הצמד תיקון נייד לכל חוקר את המנגנונים של גירוי עצבי אינפרא אדום

Summary

גירוי עצב אינפרא אדום הוצע כחלופה לגירוי חשמלי במגוון רחב של סוגי עצב, כוללים אלה הקשורים למערכת השמיעה. פרוטוקול זה מתאר שיטת תיקון מהדק ללימוד המנגנון של גירוי עצב אינפרא אדום בתרבות של נוירונים שמיעתיים ראשוניים.

Abstract

זה כבר הוכיח בשנים האחרונות כי אור לייזר פעם, אינפרא אדום יכול לשמש כדי לעורר תגובה חשמלית ברקמה עצבית, ללא תלות בכל שינוי נוסף של רקמת המטרה. גירוי עצבי אינפרא אדום כבר דיווח במגוון רחב של רקמה עצבית היקפית וחושית in vivo, בעניין מסוים שמוצג בגירוי של תאי עצב בעצב השמיעה. עם זאת, בעוד אח"י הוכח לעבוד בהגדרות אלה, המנגנון (או מנגנונים) שבאמצעותו אור אינפרא אדום גורם לעירור עצבי כיום אינו מובן היטב. הפרוטוקול המובא כאן מתאר את כל שיטת תיקון מהדק תא שנועדה להקל על החקירה של גירוי עצבי אינפרא אדום בנוירונים שמיעתיים ראשוניים בתרבית. על ידי ביסודיות המאפיין את התגובה של תאים אלה לתאורת לייזר אינפרא אדום במבחנה בתנאים מבוקרים, זה עשוי להיות אפשרי כדי להשיג הבנה משופרת של Physica היסודיl ותהליכים ביוכימיים שבבסיס גירוי עצבי אינפרא אדום.

Introduction

תחומי bionics נוירופיזיולוגיה והרפואי להסתמך בכבדות על טכניקות המאפשרות גירוי לשליטה של ​​תגובות חשמליות ברקמה עצבית. בעוד גירוי חשמלי נשאר תקן הזהב בעירור עצבי, הוא סובל ממספר חסרונות, כגון נוכחות של חפצי גירוי בעת הקלטת תגובות עצביות, וחוסר גירוי ספציפי בשל התפשטות נוכחית לתוך רקמה הסובבת ^1.

בשני העשורים האחרונים שראו את הפיתוח של טכניקות גירוי אופטי תיווך ^2. כמה מטכניקות אלה דורשות שינוי של רקמות היעד, או באמצעות תוספת של מולקולה מסוימת (מולקולות כלוב למשל) ³ או צורה כלשהי של מניפולציה גנטית (למשל optogenetics) ^4, אף אחת מהן הן קלים ליישום מחוץ למסגרת מחקר. עניין מיוחד ולכן הוא גירוי עצבי אינפרא אדום (INS), wherebרקמה העצבית Y היא נרגשת על ידי אור לייזר אינפרא אדום פעם. יש אח"י הפוטנציאל להתגבר רבים מהחסרונות של גירוי חשמלי על ידי הפעלת גירוי של רקמה עצבית ² מאוד ספציפי, ללא מגע. עם זאת, בעוד אח"י הודגם בהצלחה במגוון רחב של הגדרות in vivo, המנגנון המדויק של עירור נשאר לא ברור.

כמה פרסומים האחרונים הראו התקדמות לקראת גילוי המנגנון עומד מאחורי אח"י ^5-7. חימום מהיר עקב ספיגה של אור לייזר על ידי מים שנראה לשחק תפקיד מפתח. עם זאת, מעבר לכך קונסנסוס הוא עדיין לא הגיע. שפירא ואח'. ⁷ להציע מנגנון כללי ביותר לפיה חימום מהיר גורם להפרעות בהפצה של חלקיקים טעונים הסמוכים לקרום התא, מה שמוביל לשינוי בקיבול של קרום התא ושלילת הקוטביות שלאחר מכן. בנוסף, אלברט ואח'. ⁵ טוענים כי laseחימום המושרה R מפעיל מחלקה מסוימת של טמפרטורת תעלות יונים הרגישות (הקולטן החולף ערוצי vanilloid פוטנציאליים), המאפשר ליונים לעבור דרך קרום התא. בשלב זה לא ברור כיצד מנגנונים אלה לשלב, או אם אכן יש גורמים נוספים שעדיין לא זוהה.

