Whole Cell Patch-Clamp für erforschen die Mechanismen der Infrarot Neural Stimulation

Zusammenfassung

Infrarot Nervenstimulation als Alternative, eine elektrische Stimulation in einem Bereich von Nerven-Typen, einschließlich derjenigen mit auditorischen System zugeordnet vorgeschlagen. Dieses Protokoll wird ein Patch-Clamp-Verfahren zur Untersuchung des Mechanismus der Infrarot Nervenstimulation in einer Kultur von primären auditorischen Nervenzellen.

Zusammenfassung

Es hat sich in den letzten Jahren gezeigt, dass gepulste Infrarot-Laserlicht verwendet werden, um elektrische Reaktionen in neuronalen Gewebe hervorzurufen, unabhängig von einer weiteren Abwandlung der Zielgewebe. Infrarot neuronale Stimulation in einer Vielzahl von peripheren und sensorischen neuronalen Gewebe wurde in vivo angegeben, wobei besonderes Interesse an der Stimulation der Nervenzellen im auditorischen Nervenzellen gezeigt. Während jedoch INS gezeigt wurde, dass in diesen Einstellungen funktionieren, ist der Mechanismus (oder Mechanismen), durch die Infrarot-Licht bewirkt neuronalen Erregung momentan nicht gut verstanden. Das Protokoll hier beschreibt eine ganze Zelle Patch-Clamp-Methode entwickelt, um die Untersuchung von Infrarot neuronale Stimulation in kultivierten primären auditorischen Neuronen zu erleichtern. Durch gründliches Charakterisierung der Reaktion dieser Zellen auf Infrarot-Laserbelichtung in vitro unter kontrollierten Bedingungen kann es möglich sein, ein verbessertes Verständnis der grundlegenden Physica gewinnenl und biochemischen Prozessen zugrunde liegenden neuronalen Infrarot-Stimulation.

Einleitung

Die Felder der Neurophysiologie und medizinischen Bionik verlassen sich stark auf Techniken, die steuerbare elektrische Stimulation der Antworten in Nervengewebe zu ermöglichen. Während elektrische Stimulation bleibt der Goldstandard in der neuronalen Erregung, leidet es an einer Reihe von Nachteilen wie das Vorhandensein der Stimulation Artefakte bei der Aufzeichnung neuronalen Antworten und einen Mangel an Stimulation Spezifität aufgrund der Ausbreitung von Strom in das umliegende Gewebe ^ein.

Die letzten zwei Jahrzehnte haben die Entwicklung von optisch vermittelten Stimulation Techniken ² zu sehen. Einige dieser Techniken ist eine Änderung des Zielgewebes, entweder durch Zugabe eines bestimmten Moleküls (zB Käfig Moleküle) ³ oder irgendeine Form der genetischen Manipulation (z. B. optogenetics) ^4, die beide nicht leicht außerhalb eines Forschungssetting gelten. Von besonderem Interesse ist daher Infrarot Nervenstimulation (INS), whereby Nervengewebe durch gepulste Infrarot-Laserlicht angeregt. INS hat das Potenzial, viele der Mängel der elektrischen Stimulation, indem du hochspezifische, berührungslose Stimulation von Nervengewebe ² überwinden. Während jedoch INS wurde erfolgreich in einer Vielzahl von Einstellungen in vivo gezeigt, bleibt der genaue Mechanismus der Anregung unsicher.

Einige neuere Veröffentlichungen haben Fortschritte bei der Aufdeckung der Mechanismus hinter INS ^5-7 gezeigt. Schnelle Erwärmung durch Absorption des Laserlichts durch Wasser scheint eine wichtige Rolle zu spielen. Doch jenseits dieser Konsens ist noch nicht erreicht. Shapiro et al. ⁷ schlagen eine sehr allgemeine Mechanismus, durch schnelle Erwärmung verursacht eine Störung in der Verteilung der geladenen Partikel angrenzend an die Zellmembran, was zu einer Änderung der Kapazität der Zellmembran und nachfolgende Depolarisation. Darüber hinaus Albert et al. ⁵ behaupten, dass laser induzierte Erwärmung aktiviert eine spezifische Klasse von temperaturempfindlichen Ionenkanälen (transient receptor potential vanilloid Kanäle), so dass Ionen durch die Zellmembran passieren. Zu diesem Zeitpunkt ist es unklar, wie diese Mechanismen zu kombinieren, oder auch, ob es weitere Faktoren, die noch identifiziert werden.

