PRP como uma nova abordagem para prevenir a infecção: Preparação e<em&gt; In vitro</em&gt; Propriedades antimicrobianas do PRP

Resumo

Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Este estudo descreve uma abordagem utilizando plasma rico em plaquetas (PRP) para evitar as infecções associadas implante, apresenta o protocolo para a preparação de PRP com a concentração de plaquetas constante, e relata as propriedades antimicrobianas recentemente identificados de PRP e protocolos relacionados para examinar tais propriedades antimicrobianas In vitro.

Resumo

Implante infecção associada está a tornar-se cada vez mais difícil para a indústria de cuidados de saúde em todo o mundo, devido ao aumento de resistência a antibióticos, a transmissão de bactérias resistentes aos antibióticos entre animais e seres humanos, e os elevados custos de tratamento de infecções.

No presente estudo, nós divulgamos uma nova estratégia que pode ser eficaz na prevenção de infecções associadas implante com base nas propriedades antimicrobianas potenciais de plasma rico em plaquetas (PRP). Devido às suas propriedades bem estudadas para promover a cura, PRP (um produto biológico) tem sido cada vez mais utilizado para aplicações clínicas, incluindo cirurgias ortopédicas, cirurgias periodontais e oral, cirurgias maxilo-faciais, cirurgias plásticas, medicina esportiva, etc

PRP poderia ser uma alternativa avançada para tratamentos com antibióticos convencionais na prevenção de infecções associadas implante. A utilização de PRP pode ser vantajosa em comparação com os tratamentos convencionais antibiótico since PRP é menos provável que induza a resistência aos antibióticos e antimicrobianos de PRP e curando-propriedades promotoras podem ter um efeito sinérgico na prevenção de infecções. É bem conhecido que organismos patogénicos e células humanos estão correndo para superfícies de implantes, e as propriedades de cura de PRP de promoção pode melhorar a ligação de células humanas, reduzindo assim as probabilidades de infecção. Além disso, o PRP é inerentemente biocompatível e seguro e livre do risco de doenças transmissíveis.

Para o nosso estudo, nós selecionamos várias clínicas estirpes de bactérias que são comumente encontrados em infecções ortopédicas e analisou se o PRP tem propriedades in vitro antimicrobianos contra estas bactérias. Nós preparamos PRP utilizando uma abordagem de centrifugação duas vezes o que permite que a mesma concentração de plaquetas a ser obtidos para todas as amostras. Nós conseguimos consistentes resultados antimicrobianos e descobriram que o PRP tem fortes propriedades in vitro antimicrobianos contra bactérias como methicillin sensíveis e resistentes à meticilina Staphylococcus aureus, Streptococcus do grupo A, e Neisseria gonorrhoeae. Portanto, a utilização de PRP pode ter o potencial para prevenir a infecção e para reduzir a necessidade de um tratamento pós-operatório de implante dispendioso infecções associadas.

Introdução

Implante infecção associada é uma complicação clínica significativa. Staphylococcus aureus (S. aureus) é um dos microorganismos mais comuns isoladas de implante de infecções associadas. Ele é capaz de produzir um biofilme que cobre as superfícies dos implantes, podendo levar a resistente a antibióticos ^1,2 a infecção. Tratamento de implante infecção associada freqüentemente requer hospitalização a longo prazo para desbridamentos repetidos e terapia parenteral prolongada de antibióticos. Em casos resistentes aos antibióticos, a remoção do implante pode ser necessária. A resistência crescente das bactérias aos antibióticos também foi referido pelos Centros de Controle e Prevenção de Doenças (CDC) como "um dos problemas de saúde do mundo mais prementes." Com o tempo, sem o desenvolvimento de novos e eficazes tratamentos antimicrobianos, é possível que vários fármacos patógenos resistentes será tratável com antibióticos convencionais. Prevenção de implante associadainfecção, é importante e novos agentes profiláticos ou abordagens são necessários para a prevenção de tais infecções.

Plasma rico em plaquetas (PRP) é uma concentração de sangue autólogo que contém mais de 30 fatores de crescimento que podem ajudar com osso e enxerto ósseo cura ^3-5. A aplicação de PRP para aumentar a regeneração óssea e maturação dos tecidos moles tem sido cada vez relatada em clínicas devido à sua elevada concentração de vários factores de crescimento libertados pelas plaquetas.