למרות מספר קטן של פרסומים (הפניות ^5,7-9) חקרו אח"י במבחנה, הרוב המכריע של עבודה שפורסם בתחום זה בוצע in vivo (למשל ^1,6,10-18 הפניות). גירוי אינפרא אדום של נוירונים שמיעתיים כבר שטח של עניין מיוחד, בשל היישומים האפשריים בשתלי שבלול ^10,14-18. בעוד בניסויי vivo הם חשובים כדי לוודא את היעילות של הטכניקה במסגרות שונות, הרמה המוגברת של שליטה המוענקת על ידי ניסויים במבחנה צפוי להוביל להבנה מפורטת יותר של mechליברטריאניות אחראית לאח"י. דו"ח זה מתאר את ההכנה של נוירונים בתרבית הגנגליון ספירלה לחקירות מהדק תיקון, כמו אלה יכולים לשמש כדי לחקור מנגנונים בסיסיים גם בעת קישור לגוף הגדול של נתונים קיימים ממערכת השמיעה.

טכניקת מהדק התיקון היא כלי מצוין לחקירות של תופעות אלקטרו, לספק אמצעי הקלטת פעילות חשמלית בתאים בודדים ולומד את תרומתם של זרמי ¹⁹ הבודדים המשמשים כבסיס. כאשר טכניקה זו מיושמת לאורווה בהכנה במבחנה של נוירונים העיקרי, כגון תאי עצב הגנגליון ספירלה בתרבית, היא מציעה את ההזדמנות ללמוד לעומק את המנגנונים שבאמצעותם פעילות עצבית היא בשליטה ומניפולציה.

הפרוטוקולים המפורטים בשיטות מתאר בעבודה זו לחוקרת את ההשפעה של גירוי לייזר על התכונות החשמליות של תאי עצב הגנגליון ספירלה באמצעות מהדק תיקוןהקלטות. הגישה מבוססת על לייזר סיב מצמידים ולא לייזר ללא מרחב, מאפשרת תפעול בטוח יותר, כמו גם קל יותר לשחזור יישור ללא הצורך לשנות את תצורת מיקרוסקופ הרגילה. על בסיס הפרוטוקולים הללו, זה צריך להיות אפשרי לביצוע מגוון רחב של ניסויים במטרה בצורה ברורה יותר על מנת לקבוע את המנגנון או מנגנונים מאחורי אח"י.