Obwohl eine kleine Anzahl von Publikationen (Referenzen ^5,7-9) INS in vitro untersucht haben, hat sich die überwiegende Mehrheit der Arbeiten in diesem Bereich veröffentlicht wurden in vivo durchgeführt (zB Referenzen ^1,6,10-18). Infrarot Stimulation der akustischen Neuronen hat eine Fläche von besonderem Interesse, wegen der möglichen Anwendungen in Cochlea-Implantaten ^10,14-18. Während in vivo Experimente sind wichtig, um die Wirksamkeit der Technik in verschiedenen Einstellungen, die erhöhte Maß an Kontrolle gewährt durch in-vitro-Studien wird erwartet, dass eine genauere Verständnis der mech führen überprüfenmus verantwortlich für INS. Dieser Bericht beschreibt die Herstellung von kultivierten Neuronen Spiralganglienzellen für Patch-Clamp-Untersuchungen, da diese verwendet werden, um grundlegende Mechanismen zu studieren, während auch die Verknüpfung der großen Körper der vorhandenen Daten aus dem auditorischen System werden.

Die Patch-Clamp-Technik ist ein ausgezeichnetes Werkzeug für die Untersuchung von elektrophysiologischen Phänomene, ein Mittel zur Aufzeichnung der elektrischen Aktivität in einzelnen Zellen und der Untersuchung der Beteiligung der einzelnen zugrunde liegenden Strömungen ^19. Wenn diese Technik zu einer stabilen in vitro Herstellung von primären Neuronen, wie kultivierten Neuronen Spiralganglienzellen angewendet, bietet es die Möglichkeit, in die Tiefe, durch welche Mechanismen neuronaler Aktivität gesteuert und manipuliert wird, zu studieren.

Die Protokolle in dieser Arbeit Umriss Methoden zur Untersuchung der Wirkung von Laser-Stimulation auf die elektrischen Eigenschaften der Spirale Ganglionneuronen angegeben durch Patch-Clamp-Aufnahmen. Der Ansatz basiert auf einer Faser-gekoppelte Laser anstelle eines Freiraum-Laser basiert, ermöglicht einen sicheren Betrieb sowie einfacher und wiederholbare Ausrichtung ohne die Notwendigkeit, die Standard-Mikroskop-Konfiguration ändern. Auf der Grundlage dieser Protokolle, sollte es möglich sein, eine breite Palette von Experimenten durchzuführen, um mehr eindeutig zu bestimmen, den Mechanismus oder Mechanismen INS.

