Kızılötesi Sinir Stimülasyon en mekanizmaları incelenmesi için tüm Hücre Patch Kelepçe

Özet

Kızılötesi sinir stimülasyonu işitme sistemi ile ilgili olanlar dahil olmak üzere, sinir tipleri, bir dizi elektrik stimülasyonu için bir alternatif olarak önerilmiştir. Bu protokol, birincil işitsel nöronların bir kültür içinde kızılötesi sinir stimülasyonu mekanizmasını incelemek için bir yama kelepçe yöntem açıklanır.

Özet

Bu darbeli, kızılötesi lazer ışık hedef doku arasında herhangi bir başka değişiklik bağımsız olarak, sinir dokusu elektrik yanıtları ortaya çıkarmak için kullanılabilir, son yıllarda gösterilmiştir. Kızılötesi sinir uyarımı işitsel sinir nöronların uyarılması gösterilen özel bir ilgi ile, in vivo periferik ve duyusal sinir dokusu çeşitli rapor edilmiştir. INS bu ayarları çalışmak gösterilmiştir Ancak,, kızılötesi ışık sinir uyarım neden olan mekanizma (veya mekanizmaları) şu anda iyi anlaşılmış değildir. Burada sunulan protokol kültürlenmiş birincil işitsel nöronlar içinde kızılötesi sinir stimülasyonu soruşturma kolaylaştırmak için tasarlanmış bir bütün hücre yama kelepçe yöntem açıklanır. İyice kontrollü şartlar altında in vitro kızılötesi lazer aydınlatma için bu hücrelerinin yanıtı ile karakterize, bu temel Physica geliştirilmiş bir anlaşılmasını sağlamak için mümkün olabilirl ve biyokimyasal süreçleri kızılötesi sinir stimülasyonu altında yatan.

Giriş

Nörofizyoloji ve tıbbi biyonik alanlarında nöral dokuda elektrik tepkilerin kontrol uyarılması izin teknikleri temeline dayanmaktadır. Elektrik stimülasyonu sinir uyarım olarak altın standart olmaya devam ederken sinir yanıtları, ve doku ¹ çevredeki içine akım yayılmasını nedeniyle stimülasyon özgüllük eksikliği kaydederken, bu tür stimülasyon eserler varlığı gibi sakıncaları bir dizi çekiyor.

Son yirmi yılda optik aracılı stimülasyon teknikleri ² gelişimi gördük. Bu tekniklerin bazıları ya da belirli bir molekülün eklenmesi (kafesli moleküller) ³ ya da bir araştırma ayarı dışında uygulamak kolaydır ikisi de genetik manipülasyon çeşit (örneğin optogenetik, ⁴⁾ vasıtasıyla, hedef doku değişiklik gerektirir. Özellikle ilgi çekici bu nedenle kızılötesi sinir stimülasyonu (INS), whereb olduğuy sinir doku darbeli kızılötesi lazer ışık heyecanlı. INS sinir doku ² çok özel, temassız stimülasyon sağlayarak elektrik stimülasyonu eksikliklerin birçok üstesinden gelmek için potansiyeline sahiptir. INS başarılı in vivo ayarları çeşitli gösterilmiştir Ancak,, uyarma mekanizması tam olarak bilinmese kalır.

Bazı yeni yayınlar ^5-7 INS arkasındaki mekanizma ortaya çıkarılması doğru ilerleme göstermiştir. Su ile lazer ışığının emilimi nedeniyle hızlı ısıtma önemli bir rol oynar. Ancak, bunun ötesinde bir fikir birliği henüz ulaşmış olmaktır. Shapiro ve ark. ⁷ hızlı bir ısıtma ve daha sonra hücre zarı depolarizasyon kapasitans bir değişime yol açan, hücre zarı bitişik yüklü parçacıklar dağılımı içinde bir karışıklık sebep olur, son derece genel mekanizma önerilmiştir. Buna ek olarak, Albert ve arkadaşları. ⁵ olduğu iddia LASEr kaynaklı ısıtma iyonlarının hücre zarından geçmesine izin, ısıya duyarlı iyon kanalları (geçici reseptör potansiyeli vanilloid kanal), belirli bir sınıf aktive eder. Bu aşamada tespit edilmesi henüz daha faktörler olup olmadığını gerçekten bu mekanizmaların bir araya nasıl belirsiz, ya da.