Protocol

1. תרבות של נוירונים גנגליון ספירלה

1. לעקר עגול קטן (בקוטר 10 מ"מ לדוגמה) coverslips זכוכית ומלקחיים מעוקלים בחיטוי. העבר את coverslips מעוקר לתוך בארות בודדות של צלחת סטרילית 4-טבעת 35 מ"מ פטרי או צלחת 4 היטב, תוך שימוש במלקחיים מעוקרים. החלת 150 μl של פולי-L-ornithine (500 מיקרוגרם / מ"ל) והעכבר laminin (0.01 מ"ג / מ"ל) למשטח העליון של coverslip והמקום באינקובטור (37 מעלות צלזיוס) לתקופה של עד 48 שעות. להבטיח כי את coverslips לא יצוף מתחתית הבאר.
2. הכן 50 תקשורת Neurobasal סטריליים מ"ל (NBM) לכל תרבות עצבית: 47.5 מיליליטר Neurobasal, 0.5 מ"ל N ₂ תוספת, תוספת 1 ​​מ"ל B27, 0.5 L-גלוטמין מ"ל, ו0.5 פניצילין, סטרפטומיצין מ"ל. הערה: אפשר להקפיא תוספי, מאוחסן ב -20 ° C והוסיף לתקשורת ביום הנדרש.
3. לנתק את תאי עצב הגנגליון ספירלה מגורי חולדת 4-7 שלאחר הלידה יום כפי שתואר לעיל ^20,21,ing שניהם (טריפסין 0.025% 0.001% וDNase אני) אנזימטי וטכניקות מכאניות. עיין Whitlon et al. ^-22 ויירה ואח'. ²³ לנהלים מפורטים של תרבות ספירלת גנגליון נוירון, או פארקר et al. ²⁴ להפגנה של בידוד כישור.
4. לשאוב כל פתרון poly-L-ornithine/laminin שנותר מאת coverslips ולשטוף בקצרה עם NBM.
5. הוסף 150-200 μl של ההשעיה תא עצב גנגליון הספירלה ניתקה את coverslips ולמקום לתוך אינקובטור (37 מעלות צלזיוס, 10% CO _2). הערה: ניתן להכין עד 20 coverslips מהמלטה ממוצעת של 8 גורי חולדה.
6. ארבע שעות אחרי נוירונים ציפוי, לשאוב את הפתרון להסרת תא פסולת ולהחליף עם NBM הטרי חימם μl 150-200. הערה: תקשורת עשויה לדרוש חידוש יומי כדי למנוע התייבשות.
7. לחזור coverslips לחממה עד נדרשים עבור קלטות אלקטרו. הערה: ספירלה ניתקהתרבויות נוירון גנגליון יכולות לשמש לניסויי אלקטרו ארבע שעות לאחר ניתוק ולעד יומיים לאחר מכן. זמן במבחנה צריך להילקח בחשבון בעת הניתוח של תוצאות. לחדש NBM כל 24-48 שעות.