Protokoll

1. Kultur von Spiral Ganglionneuronen

1. Sterilisieren kleinen runden (z. B. 10 mm Durchmesser) Deckgläschen und gebogenen Pinzette in einem Autoklaven. Übertragen Sie die sterilisierten Deckgläschen in einzelne Vertiefungen einer sterilen 4-Ring 35 mm Petrischale oder 4-Well-Platte mit den sterilisierten Pinzette. Bewerben 150 ul von Poly-L-Ornithin (500 ug / ml) und Mauslaminin (0,01 mg / ml) auf die Oberseite des Deckglases und in einen Inkubator (37 ° C) für bis zu 48 Stunden. Stellen Sie sicher, dass die Deckgläser schwimmen nicht weg von dem Boden des Bohrlochs.
2. Planen 50 ml sterile Neurobasal Medien (NBM) für jedes neuronale Kultur: 47,5 ml Neurobasalmedium A, 0,5 ml N ₂ Supplement 1 ml B27 Supplement, 0,5 ml L-Glutamin und 0,5 ml Penicillin-Streptomycin. Hinweis: Supplements eingefroren werden kann, bei -20 ° C gelagert und zu den Medien am Tag erforderlich.
3. Dissociate Spiralganglienzellen Neuronen aus postnatalen Tag 4-7 Rattenjungen wie zuvor ^20,21 beschrieben, unsING sowohl enzymatische (0,025% Trypsin und 0,001% DNase I) und mechanischen Techniken. Siehe Whitlon et al. ²² und Vieira et al. ²³ für detaillierte Verfahren der Spiralganglienzellen Neuron Kultur oder Parker et al. ²⁴ für eine Demonstration Modiolus Isolation.
4. Saugen Sie alle verbleibenden poly-L-ornithine/laminin Lösung von den Deckgläsern und waschen kurz mit NBM.
5. In 150-200 ul des dissoziierten Spiralganglienzellen Neuron Suspension auf die Deckgläser und Ort in einen Inkubator (37 ° C, 10% CO _2). Hinweis: bis zu 20 Deckgläser kann von einem durchschnittlichen Wurf von 8 Rattenjungen hergestellt werden.
6. Vier Stunden nach dem Ausplattieren Neuronen absaugen Lösung um Zelltrümmer zu entfernen und ersetzen mit 150-200 ul erwärmte frische NBM. Hinweis: Medien können täglich Nachschub benötigen, um Austrocknung zu vermeiden.
7. Zurück Deckgläser in den Inkubator bis zur elektrophysiologischen Ableitungen erforderlich. Hinweis: dissoziierten SpiraleGanglion Neuronenkulturen können elektrophysiologischen Experimenten Stunden nach der Dissoziation und für bis zu zwei Tagen danach verwendet werden. Zeit in vitro zu berücksichtigen bei der Analyse der Ergebnisse berücksichtigt werden. Tanken NBM jede 24-48 Std.