Bir yayın az sayıda (referans ^5,7-9), in vitro incelenmiştir INS olmasına rağmen, bu alanda yayınlanan çalışma bölgesinin büyük bir kısmı (örneğin, referans ^1,6,10-18) in vivo olarak gerçekleştirilmiştir. Işitsel sinirlerin Kızılötesi uyarılması koklear implant ^10,14-18 içinde potansiyel uygulamaları nedeniyle özel bir ilgi alanı olmuştur. In vivo deneyler, çeşitli ortamlarda teknik, in vitro çalışmalar tarafından sağlanan kontrol artan seviyesi Mech daha detaylı bir anlayış yol açması beklenmektedir etkililiğini doğrulamak için önemli olmakla birlikte,INS sorumlu olarak tarif etmişler. Bu rapor ayrıca, işitsel sistemin mevcut verilerin büyük gövdesine bağlantı sırasında temel mekanizmaları incelemek için kullanılabilir olarak, yama kelepçe araştırmalar için kültürlenmiş spiral ganglion nöronlarının hazırlanmasını tarif etmektedir.

Yama kelepçe tekniği tek hücrelerinde elektriksel aktivite kayıt aracı sağlayan ve bireysel temel akımları ¹⁹ katkısı eğitim, elektrofizyolojik olayların araştırmalar için mükemmel bir araçtır. Bu teknik, kültür spiral ganglion nöronları gibi birincil nöronların, in vitro hazırlanmasında istikrarlı uygulandığında, bu derinlik sinirsel aktivite kontrol ve manipüle edildiği mekanizmaları eğitim için bir fırsat sunuyor.

Yama kelepçe ile spiral ganglion nöronları elektriksel özellikleri üzerine lazer stimülasyon etkisini araştırmak için bu çalışma taslak yöntemleri belirtilen protokollerikayıtları. Yaklaşım standart mikroskop konfigürasyonu değiştirmek için gerek kalmadan güvenli operasyon gibi kolay ve tekrarlanabilir uyum sağlayan, daha çok bir boş-alan lazer daha fiber çiftli lazer dayanmaktadır. Bu protokollerin dayanarak, daha açık bir şekilde INS arkasında mekanizmasında veya mekanizmalarında belirlemek için deneyler geniş bir yapmak mümkün olmalıdır.

Protokol

1. Spiral ganglion nöronlar Kültür

1. Bir otoklav küçük turu (örneğin 10 mm çapında) cam lamelleri ve kavisli bir forseps sterilize edin. Steril forseps kullanılarak steril 4 halka 35 mm petri ya da 4-plaka ayrı kuyu içine sterilize lamelleri aktarın. En fazla 48 saat için bir kuluçka makinesi içinde lamel yeri ve üst yüzeyi (37 ° C) ile poli-L-ornitin (500 mg / ml) ve fare laminin (0.01 mg / ml) 150 ul uygulanır. Lamelleri kuyunun dibinde uzak yüzer yok emin olun.
2. 47.5 ml Neurobasal A, 0.5 ml ₂ N takviyesi, 1 mi B27 takviyesi, 0.5 ml L-glutamin, ve 0.5 ml penisilin-streptomisin: Her sinir kültürü için 50 ml steril Neurobasal ortamı (NBM) hazırlayın. Not: Ek dondurulabilir, -20 ° C'de depolanır ve gerektiğinde günde ortam ilave edildi.
3. Daha önce ^20,21 açıklandığı gibi doğum sonrası günlük 4-7 sıçan yavrular spiral ganglion nöronları ayırmak, bizeenzimatik (tripsin% 0.025 ve% 0.001 DNase I) 'in ve mekanik teknikler de ing. Whitlon ve ark. ²² ve Vieira et al. ²³ bakınız modiolus izolasyon bir gösteri için spiral ganglion nöron kültürü, ya da Parker ve ark. ²⁴ ayrıntılı yordamlar için.
4. Lamelleri kalan tüm poly-L-ornithine/laminin çözüm aspire ve NBM ile kısa bir süre yıkayın.
5. Bir kuluçka (37 ° C,% 10 CO ₂₎ içine lamelleri ve yere ayrışmış spiral ganglion nöron süspansiyon 150-200 ul ekleyin. Not: 20 kadar lamelleri 8 sıçan yavruları bir defada doğurulan ortalama yavru yola çıkılarak kolayca hazırlanabilir.
6. Dört saat kaplama nöronlar sonra, hücre enkaz kaldırmak ve 150-200 ul ısıtılmış taze NBM ile değiştirin çözüm aspire. Not: Medya dehidratasyonu önlemek için günlük ikmal gerektirebilir.
7. Elektrofizyolojik kayıtlar için gerekli kadar inkübatör lamelleri dönün. Not: ayrışmış spiralGanglion nöron kültürleri dört saat sonra ve daha sonra çözülme fazla iki gün için elektrofizyolojik deneyler için kullanılabilir. In vitro zaman sonuçlarının analizi sırasında dikkate alınmalıdır. Her 24-48 saat NBM yenileyin.