2. הכנה להקלטות מהדק תיקון

1. הכן את פתרונות
   1. פתרון תאי (micropipette): 115 מ"מ K-גלוקונאט, 7 מ"מ KCl, 10 HEPES מ"מ, 0.05 מ"מ EGTA, 2 מ"מ Na ₂ ATP, 2 מ"מ MgATP, 0.5 מ"מ Na ₂ GTP (להתאים ל-pH 7.3 עם KOH; להסתגל ל295 / ק"ג mOsmol עם סוכרוז). לעבור את הפתרון באמצעות סינון סטרילי (0.2 מיקרומטר) ומחלקים ל200 aliquots μl להיות מאוחסן ב -20 ° C עד ליום ההקלטה.
   2. פתרון תאי (אמבטיה): 137 מ"מ NaCl, 5 מ"מ KCl, 2 מ"מ CaCl _2, 1 מ"מ MgCl _2, 10 HEPES מ"מ, גלוקוז 10 מ"מ (להתאים ל-pH 7.4 עם NaOH; להסתגל ל300-310 mOsmol / ק"ג עם סוכרוז) . פתרון זה הוא עשה ביום ההקלטה.
2. הכן micropipettes הקלטה עם התנגדות של 2-6 MΩ. אנו משתמשים בליזר CO ₂ חולץ (P-2000; מכשירי סאטר) והתכה של זכוכית בורה (קוטר 1.0 מ"מ חיצוני; קוטר 0.58 מ"מ פנימי, אורך 75 מ"מ).
3. הכן את לייזר. פרוטוקול זה מיועד לשימוש עם סיבי מצמידים לייזר, כגון גירוי עצב אינפרא אדום 1870 ננומטר מOptoTech P / ל ' הסיב האופטי המשמש למשלוח אור בניסויים שלנו הוא סיב מיקרומטר 200/220 ליבה / שכבת מגן קוטר סיליקה עם צמצם מספרי של 0.22 ומחברים FC-PC בשני קצותיו (AFW טכנולוגיות MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). את מיתרי התיקון נחתכו במחצית כדי לייצר שתי צמות סיבים (connectorized כלומר בקצה אחד והבקיע בשני). את ההשפעות של קוטר ליבת סיב וצמצם מספרי על שינויי טמפרטורה מושרה לייזר כבר נדונו בהרחבה על ידי תומפסון ואח'. ²⁵
   1. קליב קצה סיב משלוח האור באמצעות טכניקות סטנדרטיותולהבטיח כי הקצה המתקבל הוא באיכות גבוהה על ידי התבוננות במיקרוסקופ אופטי (כלומר הקצה צריך להיות ניצב לציר הסיבים ויופיעו שטוח על בדיקה חזותית). חבר את סיבי האור למסירת פלט סיבי מצמידים של לייזר באמצעות הגירוי מתאים באמצעות מחבר (למשל Thorlabs ADAFC2).
   2. למדוד את כוח לייזר הפלט מהקצה ביקע של סיבי משלוח האור באמצעות מכשיר מתאים (למשל עם FieldMate קוהירנט LM-3 גלאי ראש). מומלץ לבדוק את כוח לייזר בכל פעם שמשלוח סיבי האור הוא ביקע או התאמה משמעותית הוא עשה לליזר (לדוגמא תחבורה ממעבדה אחת לשנייה).
   3. הכנס סיבי אספקת אור לצ'אק סיבים או מכשיר שווה ערך ולהדביק את צ'אק לmicropositioner המתאים. חשוב להיות מסוגל לקבוע את זווית θ שהסיב האופטי עושה עם coverslip במדויק. angl זהניתן למדידה בדואר על ידי לקיחת תצלום של ההסדר הניסיוני ושימוש בתוכנות עיבוד תמונה (למשל ImageJ) כדי להשיג את הזווית. זווית θ (או טווח זוויות אפשריות) היא מוגבלת בעיקר על ידי מגבלות מרחביות של הסדר ניסיוני - במיוחד במיקרוסקופ. ערכים אופייניים של θ בניסויים שלנו (המבוסס על מיקרוסקופ זקוף) הם סביב 36 מעלות, לעומת זאת זווית האופטימלית עשויה להיות שונה באופן משמעותי עבור setups חלופי (למשל אלה באמצעות מיקרוסקופ הפוכה).
   4. ליצור קשרים בין מערכת תיקון מהדק נתונים הרכישה (למשל Digidata 1440A, התקנים מולקולריים) כפי שמוצג באיור 2 והליזר. היציאה הדיגיטלית ממערכת נתונים רכישת מהדק התיקון צריכה להיות מחוברת לליזר באמצעות מחולל אותות חיצוניים, כך שניתן להגדיר פרמטרים דופק לייזר עצמאיים של מערכת איסוף הנתונים. לחלופין פלט זה יכול להיות מחובר ישירות לנהג לייזר (המחייב את אורך הפולס ושיעור החזרה שייקבעו על ידי תוכנת רכישת נתונים). בכל מקרה, את האות המשמשת להפעלת לייזר צריכה להיות מחוברת בחזרה לקלט של מערכת רכישת נתונים על מנת להבטיח כי העיתוי והאורך של פעימות לייזר ניתן להקליט במקביל לאות אלקטרו.