2. Vorbereitung für die Patch-Clamp-Recordings

1. Bereiten Lösungen
   1. Intrazelluläre (Mikropipette) Lösung: 115 mM K-Gluconat, 7 mM KCl, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM Na ₂ ATP, 2 mM MgATP, 0,5 mM Na ₂ GTP (auf pH 7,3 mit KOH; einstellen bis 295 mOsmol / kg mit Saccharose). Übergeben Sie die Lösung durch ein Sterilfilter (0,2 um) und teilen sich in 200 ul Aliquots bei -20 ° C bis zum Tag der Aufnahme gespeichert werden.
   2. Extrazelluläre (Badewanne) Lösung: 137 mM NaCl, 5 mM KCl, 2 mM CaCl _2, 1 mM MgCl _2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose (auf pH 7,4 mit NaOH; anzupassen 300-310 mosmol / kg mit Saccharose) . Diese Lösung wird am Tag der Aufzeichnung gemacht.
2. Bereiten Sie die Aufnahme Pipetten mit einem Widerstand von 2-6 MOhm. Wir verwenden ein CO _{2-Laser-Abzieher} (P-2000; Sutter Instruments) und Borosilikatglas (1,0 mm Außendurchmesser, 0,58 mm Innendurchmesser, 75 mm Länge).
3. Bereiten Sie den Laser. Dieses Protokoll wird für die Verwendung mit einem fasergekoppelter Laser, wie die 1.870 nm Infrarot-Nerv-Stimulator aus OptoTech P / L. bestimmt Die optische Faser für leichte Lieferwagen in unseren Experimenten verwendet wird, ist ein 200/220 um Kern / Mantel Durchmesser Silica-Faser mit einer numerischen Apertur von 0,22 und FC-PC-Steckern an beiden Enden (AFW Technologies MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Die Patchkabel wurden in zwei Hälften geschnitten, um zwei Faserpigtails (dh an einem Ende mit Steckverbindern und gespalten auf der anderen) zu produzieren. Die Auswirkungen Faserkerndurchmesser und die numerische Apertur auf laserinduzierten Temperaturänderungen im Detail von Thompson et al. ²⁵
   1. Cleave die Spitze des Lichts Lieferung Faser unter Verwendung von Standardverfahrenund dass die sich ergebende Spitze von hoher Qualität ist durch Beobachtung mit einem optischen Mikroskop (dh die Spitze sollte senkrecht zu der Faserachse und erscheinen bei Sichtprüfung flach). Schließen Sie das Licht Lieferung Faser auf die Faser-gekoppelten Ausgang der Stimulation mit einem geeigneten Laser-Through-Anschluss (zB Thorlabs ADAFC2).
   2. Messen Sie den Ausgang Laserleistung von der gespaltenen Spitze des Lichts Lieferung Faser mit einem geeigneten Instrument (zB Coherent FieldMate mit LM-3-Detektor Kopf). Es wird empfohlen zu prüfen, die Laserleistung jedes Mal das Licht Lieferung Faser gespalten wird oder eine signifikante Anpassung wird mit dem Laser gemacht (z. B. Transport von einem Labor zum anderen).
   3. Legen leichte Lieferfahrzeuge Faser in einer Faser Futter oder einer gleichwertigen Einrichtung und bringen das Futter an die entsprechende Mikropositionierer. Es ist wichtig, dass eine genaue Bestimmung der Winkel θ, dass die optische Faser mit dem Deckglas macht. Diese angle können, indem sie ein Foto von der experimentellen Anordnung und mit Bildverarbeitungssoftware (zB ImageJ), um den Winkel zu erhalten, gemessen werden. Insbesondere dem Mikroskop - Der Winkel θ (oder einen Bereich von möglichen Winkeln) wird vor allem durch räumliche Einschränkungen der Versuchsanordnung eingeschränkt. Typische Werte von θ in unseren Experimenten (basierend auf einem aufrechten Mikroskop) sind um 36 °, aber die optimalen Winkel können sich erheblich für alternative Setups (zB solche mit einem inversen Mikroskop).
   4. Stellen Sie die Verbindungen zwischen dem Laser und der Patch-Clamp-Datenerfassungssystem (zB Digidata 1440A, Molecular Devices), wie in Abbildung 2 dargestellt. Die digitale Ausgabe aus dem Patch-Clamp-Datenerfassungssystem sollte der Laser über einen externen Funktionsgenerator verbunden werden, wodurch es möglich Pulsparametern unabhängig von dem Datenerfassungssystem angeben. Alternativ kann dieser Ausgang direkt angeschlossen werdender Laser-Treiber (erfordert die Pulsdauer und Wiederholrate durch die Datenerfassungs-Software eingestellt werden). In jedem Fall sollte das Signal verwendet wird, um den Laser auslösen zu einem Eingang der Datenerfassungs-System angeschlossen werden, um sicherzustellen, dass der Zeitpunkt und die Dauer der Laserpulse gleichzeitig mit der elektrophysiologischen Signal aufgezeichnet werden.