2. Patch Kelepçe Kayıtlar Hazırlık

1. Çözümler hazırlayın
   1. Hücre içi (mikropipet) çözeltisi: 115 mM K-glukonat, 7 mM KCI, 10 mM HEPES, 0.05 mM EGTA, 2 mM Na ₂ ATP, MgATP 2 mM, 0.5 mM Na ₂ GTP (KOH ile pH 7.3 'e ayarlanır; 295 ayarlamak sukroz ile mOsmol / kg) verildi. Steril bir filtre (0.2 um) aracılığıyla çözüm geçmek ve kayıt güne kadar -20 ° C'de depolanmak üzere 200 ul hacimde ayrılır.
   2. Hücre dışı (banyo) çözeltisi: 137 mM NaCI, 5 mM KCI, 2 mM _CaCl2, 1 mM _MgCl2, 10 mM HEPES, 10 mM glükoz (NaOH ile pH 7.4 'e ayarlayın, sukroz ile 300-310 mOsmol / kg' a ayarlayın) . Bu çözüm, kaydın gün yapılır.
2. MQ 2-6 bir direnç ile kayıt mikropipetler hazırlayın. Ve borosilikat cam (1.0 mm dış çapı 0.58 mm iç çapı; 75 mm uzunluk), biz bir _CO2 lazer çektirmesi (Sutter Aletleri P-2000) kullanın.
3. Lazer hazırlayın. Bu protokol, OPTOTECH P / L, bu tür 1.870 nm Kızılötesi sinir uyarıcısı olarak bir fiber çiftli lazer ile kullanım için tasarlanmıştır Deneylerde ışık teslimat için kullanılan fiber optik iki ucunda bir sayısal 0.22 diyafram ve FC-PC konektörler ile 200/220 mikron çekirdek / kaplama çapı silika elyaftır (AFW Teknolojileri MM1-FC2-200/220-5-C -0.22). Patch kablo iki fiber pigtail (yani bir ucunda Konnektörlü ve diğer de bölünmüş) üretmek için ikiye kesilmiştir. Lif çekirdek çapı ve lazer kaynaklı ısı değişiklikleri sayısal açıklık etkileri Thompson ve arkadaşları tarafından ayrıntılı olarak ele alınmıştır. ²⁵
   1. Bölünme, standart teknikler kullanılarak, ışık dağıtım lif ucuve elde edilen ucu bir optik mikroskop (yani ucu lif eksenine dik olması ve görsel denetim üzerine düz görünmelidir) ile gözlem ile yüksek kalitede olduğundan emin olun. Bağlayıcı (örneğin Thorlabs ADAFC2) aracılığıyla uygun bir uyarım kullanılarak lazer elyaf çiftli çıkışına ışık dağıtım lif bağlayın.
   2. Uygun bir alet (LM-3 dedektör kafası ile örneğin Tutarlı FieldMate) kullanarak ışığı teslim lif bölünmüş ucundan çıkış lazer gücünü ölçün. Bu lazer güç ışığı teslim lif bölünmüş ya da önemli bir ayar (örneğin bir laboratuvar diğerine ulaşım) lazer yapılır her zaman kontrol edilmesi önerilir.
   3. Bir fiber ayna veya eşdeğer cihaz ve yapıştırın uygun micropositioner için ayna ışık teslim lif yerleştirin. Bu doğru fiber optik lamel ile yaptığı açı θ tespit edebilmek için önemlidir. Bu anglE deneysel düzenlemenin bir fotoğraf çekme ve açısını elde etmek için görüntü işleme yazılımı (örneğin İmageJ) kullanılarak ölçülebilir. Özellikle mikroskopta - açısı θ (veya olası açıları aralığı) öncelikle deneysel düzenleme mekansal sınırlamaları ile sınırlıdır. Bizim deneylerde θ tipik değerleri (dik bir mikroskop dayalı) 36 ° civarında, ancak en iyi açısı (ters bir mikroskop kullanarak bu gibi) alternatif kurulumları için önemli ölçüde farklılık gösterebilir.
   4. Lazer ve Şekil 2'de gösterildiği gibi, yama kelepçe veri toplama sistemi (örneğin Digidata 1440A, Molecular Devices) ile bağlantı kurarlar. Yama kelepçe veri toplama sisteminden dijital çıkış mümkün veri toplama sisteminden bağımsız lazer darbe parametreleri belirlemek için yapım, harici bir fonksiyon jeneratörü ile lazer bağlanmalıdır. Alternatif olarak bu çıkış doğrudan bağlanabilirlazer sürücüsü (darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı veri toplama yazılımı tarafından ayarlanacak gerektiren). Her iki durumda da, lazer tetiklemek için kullanılan sinyal lazer darbelerinin zamanlaması ve süresi elektrofizyolojik sinyali ile eş zamanlı olarak kaydedilebilir sağlamak için bilgi elde etme sisteminde bir girişine geri bağlanmış olması gerekir.