3. הקלטות מהדק תיקון לחקירת של אח"י

1. מלא את המכל המתאים של מערכת זלוף עם פתרון תאי ולהתאים את קצב הזרימה לספק טפטוף של האמבטיה בשיעור של 1-2 מ"ל / דקה. אנו משתמשים בגרוויטציה מערכת (בקבוק aspirator, שסתום קורט, וצינור PE) עם דוד בשורה כדי לאפשר חימום מהיר של הפתרון, ומשאבת peristaltic להסיר פתרון בילה על ידי יניקה.
2. מניחים coverslip עם תאים בתרבית לתוך תא ההקלטה (אמבטיה) של מיקרוסקופ זקוף. באמצעות מטרת מים טבילת ההגדלה גבוהה (ה. גרם. 40X) ושלב בניגוד (לעומת פער התערבות למשל או ניגוד שיפוע Dodt), מבחינה ויזואלית לאתר את תאי עצב הגנגליון הספירלה בתוך התרבות. נוירון גנגליון ספירלה טיפוסי הוא שלב בהיר, עגול וכ 15 מיקרומטר בקוטר עם גרעין בולט, כפי שמוצג באיור 1 א.
3. ברגע שתא עצב כבר נמצא, לעבור למטרה בהגדלה נמוכה (למשל 10X) ולאתר את היעד בתוך נוירון שדה הראייה.
4. הזז את הסיב האופטי משלוח האור למקומו באמצעות ההליך הבא (או שווה ערך):
   1. השתמש micropositioner להעביר סיבי הפלט עד הקצה קרוב לנוירון היעד בשני המישורים האופקיים ואנכיים. המצב האנכי של קצה הסיב יכול להיות מאומת על ידי נע מעלה ומטה האובייקטיבי (סריקת המיקוד).
   2. לעבור בחזרה למטרת ההגדלה הגבוהה ולמקם את הקצה של הסיב האופטי בתפקידו המיועד בסמוך לtהוא נוירון (ראה איור 2 הבלעה). בעת כוונון המיקום האנכי של הסיבים, חשוב שהקצה התחתון של הסיבים מונח על (כלומר רק נגיעה) coverslip, כדי למזער את אי הוודאות במיקום של הסיבים. היישור אופטימלי במישור האופקי יהיה תלוי בזווית θ שהסיבים עושה עם coverslip והרדיוס של R הסיבים. על מנת למקם את הסיב כך שהמרכז של נוירון היעד שוכן לאורך ציר הסיבים, מרחק האופקי בין הקצה העליון של הסיבים ותא המטרה צריך להיות
      Δ _target = R (cosec θ - 2 חטא θ),
      שבו ערכים שליליים היו מציינים כי את סככות סיבים האופטיות לתא. כאשר יישור הסיבים, מרחק של _יעד Δ בין הקצה העליון של הסיבים והמרכז של נוירון יכול להיות מושגת על ידי כ בדיקה חזותית. עם זאת _יעד Δ נועדתשמש כקו מנחה גס בלבד. מיצוב הסיבים כך שהמרחק בפועל Δ בין הקצה העליון של הסיבים והמרכז של הנוירון מדידה שונה מΔ _היעד (כמו באיור 1) יכול לספק תובנות לגבי ההשפעה של שניהם עקירת רדיאלי (כלומר מהמרכז עקירת קורה) וצירי (כלומר לאורך ציר הסיבים) של הקרן ביחס לנוירון היעד. לדוגמה, הגדרת Δ ≈ 0 יהיו צפויים להגדיל את הטמפרטורה המקומית באזור של התא - כלומר מאז פרופיל הקרן לסיבי multimode טיפוסיים הוא מקורב היטב על ידי הפצה עליונה כובע ^26, הירידה באנרגיה נספגת באופן מקומי (טמפרטורה) בשל עקירה ממרכז האלומה הוא מינימאלי בהשוואה לעלייה באנרגיה נספגת מהזזת פני סוף הסיב קרוב יותר לתא.
      אמנם יש להקפיד למקם את הסיבים בצורה מדויקת וrepeatably כפוssible באמצעות רמזים חזותיים, מדידה מדויקת של מיקום הסיבים יחסית ליעד נוירון (למשל Δ) הוא בעל חשיבות גדולה יותר ממיקומה במרחק קבוע מראש משם. ניתן לקבוע Δ (עם חוסר ודאות מרבי משוער של ± 3 מיקרומטר) על ידי ניתוח תמונה כמתואר בשלב 3.8.2 של הפרוטוקול. בכמה ניסויים ^5,8, כבר מצמידים מקורות אור לבנים דרך הסיב על מנת למקד את התא הרצוי. גישה זו נמצאה כיעיל בהתקנת מיקרוסקופ הזקופה, כעוצמת האור מפוזר מאזור היעד הייתה נמוכה יחסית בזוויות הרדודות האלה (θ).
   3. ברגע שהסיבים הוא במיקום, להזיז אותו על ידי סכום ידוע כדי לאפשר מיצוב ברור של micropipette. הסיבים אז יכולים להיות חזרו לעמדתו המקורית בעת הקלטה עצבית מושגת.