3. Patch-Clamp-Aufnahmen zur Untersuchung von INS

1. Füllen Sie den entsprechenden Container der Perfusion mit extrazellulären Lösung und stellen Sie den Durchfluss, um die Perfusion des Bades mit einer Geschwindigkeit von 1-2 ml / min liefern. Wir verwenden eine Schwerkraft-System (Saugflasche, Quetschventils und PE-Schlauch) mit einem Durchlauferhitzer zu schnelle Erwärmung der Lösung und eine peristaltische Pumpe verbrauchten Lösung durch Absaugen entfernen können.
2. Legen Sie ein Deckglas mit kultivierten Zellen in die Aufnahme Kammer (Badewanne) von einem aufrechten Mikroskop. Mit einer hohen Vergrößerung Wasser-Immersions-Objektiv (e. G. 40X) und Phasen-Kontrast (zB Differential-Interferenz-Kontrast oder Dodt Gradienten Kontrast), visuell lokalisieren die Spiralganglienzellen Neuronen in der Kultur. Ein typisches Spiralganglienzellen Neuron Phase-hell, rund und etwa 15 &mgr; m im Durchmesser mit einem prominenten Kern, wie in Abbildung 1a gezeigt.
3. Sobald ein Neuron lokalisiert worden ist, auf eine niedrigere Vergrößerung Ziel (z. B. 10X) wechseln und suchen Sie die Zielneuron innerhalb des Gesichtsfeldes.
4. Bewegen Sie das Licht Lieferung Lichtwellenleiter in Position mit dem folgenden Verfahren (oder gleichwertig):
   1. Über die Mikropositioniereinrichtung die Ausgangsfaser zu bewegen, bis die Spitze in der Nähe der Ziel-Neuron in der horizontalen und vertikalen Ebenen. Die vertikale Position der Faserspitze kann durch Bewegung des Objektivs auf und ab (Scannen des Fokus) überprüft werden.
   2. Wechseln Sie zurück zu dem Ziel hoher Vergrößerung und Positionierung der Spitze der optischen Faser in ihrer vorgesehenen Position neben ter Neuron (siehe Abbildung 2 Einschub). Beim Einstellen der vertikalen Position der Faser, ist es wichtig, dass der untere Rand der Faser ist (dh gerade berührt) des Deckglases ruht, zu Unsicherheiten in der Position der Faser zu minimieren. Optimale Ausrichtung in der horizontalen Ebene wird von dem Winkel θ abhängt, dass die Faser mit dem Deckglas und dem Radius der Faser r macht. Um die Faser so zu positionieren, dass das Zentrum der Zielneuron liegt entlang der Faserachse, sollte der horizontale Abstand zwischen der Oberkante der Faser und der Zielzelle
      Δ _target = r (θ cosec - 2 sin θ),
      wobei negative Werte anzeigen, dass die optische Faser Überhänge die Zelle. Beim Ausrichten der Faser kann ein Abstand von Δ _Ziel zwischen dem oberen Rand der Faser und dem Mittelpunkt des Neurons etwa durch visuelle Inspektion erreicht werden. Allerdings Δ _Ziel ist so konzipiert,dienen als grobe Richtwerte. Positionierung der Faser, so daß der tatsächliche Abstand Δ zwischen der Oberkante der Faser und dem Mittelpunkt des Neurons meßbar unterscheidet sich von Δ _Ziel (wie in 1) einen Einblick in die Wirkung von sowohl radialen Verschiebung (dh vom und zum Zentrum der beam) und axiale Verschiebung (dh entlang der Faser-Achse) des Strahls relativ zu der Ziel-Nervenzelle. Wenn Sie z. B. Δ ≈ 0 zu erwarten, dass die lokale Temperatur in der Umgebung der Zelle zu erhöhen - also seit das Strahlprofil für typische Multimode-Fasern ist gut mit einem Hut Verteilung ^26, der Rückgang in lokal absorbierte Energie (Temperatur) angenähert durch Verschiebung von der Mitte des Strahls minimal ist im Vergleich zu dem Anstieg der absorbierten Energie von Bewegung der Faserenden näher an der Zelle.
      Während sollte darauf geachtet werden, um die Faser so genau und reproduzierbar zu positionieren als possible Verwendung visuelle Hinweise, präzise Messung der Faser Stelle relativ zum Zielneuron (zB Δ) ist von größerer Bedeutung als Positionierung in einem vorbestimmten Abstand. Δ bestimmt werden kann (mit einem geschätzten maximalen Unsicherheit von ± 3 um) durch Bildanalyse werden, wie in Schritt 3.8.2 des Protokolls beschrieben. In einigen Experimenten ^5,8 haben weiße Lichtquellen durch die Faser gekoppelt ist, um die gewünschte Zelle zielen. Dieser Ansatz wurde festgestellt, dass in der aufrechten Mikroskopaufbau wirksam, da die Intensität von Licht, das von der Zielregion verteilt war relativ niedrig an diesen flachen Winkeln (θ).
   3. Sobald die Faser in Position ist, verschieben Sie sie durch eine bekannte Menge an einfachen Positionierung der Mikropipette aktivieren. Die Faser kann dann in die ursprüngliche Position, wenn ein neuronales Aufnahme erreicht wird zurückgegeben.