3. INS incelenmesi için yama Kelepçe Kayıtlar

1. Hücre-dışı çözelti ile perfüzyon sistemi uygun bir kap doldurun ve 1-2 ml / dakika arasında bir oranda banyosunun perfüzyon sağlamak için akış hızını ayarlamak. Bu çözeltinin hızlı ısıtma ve emme tarafından harcanan çıkarmak için çözelti bir peristaltik pompa sağlamak için bir in-line bir ısıtıcı ile yerçekimi beslemeli sistemi (aspiratör şişesi, sıkıştırma valfi ve PE tüp) kullanın.
2. Dik bir mikroskop kayıt odasına (banyo) içine kültürlenmiş hücreler ile bir lamel yerleştirin. Bir yüksek büyütme su daldırma hedefi (E kullanarak40X. G.) Ve faz-kontrast (örneğin diferansiyel girişim kontrast veya Dodt degrade kontrast), görsel kültürü içinde spiral ganglion nöronları bulun. Şekil 1a gösterildiği gibi tipik bir spiral ganglion nöron, önemli bir çekirdek ile çapı faz-parlak, yuvarlak ve yaklaşık 15 mikron.
3. Bir nöron bulunan sonra, daha düşük bir büyütme hedefi (örneğin 10X) geçmek ve görme alanı içinde hedef nöron bulun.
4. Aşağıdaki yordamı (veya eşdeğeri) kullanarak yerine ışık teslim fiber optik hareket:
   1. Ucu, yatay ve dikey düzlemde hem de hedef nöron yakın kadar çıkış elyaf hareket ettirmek için micropositioner kullanın. Lif ucunun dikey konumunu nesnel yukarı ve aşağı hareket (odak tarama) tarafından doğrulanabilir.
   2. Yüksek büyütme hedefi geri dönmek ve t yanındaki istediğiniz konumda fiber optik ucu pozisyono nöron (Şekil 2 ilave bakınız). Fiberin dikey pozisyonunun ayarlanması, bu fiber alt kenarı fiberin konumda belirsizlik en aza indirmek için, lamel (yani sadece dokunarak) üzerine oturtulmuş olması önemlidir. Yatay düzlemde en iyi şekilde sıraya elyaf lamel ve lif r yarıçapı ile yaptığı θ açısına bağlıdır. Hedef nöronun merkezi lif ekseni boyunca uzanır, böylece lif konumlandırmak için, fiberin üst kenarı ile hedef hücre arasındaki yatay mesafe olmalıdır
      Δ _target = r (Cosec θ - 2 sin θ),
      negatif değerler işaret eder nerede fiber optik çıkıntılar hücre. Fiber hizalama olduğunda, elyaf üst kenarı ve nöronun arasındaki Δ _hedef bir mesafe yaklaşık görsel muayene ile elde edilebilir. Ancak Δ _hedef için tasarlanmıştırsadece kaba bir kılavuz olarak hizmet vermektedir. Fiberin üst kenarı ve nöron merkezi arasındaki gerçek mesafe Δ Δ _hedef (Şekil 1'de gibi) ölçülebilir farklı şekilde lif Konumlandırma ortasından her iki radyal yer değiştirme (yani yürürlüğe fikir sağlayabilir Hedef nöron göre kirişin kiriş) ve eksenel yer değişimi (yani lif ekseni boyunca). Tipik modlu fiberler için ışın profili de bir üst şapka dağıtımı ^26, yerel olarak emilen enerji (sıcaklık) düşüş ile yaklaşık olarak bu yana yani - Örneğin, Δ ayarı ≈ 0 hücrenin çevresinde yerel sıcaklığını artırmak için beklenir kirişin merkezinde yer değiştirme nedeniyle yakın hücreye fiber uç yüzü hareket emilen enerji artışı ile karşılaştırıldığında çok azdır.
      Bakımı gibi doğru ve tekrarlanabilir bir po gibi lif konumlandırmak için alınması gerekirkengörsel ipuçları, hedef nöron (örneğin Δ) göre lif konumu hassas ölçüm kullanarak ssible önceden belirlenmiş bir mesafe uzakta konumlandırma daha büyük önem taşımaktadır. Protokolün adım 3.8.2 'de tarif edilene Δ resim analizi ile (± 3 um arasında bir tahmin edilen maksimum belirsizlik ile) tespit edilebilir. Bazı deneylerde ^5,8 olarak, beyaz ışık kaynakları ve istenen hücre hedeflemek için fiber üzerinden akuple edilmiştir. Bu yaklaşım, hedef bölge saçılan ışığın yoğunluğunu bu sığ açıları (θ) nispeten düşük olduğu gibi, dik bir mikroskop kurulum etkisiz olduğu bulunmuştur.
   3. Lif konumda sonra, mikropipet basit konumlandırma sağlamak için bilinen bir miktar dışarı hareket ettirin. Fiber sonra sinir kayıt elde edilir orijinal konumuna iade edilebilir.
