에 5 ML 10 % 염화칼슘과 5,000 IU 소 트롬빈을 용해하여 PRP 활성화 솔루션을 준비합니다.
2. PRP와 PPP에 활성화 솔루션을 추가하고 반복적으로 PRP와 PPP-젤을 형성하기 위해 pipetting하여 솔루션을 섞는다. PRP 또는 PPP를 활성화 솔루션의 볼륨 비율이 1시 4분입니다.

2. 죽 곡선 분석을 사용하여 PRP의 체외 항균 시험 (그림 2)에서

1. 멸균 inoculating 루프를 사용 S. 여러 식민지를 추가 플라스틱 관 뮐러 힌튼 국물 (MHB)의 5 ML에 자사의 하룻밤 판 문화의 구균. 소용돌이가 잠시 후 37 2 시간 동안 샘플을 품다 ° C. 다음, 박테리아 미디어의 광학 밀도 분광 광도계를 사용하여 결정하고 ~ 1 이상으로 광학 밀도로 조정 된 X 10 ⁸ CFU / 미리 정해진 표준 곡선에 따라 ML.
2. 1 개 10 ⁶ CFU / ML을 취득과 얼음에 inoculums을 배치 PBS를 사용하여 100x 희석하십시오.
3. 설정 및 살균, 일회용 5 ML 왕복 아래 폴리스티렌 튜브를 라벨 및 각 관 2 ML의 최종 볼륨에 대해 표 1에 표시된 다음 예제 그룹을 준비합니다.
4. 활성화 (겔 형성)에 대한 트롬빈 솔루션 다음 폴리스티렌 튜브 먼저 PRP, PPP, 또는 PBS를 추가합니다. 다음 MHB를 추가 한 후 S. 구균의 inoculums (1 X 10 ⁶ CFU / ML) 1 × 10 ⁵ CFU / ML의 최종 농도를 얻을 수 있습니다.
5. ° C 150 rpm으로 궤도 동요와 함께 37 튜브를 품다.
6. 미리 정해진 시간 포인트 (예 : 0, 1, 2 시간)에서 반복 pipetting (이 통해 각 튜브의 솔루션을 혼합박테리아는 PRP 젤 안에 갇혀 될 수 있기 때문에 단계) 중요합니다. , 샘플의 10 μl를 멸균 0.9 %의 식염수에 순차적으로 희석하고, Tryptic 간장 한천 (TSA, 5 %의 양 피) CFU 계산을위한 플레이트로 각 희석의 100 μl 나누어지는을 피펫.
7. 37 번 밤 문화 한천 플레이트 ° C 한 다음 계산과 판 식민지를 기록합니다. 플롯 X-축과 CFU / y 축에 ML에서 시간 (시간)와 logarithimic 규모 데이터입니다.

결과

PRP는 reproducibly 두 번 원심 분리 방식 (그림 1)를 사용하여 준비가되어 있습니다. PRP는 methicillin 내성 S.에 대한 체외 항균 속성에 (CFUs에서 최대 100 배 감소) 강한 제시 찾을 수 있습니다 구균 (MRSA) (그림 3)은, 그는 일반적으로 전세계 병원 ^14에서 발견됩니다. 마찬가지로, PRP는 methicillin에 민감한 S.에 대한 강력한 항균 특성을 가지고...

토론

혈소판이 풍부한 혈장은 점점 그 치유 - 홍보 등록 ^15-17으로 인해 임상 응용에 사용되었습니다. 본 연구에서는 PRP는 감염 예방을위한 새로운 접근 방법으로 제시되었다. PRP는 MRSA, MSSA, 그룹 연쇄상 구균 및 Neisseria gonorrhoeae에 대한 강력한 항균 특성을 가지고 발견되었습니다. 기존의 항생제 치료에 비해 PRP의 주요 장점은, 감염 예방을 위해 포함 : (1) 현재 항생제 치료는 점점 ?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Bovine thrombin	King Pharmaceuticals, Inc	60793-215-05	Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride	King Pharmaceuticals, Inc	60793-215-05	10% calcium chloride
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Isoflurane	Baxter	1001936060
Mueller Hinton broth	Becton, Dickinson and Company	275710
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	D8662
Tri-sodium citrate	Sigma-Aldrich	W302600
Tryptic soy agar	Fisher Scientific	R01202
Centrifuge	Kendro Laboratory Products	750043077
Syringe filter	Millipore	SLGP033RS