Várias características do PRP indicam que o PRP pode também ter propriedades antimicrobianas ^6-9. PRP contém um grande número de plaquetas, uma elevada concentração de leucócitos (os quais podem possuir hospedeiro-defesa acções contra bactérias e fungos), e vários peptídeos antimicrobianos ^7,8,10. Em um estudo recente de um grande grupo de pacientes cirúrgicos cardíacos, foi revelado que o uso intra-operatório de gel de PRP durante encerramento de feridas signifvamente diminuiu a incidência de infecção do esterno superficial e profunda ^11. Por estas razões e observações, a hipótese de que o PRP, além de suas bem estudadas cura propriedades promotoras, tem propriedades antimicrobianas. As vantagens potenciais da utilização de PRP para prevenir a infecção pode incluir: (i) O PRP é menos provável que induza a resistência em comparação com os convencionais tratamentos com antibióticos. (Ii) PRP também tem propriedades que promovem a cura e que podem ter um efeito sinérgico na prevenção de infecção; curando-promovendo PRP de propriedades podem proporcionar uma vedação para impedir a fixação bacteriana, reduzindo assim as probabilidades de infecção por agentes patogénicos e células humanos estão correndo para superfícies de implante ^{12 , 13.} (Iii) o PRP é inerentemente biocompatível e seguro e livre do risco de doenças transmissíveis.

Nosso objetivo de longo prazo é usar o PRP como uma nova abordagem para evitar implante associada infections. O objectivo deste estudo foi o de preparar PRP utilizando uma abordagem de centrifugação, duas vezes, para examinar PRP de propriedades in vitro anti-microbianos, e para descrever os protocolos para a avaliação de tais propriedades antimicrobianas.

Protocolo

1. Preparação e ativação do PRP

1,1 coleta de sangue

1. Anestesiar coelho por inalação de isoflurano (2% em O ₂ para a indução e 1% para manutenção).
2. Desenhar 2 ml 0,129 M citrato de tri-sódio (uma solução anticoagulent) para uma seringa de 20 ml. A solução de citrato de tri-sódio é preparada por dissolução de 1,897 g de citrato de tri-sódio em 50 ml de H2O _destilada e de filtragem com um filtro de 0,22 ^ M estéril.
3. Esterilizar a orelha de coelho utilizando etanol a 70%.
4. A obtenção de sangue (por exemplo, 5 ml) a partir da veia da orelha de coelho através de uma agulha de borboleta (25 G) ligada à seringa.
5. Misturar o sangue com a solução de citrato de tri-sódio, por agitação suave. A proporção de volume de sangue e de tri-sódio de solução de citrato é de 9:1.

1,2 preparação PRP (Figura 1)

1. Transferir o sangue anticoagulado a um tubo de centrífuga de 50 ml em plástico. Tomar uma aliquota de 10 ulde sangue para determinar a contagem de plaquetas de base usando hemocytometry.
2. Centrifuga-se o sangue a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente (TA) numa centrífuga com rotor swing-out. Definir a velocidade de aceleração e de travagem para baixo (Figura 1).
3. Após a centrifugação, o sangue é separado em três camadas. A camada inferior é de glóbulos vermelhos, principalmente, a camada média (geralmente referido como o "buffy coat") é composta por concentrado de plaquetas e leucócitos, e a camada superior é, principalmente, o plasma, o qual é o componente líquido do sangue e plaquetas ( Figura 1). Cuidadosamente transportar o tubo de centrífuga de um capuz de cultura de células, não perturbar as camadas. Transferir todo o plasma, buffy coat, e 2-3 mm de espessura da camada de células vermelhas do sangue para um tubo de plástico de 15 ml usando uma pipeta de plástico de 1 ml.
4. Centrifugar a amostra transferida uma segunda vez a 3000 xg durante 15 min à TA. A camada superior (sobrenadante) é considerado plasma pobre em plaquetas (PPP) ad é transferida para um novo tubo.
5. Obter PRP, ajustando a concentração de plaquetas na amostra de sangue restante utilizando PPP para se obter 2,0 x 10 ⁶ plaquetas / ul (determinado por hemocytometry).