5. Füllen Sie die Mikropipette mit intrazellulären Lösung und sicher einrastet passen auf den Köpfentage des Verstärkers (zB Multiclamp 700B, Molecular Devices). Mit Hilfe von Schläuchen, die an der Seite des Halters Mikroelektrode, eine kleine Menge eines Überdrucks zu einer Verstopfung der Mikropipette zu verhindern.
6. Mit einem Mikromanipulator, bewegen Sie die Mikropipette in Position knapp über dem Zielneuron.
7. Protokoll für die ganze Zelle Aufnahmen:
   1. Tragen Sie eine 10 ms, +10 mV Rechteckimpuls (z. B. Seal Test) in Voltage-Clamp-Modus des Verstärkers und stellen Sie die Mikropipette Potential (Pipette Offset) von der Baseline-Signal auf 0 nA. Die Dichtung Test sollte auch festgestellt werden, ob der Widerstand der Mikroelektrode in dem gewünschten Bereich (z. B. 2 - 6 MQ) befindet.
   2. Bei der Überwachung des Widerstandes, verwenden Feineinstellungen der Mikromanipulator leicht positionieren der Mikropipette auf die Oberfläche des Targets Neurons. Wenn die Mikropipette in Kontakt mit dem Neuron ist, wird der Widerstand zu erhöhen (von ~ 0,5 bis 1 MQ). Inmittelbar nach den Widerstand zu erhöhen, entfernen Sie den Fluidüberdruck und eine kleine Unterdruck. Ist die Beständigkeit 10 geführt - 20 MOhm, beheben das Membranpotential einer Holding-Ebene (z. B. um -60 mV).
   3. Die Elektrode Widerstand sollte weiter ansteigen, bis sie 1 G überschreitet, was bedeutet, dass eine wirksame Dichtung (genannt "Giga") zwischen der Zellmembran und Mikropipette gebildet wurde. An diesem Punkt, entfernen Sie alle Flüssigkeitsdruck aus der Pipette.
   4. Sobald die Gigaseal gebildet worden ist, verwenden Sie kurze Stromimpulse (25 bis 100 us; +1 V) oder kurze Impulse Fluidunterdruck zum Bruch der Zellmembran und erreichen Ganzzellkonfiguration.
   5. Notieren der Membran Kapazität Serienwiderstand und Eingangswiderstand ab der Exponentialkurve versehen sind, die während der aktuellen Dichtung Testimpuls bestimmt. Minimieren Sie die Kapazität durch die Anpassung der Transienten CpFast und CpSlow Steuerelemente auf dem Verstärker, dann switch der Verstärker in Ganzzell-Modus und kompensieren Kapazität und Widerstand bis zu einem flachen Strom wird während der Dichtheitsprüfung beobachtet. Bewerben Vorwiderstand Entschädigung (~ 70% Korrektur; 70% Vorhersage), die Anpassung Kapazität und Widerstand Kontrollen, um eine flache Prüfsiegel Reaktion aufrecht zu erhalten.
   6. Wechseln Sie zu Current-Clamp-Modus in den Verstärker. Beachten Sie die Ruhemembranpotenzial (in Abwesenheit der Stromeinspeisung). Stellen Sie einen Haltestrom an das Membranpotential auf dem gewünschten Niveau (zB -60 mV) zu stabilisieren. Neutralisieren Sie die Pipette Kapazität und stellen Sie die Balance Brücke, um den Spannungsabfall auszugleichen.
   7. Überprüfen Sie die Zündung Eigenschaften des Neurons durch die Stimulierung mit depolarisierenden Strom (10-200 pA in +10 pA Schritten, 300 ms Dauer).
8. 1. Bewegen Sie den Lichtwellenleiter zurück in Position neben dem Neuron. Mit Bildverarbeitungs-Software, die mit einer CCD-Kamera, die Aufnahmen der Position der Faser mit Bezug auf die Soll neuron, die sich auf der Ebene des Neurons zunächst und dann an der oberen Kante der optischen Faser (siehe Abbildung 1).
   2. Durch anschließende Analyse der resultierenden Bilder (z. B. Fig. 1b und 1c) ist es möglich, genau zu bestimmen, Δ (die Position des oberen Randes der optischen Faser relativ zu der Mitte des Zielneuron). Wenn Δ bekannt ist, können Parameter, wie der Abstand von der Faserendfläche der Zielneuron (entlang der Faserachse) z und der radialen Verschiebung des Neurons aus dem Zentrum des Strahls δ r unter Verwendung einfacher trigonometrischer Beziehungen werden:
      z = r sin 2θ + Δ cos θ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) ² + Ay ^{2) 1/2,}
      wobei ∂ y der Abstand zwischen der Faserachse und dem Mittelpunkt des Neurons von oben gesehen wird (zB SEe Abbildung 1).
      Analyse zu berücksichtigen Lageabweichungen von Zelle zu Zelle zu nehmen, da die genaue Kenntnis dieser Lage Parameter erforderlich, um mögliche Unterschiede zwischen Stimulation Prozesse ²⁵ zu lösen.