5. Hücre içi çözüm mikropipet doldurun ve güvenli başlarına yerine uygunamplifikatör millere (örneğin Multiclamp 700B, Molecular Devices). Mikroelektrot tutucunun tarafına bağlı tüp kullanarak, mikropipet tıkanmasını önlemek için pozitif basınç küçük bir miktar uygulanır.
6. Bir micromanipulator kullanarak, sadece hedef nöron üzerinde pozisyona mikropipet hareket ettirin.
7. Tüm hücre kayıtları için Protokol:
   1. Amplifikatör gerilim-kelepçe modunda 10 msn, +10 mV kare dalga darbe (örneğin Seal Test) uygulayın ve 0 nA için temel sinyal mikropipet potansiyeli (pipet offset) ayarlayın. Sızdırmazlık da mikroelektrot direnişini istenen aralığı (- MQ 6 örneğin 2) içinde olup olmadığını belirlemek için kullanılmalıdır.
   2. Direncinin izlenmesi sırasında, yavaşça hedef nöron yüzeyi üzerine mikropipet konumlandırmak için mikromanipülatör ince ayar kullanımı. Mikropipet nöron ile temas halinde olduğunda, direnç (~ 0,5-1 MQ) tarafından artacaktır. Benmmediately direnç artışı takiben, pozitif sıvı basıncı kaldırmak ve küçük bir negatif basınç uygulayın. Bir kez direnci 10 geçti - 20 MQ, bir holding düzeyinde (-60 mV civarında örneğin) potansiyel membran düzeltmek.
   3. Bu 1 GΩ aşana kadar elektrot direnci etkili bir mühür ('gigaseal' olarak adlandırılan) hücre zarı ve mikropipet arasında oluşan olduğunu simgeleyen, artmaya devam etmelidir. Bu noktada, mikropipet tüm sıvı basıncı çıkarın.
   4. Gigaseal oluşmuştur sonra, kısa akım darbeleri (25 to 100 mikrosaniye, +1 V) kullanın veya kopma hücre zarı negatif sıvı basıncı kısa bakliyat ve tüm hücre yapılandırma elde.
   5. Membran kapasitans, seri direnç ve sızdırmazlık darbe sırasında mevcut takılı üstel eğrisinden belirlenen giriş direnci kaydedin. Sonra switc, amplifikatör üzerindeki CpFast ve CpSlow kontrolleri ayarlayarak, kapasitans geçici aza indirmekh tüm hücre moduna amplifikatör ve düz akım kadar kapasite ve direnç telafi sızdırmazlık sırasında görülmektedir. Düz test işareti yanıt korumak için kapasitans ve direnç kontrolleri ayarlayarak,; seri direnç tazminat (% 70 tahmini ~% 70 düzeltme) uygulayın.
   6. Amplifikatör akım kelepçe moduna geçin. Istirahat membran potansiyeli (mevcut enjeksiyon yokluğunda) dikkat edin. Istenen seviyede (örneğin -60 mV) de membran potansiyeli stabilize etmek için bir holding akımı ayarlayın. Pipet kapasitans nötralize ve gerilim düşümü dengelemek için köprü dengesini ayarlar.
   7. (; 300 milisaniye süresi +10 pA adımda 10-200 pA) mevcut depolarizan ile uyararak nöron ateşleme özelliklerini kontrol edin.
8. 1. Nöron yanında pozisyona fiber optik geri hareket ettirin. Bir CCD kamera birleştirilmiş görüntüleme yazılımı kullanılarak, hedef nöro ile ilgili lif pozisyonu görüntülerini yakalamakN, fiber optik (bkz. Şekil 1) üst kenarında daha sonra ilk olarak bir nöronun düzlem üzerinde odaklanarak, ve.
   2. Ortaya çıkan görüntüler sonraki analiz (örneğin, Şekil 1b ve 1c) tarafından tam olarak Δ (hedef nöronların merkezi optik fiber göreli üst kenarının konumu) belirlemek mümkündür. Sonra Δ bilinmektedir, bu tür fiber uç yüzü olan hedef nöron (lif ekseni boyunca) Z ve kiriş δ r merkezi nöron radyal yer değiştirmesi için mesafe parametreleri basit trigonometrik ilişkiler kullanılarak hesaplanabilir:
      z = r sin 2θ + Δ cos θ
      δ r = ((r cos 2θ - Δ sin θ) ² + δy ^{2) 1/2,}
      δy lif ekseni ve yukarıda da görüleceği gibi nöron merkezi arasındaki mesafe olduğu (örneğin see Şekil 1).
      Bu konumu parametrelerin doğru bilgi uyarılması işlemleri ²⁵ arasındaki olası farklılıkları gidermek için gerekli olabilecek Analizi, hücreden hücreye hesap pozisyonel varyasyonları almalıdır.