5. מלא micropipette עם פתרון תאי ובאופן מאובטח שיתאים למקומו על הראשיםכאחוז מהמגבר (כגון התקני 700B, מולקולריים Multiclamp). באמצעות צינור המחובר לצדו של בעל microelectrode, להחיל כמות קטנה של לחץ חיובי כדי למנוע סתימה של micropipette.
6. באמצעות micromanipulator, הזז את micropipette למקום בדיוק מעל נוירון היעד.
7. פרוטוקול לכל הקלטות סלולריים:
   1. החל 10 אלפיות שנייה, 10 mV כיכר גל דופק (מבחן חותם למשל) במצב מתח מהדק של המגבר ולהתאים את פוטנציאל micropipette (פיפטה קיזוז) של האות לתחילת המחקר 0 NA. גם מבחן החותם צריך לשמש כדי לקבוע אם ההתנגדות של microelectrode נמצאת בטווח הרצוי (למשל 2 - 6 MΩ).
   2. תוך מעקב ההתנגדות, השתמש התאמות קנס של micromanipulator למקם micropipette עדינות על פני השטח של תא עצב היעד. כאשר micropipette נמצא במגע עם העצב, ההתנגדות תגדיל (על ידי ~ 0.5-1 MΩ). אניmmediately בעקבות עליית ההתנגדות, הסר את לחץ הנוזל החיובי וליישם את לחץ שלילי קטן. ברגע שהתנגדות עברה 10 - 20 MΩ, לתקן את קרום הפוטנציאל לרמה מחזיקה (למשל סביב -60 mV).
   3. התנגדות האלקטרודה צריכה להמשיך לעלות עד שהוא עולה על GΩ 1, מסמן כי חותם יעיל (שמכונה 'gigaseal') כבר נוצר בין קרום התא וmicropipette. בשלב זה, להסיר את כל לחץ הנוזל מmicropipette.
   4. ברגע שgigaseal כבר נוצר, השתמש בפולסים קצרים (הנוכחיים 25 עד 100 μsec; 1 V) או קטניות קצרות של לחץ נוזל שלילי לקרע של קרום התא ולהשיג את כל תצורת תא.
   5. רשום את קיבול הקרום, התנגדות והתנגדות סדרת קלט כפי שיקבע מעקומת מעריכי מצויד הנוכחי במהלך בדיקת דופק החותם. למזער את ארעיים קיבול על ידי התאמת בקרות CpFast וCpSlow על המגבר, אז switcשעות מגבר לכל מצב תא, ולפצות את הקיבול והתנגדות עד נוכחי שטוחה הוא ציין במהלך בדיקת החותם. החלת פיצוי התנגדות סדרה (~ תיקון 70%; 70% חיזוי), התאמת בקרות קיבול והתנגדות כדי לשמור על תגובת חותם מבחן שטוחה.
   6. מעבר למצב נוכחי מהדק במגבר. שימו לב לפוטנציאל הממברנה במנוחה (בהעדר ההזרקה הנוכחית). הגדרה נוכחית מחזיק לייצב את פוטנציאל הממברנה ברמה הרצויה (למשל -60 mV). לנטרל את קיבול פיפטה ולהתאים את איזון הגשר כדי לאזן את הירידה במתח.
   7. בדקו את מאפייני הירי של נוירון על ידי גירוי עם depolarizing הנוכחי (10-200 הרשות הפלסטינית ב10 צעדי הרשות הפלסטינית; 300 אלפיות משך זמן).
8. 1. להזיז את גב הסיב האופטי למקומו בסמוך לתא העצב. שימוש בתוכנת הדמיה מצמידים את מצלמת CCD, ללכוד תמונות של העמדה של הסיבים ביחס לנוירו היעדn, תוך התמקדות במישור של נוירון בתחילה, ולאחר מכן, בקצה העליון של הסיבים אופטיים (ראה איור 1).
   2. על ידי ניתוח שלאחר מכן מהתמונות שהתקבל (למשל 1b דמויות ו1 ג') ניתן לקבוע באופן מדויק Δ (עמדת הקצה העליון של קרוב המשפחה הסיב האופטי למרכז נוירון היעד). ברגע שΔ ידוע, ניתן לחשב פרמטרים כגון מרחק מהפנים סוף הסיבים לנוירון היעד (לאורך ציר הסיבים) z והעקירה הרדיאלי של נוירון ממרכז r δ הקרן באמצעות יחסים טריגונומטריות פשוטים:
      Z = R חטא 2θ + cos θ Δ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ חטא θ) ² + δy ^{2) 1/2,}
      בי δy הוא המרחק בין ציר הסיבים ומרכז נוירון כפי שניתן לראות מלמעלה למשל SE (דואר איור 1).
      ניתוח צריך לקחת בחשבון וריאציות positional מתא לתא, כפי שהידע מדויק של מיקום פרמטרים אלה ייתכן שיהיה צורך לפתור את מחלוקות אפשריות בין תהליכי גירוי ^25.