4. INS Experimente

1. Während der Aufzeichnung elektrophysiologische Daten entweder Stromzange oder Voltage-Clamp-Konfigurationen laufen die Stimulation Laser an den gewünschten Parameter (zB Leistung, Pulsdauer, Pulsfrequenz etc.). Mit Laser wird die optische Energie über einen direkten Eingang zu dem Lasertreiber gesteuert und wird manuell vor jeder Aufzeichnung spezifiziert. Pulsdauer und Pulsfrequenz kann entweder durch ein externes Signal Generators oder der Datenerfassungs-Software (wie in Schritt 2.3.4 beschrieben) gesteuert werden. Sicherstellen, dass die Daten sowohl von der Patch-Clamp-Kanal und dem Laser-Trigger-Kanal aufgezeichnet.

Laserpulse mit Längenvon etwa 500 &mgr; s bis 15 ms und Energien von ~ 0,25-5 mJ pro Impuls liefern typischerweise messbaren elektrischen Antworten. Einstellen der Wiederholungsrate der Laserpulse auf 1 Hz oder weniger sein kann für den ersten Experimenten nützlich, da sie die Wirkung dieser Parameter zu minimieren. Typische Ergebnisse, die die Änderung in dem aufgezeichneten Signal werden im folgenden Abschnitt dargestellt.

Ergebnisse

Spiral Ganglionneuronen auf Laserbeleuchtung reagieren mit wiederholbaren Wellenformen sowohl Voltage-Clamp-und Strom-Clamp-Aufnahme-Konfigurationen. 3a zeigt typische Änderungen des Stromflusses durch eine Zellmembran in Antwort auf eine 2,5 ms, 0,8 mJ Laserpuls (durchschnittliche Reaktionszeit von 6 Laserpulse, bei 1 sec Intervallen) mit dem Membranpotential bei -70 mV, -60 mV und -50 mV gehalten wiederholt. Net Einwärtsströme konsequent in Reaktion auf Laserpulse hervorgerufen, Rückkehr zu Ausgan...

Diskussion

Mit den Protokollen vorliegenden Ausführungen ist es möglich, zu extrahieren und Kultur Spiralganglienzellen Neuronen und Laser-evozierte elektrische Aktivität durch Ausführen Ganzzell Patch-Clamp-Experimenten untersucht. Bei in vitro verwendet werden, bietet der Patch-Clamp-Verfahren eine Stufe der Kontrolle über die experimentellen Parameter, die nicht in vivo zu erreichen ist. Laser Stimulationsparameter wie Wellenlänge, Pulsenergie, Pulslänge, Pulsform und Impulsfolgefrequenz Sequenzen könn...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
Table 1. Cell culture materials and equipment.
Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
Table 4. Laser equipment.