1,3 ativação PRP

1. Preparar PRP solução de activação através da dissolução de 5,000 UI de trombina bovina, com 5 ml de cloreto de cálcio a 10% para a concentração de trabalho de 1000 IU / ml.
2. Adicionar a solução de activação para PRP e PPP, e misturar a solução por pipetagens repetidas para formar PRP e PPP-gels. A proporção em volume da solução de activação de PRP ou de PPP é 1:4.

2. In vitro Teste Antimicrobiano de PRP Usando Kills Ensaio de curva (Figura 2)

1. Usando um loop de inoculação estéril, adicionar várias colónias de S. aureus a partir de uma cultura da placa durante a noite em 5 ml de caldo Mueller Hinton (MHB) num tubo de plástico. Vortex brevemente e então incubar a amostra durante 2 horas a 37 ° C. Próximo, A densidade óptica dos meios de bactérias foi determinada utilizando um espectrofotómetro e ajustadas para uma densidade óptica igual a ~ 1 x 10 ⁸ UFC / ml com base na curva padrão pré-determinado.
2. Prepare uma diluição de 100 vezes usando PBS para se obter 1 x 10 ⁶ CFU / ml e colocar os inóculos em gelo.
3. Configurar e rotular estéreis descartáveis ​​de 5 ml, os tubos de fundo redondo de poliestireno, e preparar os seguintes grupos de amostras como indicado na Tabela 1, para um volume final de 2 ml em cada tubo.
4. Adicionar PRP, PPP, ou PBS em primeiro lugar aos tubos de poliestireno, seguida da solução de trombina para a activação (formação do gel). Em seguida, adicione MHB e, em seguida, o S. inóculos aureus (1 x 10 ⁶ CFU / ml) para se obter a concentração final de 1 x 10 ⁵ CFU / ml.
5. Incubar os tubos a 37 ° C com agitação orbital a 150 rpm.
6. Em pontos de tempo pré-determinados (por exemplo, 0, 1 e 2 h), misturar as soluções de cada um dos tubos através de pipetagem de repetição (istopasso é importante uma vez que as bactérias podem ser presos no interior do gel PRP). Tomar 10 ul de amostra, dilua serialmente com solução salina estéril a 0,9%, e pipetar uma alíquota de 100 ul de cada diluição sobre um meio de ágar de soja tríptico (TSA, com sangue de ovelha a 5%) para a contagem de CFU placa.
7. Cultura das placas de agar durante a noite a 37 ° C, em seguida, contar e registar as colónias da placa. Os dados do gráfico em escala logarítmica, com o tempo (hr) no eixo x e CFU / ml no eixo y.

Resultados

PRP é reprodutivelmente preparados usando uma abordagem de centrifugação duas vezes (Figura 1). PRP é encontrado para apresentar forte (até 100 vezes a redução em UFCs) propriedades in vitro antimicrobianas contra resistente à meticilina S. aureus (MRSA) (Figura 3), que é vulgarmente encontrado em hospitais em todo o mundo ^14. Da mesma forma, o PRP tem fortes propriedades antimicrobianas contra meticilina sensível S. aureus (MSSA)...

Discussão

Plasma rico em plaquetas tem sido cada vez mais utilizado para aplicações clínicas, devido às suas propriedades promotoras de cura ^15-17. No presente estudo, o PRP foi apresentado como uma nova abordagem para a prevenção de infecção. PRP foi encontrado com fortes propriedades antimicrobianas contra MRSA, MSSA, Grupo A Streptococcus e Neisseria gonorrhoeae. As principais vantagens do PRP, em comparação com os convencionais tratamentos com antibióticos, para a prevenção de infecç...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
Bovine thrombin	King Pharmaceuticals, Inc	60793-215-05	Thrombin (bovine origin)
Calcium chloride	King Pharmaceuticals, Inc	60793-215-05	10% calcium chloride
Ethanol	Sigma-Aldrich	E7023
Isoflurane	Baxter	1001936060
Mueller Hinton broth	Becton, Dickinson and Company	275710
Phosphate-buffered saline	Sigma-Aldrich	D8662
Tri-sodium citrate	Sigma-Aldrich	W302600
Tryptic soy agar	Fisher Scientific	R01202
Centrifuge	Kendro Laboratory Products	750043077
Syringe filter	Millipore	SLGP033RS