4. INS Deneyler

1. Akım kelepçe veya gerilim kelepçe yapılandırmaları birinde elektrofizyolojik veri kaydederken, istenen parametreleri (örneğin güç, darbe uzunluğu, tekrarlama oranı vb) de uyarılması lazer çalıştırın. Bizim lazer, optik güç lazer sürücü doğrudan bir giriş üzerinden kontrol edilir ve her kayıttan önce manuel olarak belirtilir. Darbe uzunluğu ve tekrarlama oranı, harici sinyal üreteci veya veri toplama yazılımı (, adım 2.3.4 'de açıklandığı gibi) ya da kontrol edilebilir. Veri yama kelepçe kanal ve lazer tetikleyici kanal hem de kaydedilir emin olun.

Arasında değişen uzunlukları ile lazer darbeleriyaklaşık 500 mikro-saniyeye 15 msn ve darbe başına ~ 0,25-5 mJ enerjileri tipik olarak ölçülebilir elektrik yanıtları verim. Bu parametre etkilerini en aza indirmek çünkü 1 Hz ya da daha az olduğu lazer darbelerinin tekrar oranının ayarlanması, ilk deneyler için faydalı olabilir. Kaydedilen sinyal değişikliği tipik sonuçları aşağıdaki bölümde sunulmuştur.

Sonuçlar

Spiral ganglion nöronlarının voltaj-kıskaç ve akım kelepçe kayıt konfigürasyonlarının tekrarlanabilir dalga lazer aydınlatma yanıt. Şekil 3a, bir 2.5 ms, 0.8 mJ lazer darbeli (6 ortalama müdahale yanıt olarak bir hücre zarından akımı tipik değişiklikler gösterir -70 mV, -60 mV ve -50 mV düzenlenen membran potansiyeli ile 1 sn aralıklarla) tekrarlanan lazer darbeleri,. Net içe akımları sürekli aydınlatma kesildikten sonra başlangıç ​​değerlerine dönen, lazer darbele...

Tartışmalar

Bu yazıda belirtilen protokolleri kullanarak ayıklamak ve kültür spiral ganglion nöronları ve tüm hücre yama kelepçe deneyler yaparak lazer uyarılmış elektriksel aktivite araştırmak mümkündür. In vitro olarak kullanıldığında, yama klemp tekniği, in vivo olarak ulaşılabilir değildir deney parametreleri üzerinde bir kontrol düzeyi sağlar. Bu dalga boyu, darbe enerjisi, darbe uzunluğu, darbe şekil ve darbe tekrarlama dizileri olarak lazer stimülasyon parametreleri tekrarlana...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
			Table 1. Cell culture materials and equipment.
			Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
			Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
			Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
			Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
			Table 4. Laser equipment.