4. ניסויי INS

1. בעת הקלטת נתונים אלקטרו באו מהדק נוכחי או תצורות מהדק מתח, הפעל את לייזר הגירוי בפרמטרים הרצויים (למשל חשמל, אורך הפולס, שיעור החזרה וכו '). עם לייזר שלנו, כוח האופטי נשלט באמצעות הזנה ישירה לנהג לייזר והיא מצוינת באופן ידני לפני כל הקלטה. אורך הפולס ושיעור החזרה יכולים להיות נשלטו על ידי מי ממחולל אותות חיצוני או תוכנת רכישת נתונים (כמתואר בשלב 2.3.4). ודא שנתונים הם משני ערוץ מהדק התיקון וערוץ הדק לייזר.

פעימות לייזר עם אורכים הנעיםמכל 500 μsec עד 15 אלפיות השני ואנרגיות של 0.25-5 ~ mJ לדופק בדרך כלל תשואת תגובות חשמליות הניתנות למדידה. הגדרת שיעור החזרה של פעימות לייזר כדי להיות הרץ 1 פחות או עשויה להיות שימושית עבור ניסויים ראשוניים, שכן הוא יהיה למזער את ההשפעות של פרמטר זה. תוצאות אופייניות המראות את השינוי באות המוקלטת מוצגות בסעיף הבא.

תוצאות

נוירונים הגנגליון ספירלה להגיב לתאורת לייזר עם צורות גל הדיר בשני תצורות הקלטה נוכחי, מהדק מתח ומהדק. 3a איור מראה שינויים אופייניים בזרימה הנוכחית על פני קרום תא בתגובה ל2.5 אלפיות שנייה, 0.8 mJ דופק לייזר (תגובה ממוצעת מ6 פעימות לייזר, שחזרו במרווחים של 1 SEC) עם פו...

Discussion

שימוש בפרוטוקולים שתוארו במאמר זה ניתן לחלץ ונוירונים הגנגליון ספירלה תרבות ולחקור לייזר עורר פעילות חשמלית על ידי ביצוע ניסויים שלמים מהדק תיקון סלולרי. כאשר נעשה שימוש במבחנה, טכניקת מהדק התיקון מספקת רמה של שליטה על פרמטרים של ניסוי שזה לא אפשרי בגוף חי.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
			Table 1. Cell culture materials and equipment.
			Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
			Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
			Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
			Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
			Table 4. Laser equipment.