Всего зажим патч для сотовых изучения механизмов Инфракрасный нервного возбуждения

Резюме

Инфракрасный нерва была предложена в качестве альтернативы электрической стимуляции в диапазоне нервных типов, включая те, которые связаны с слуховой системы. Этот протокол описывает метод патч зажим для изучения механизма инфракрасного стимуляция нервов в культуре первичных слуховых нейронов.

Аннотация

Это было продемонстрировано в последние годы, что импульсный лазер инфракрасного света может быть использован, чтобы вызвать электрические реакции в нервной ткани, независимо от каких-либо дальнейших изменений ткани-мишени. Инфракрасное нейронных стимуляции сообщалось в различных периферийных и сенсорной нервной ткани в живом организме, с особый интерес показано на стимуляцию нейронов слухового нерва. Тем не менее, в то время как INS было показано, что работать в таких условиях, механизм (или механизмы), в котором инфракрасное излучение вызывает нервного возбуждения в настоящее время не очень хорошо понял. Протокол, представленные здесь описывается целой клетки патч зажим метод предназначен для облегчения Исследование инфракрасных нервного возбуждения в культуре первичных слуховых нейронов. Тщательно характеризующие реакцию этих клеток инфракрасного лазерного освещения в пробирке при контролируемых условиях, то можно получить более глубокое понимание фундаментальных Physicaл и биохимических процессов, лежащих в основе инфракрасного нервного возбуждения.

Введение

Области нейрофизиологии и медицинские бионика во многом полагаются на методы, которые позволяют управляемым стимуляции электрические реакции в нервной ткани. В то время как электрическая стимуляция остается золотым стандартом в нервном возбуждении, он страдает от ряда недостатков, таких как наличие артефактов стимуляции при записи нервные реакции, а также отсутствие стимуляции специфику в связи с распространением тока в окружающие ткани ^1.

Последние два десятилетия мы стали свидетелями развития оптически опосредованной стимуляции методы ^2. Некоторые из этих методов требует модификации ткани-мишени, либо путем добавления конкретной молекулы (например, клетку молекулы) ³ или некоторую форму генетической манипуляции (например Optogenetics) ^4, ни один из которых просты в применении за пределами исследование параметра. Особый интерес поэтому инфракрасный нервного возбуждения (INS), где Ву нервной ткани возбуждается импульсного инфракрасного лазерного излучения. INS имеет потенциал, чтобы преодолеть многие недостатки электрической стимуляции, позволяя весьма специфический, бесконтактные стимуляции нервной ткани ^2. Тем не менее, в то время как INS было успешно продемонстрировано в различных условиях, в естественных условиях, точный механизм возбуждения остается неопределенной.

Согласно последним публикациям показали прогресс в раскрытии механизмов, ответственных за INS ^5-7. Быстрый нагрев за счет поглощения лазерного излучения водой видимому, играет ключевую роль. Однако, помимо этого консенсуса пока не достигнуто. Шапиро и др.. ⁷ предлагает весьма общей механизм, посредством быстрого нагрева вызывает возмущение в распределении заряженных частиц, прилегающей к мембране клетки, что приводит к изменению емкости клеточной мембраны и последующей деполяризации. Кроме того, Альберт и др.. ⁵ утверждают, что Laseт индуцированного нагрева активирует специфический класс чувствительных к температуре ионных каналов (переходный рецепторный потенциал ваниллоидные канала), что ионы проходить через клеточную мембрану. На данном этапе неясно, как эти механизмы сочетаются, да и вообще, есть ли дальнейшие факторы, которые еще не были идентифицированы.

Несмотря на небольшое число публикаций (ссылки ^5,7-9) исследовали INS в пробирке, подавляющее большинство работ в этой области опубликовано была проведена в естественных условиях (например, ссылки ^1,6,10-18). Инфракрасный стимуляции слуховых нейронов был области, представляющие особый интерес, в связи с потенциальных применений в кохлеарных имплантах ^10,14-18. В то время как в естественных условиях эксперименты важно проверить эффективность метода в различных условиях, повышение уровня Контроль, обеспечиваемый в лабораторных исследованиях как ожидается, приведет к более детальному пониманию мехамом ответственность за INS. Данный отчет описывает получение культивируемых нейронов спирального ганглия для исследований патч зажим, так как они могут быть использованы для изучения фундаментальных механизмов а также ссылки на большое количество существующих данных из слуховой системы.

Техника патч зажим является отличным инструментом для исследования электрофизиологических явлений, обеспечивая средства регистрации электрической активности отдельных клеток и изучение вклада отдельных глубинные течения ^19. Когда эта методика применяется к стабильной в пробирке подготовка первичных нейронов, таких как культивируемых нейронов спирального ганглия, он предлагает возможность для углубленного изучения механизмов, посредством которых нервная деятельность находится под контролем и манипулировать.

Протоколам, определенным в этой работе методы план исследования влияния лазерной стимуляции на электрические свойства нейронов спирального ганглия через зажим патчзаписей. Этот подход основан на волокном лазерный а не в свободном пространстве лазер, что позволяет безопасно операции, а также легче и более воспроизводимые выравнивание без необходимости модифицировать стандартную конфигурацию микроскопа. На основании этих протоколов, должна быть возможность проводить широкий спектр экспериментов для того, чтобы более четко определить механизм или механизмы, лежащие в INS.

протокол

1. Культура нейронов спирального ганглия

1. Стерилизовать маленькие круглые (например, 10 мм в диаметре) покровные стекла и изогнутые щипцы в автоклаве. Передача стерилизовать покровные в отдельные лунки стерильного 4-кольцо 35 мм чашки Петри или 4-луночного планшета с использованием стерилизованного щипцов. Применить 150 мкл поли-L-орнитин (500 мкг / мл) и мышиного ламинина (0,01 мг / мл) к верхней поверхности покровного стекла и место в инкубаторе (37 ° С) в течение 48 часов. Убедитесь, что покровные не плавают от дна скважины.
2. Подготовка 50 мл стерильной нейробазальной среды (NBM) для каждого нейронные культуры: 47,5 мл нейробазальной, 0,5 мл N ₂ добавки, 1 мл B27 добавки, 0,5 мл L-глутамина и 0,5 мл пенициллина-стрептомицина. Примечание: Добавки могут быть заморожены, хранили при -20 ° C и добавляли к медиа в день требуется.
3. Диссоциируют нейронов спирального ганглия от послеродовой день 4-7 крысят, как описано выше ^20,21, намING как ферментативная (0,025% трипсина и 0,001% ДНКаза I) и механического оборудования. См. Whitlon соавт. Виейра ²² и др. ^23. Для получения подробных сведений из нейронов спирального ганглия культуры или Паркер и др.. ²⁴ для демонстрации Modiolus изоляции.
4. Аспирируйте любой оставшийся раствор poly-L-ornithine/laminin от покровных и мыть кратко в НБМ.
5. Добавить 150-200 мкл диссоциированных нейронов ганглиев подвески спирали к покровные и поместить в инкубатор (37 ° C, 10% CO _2). Примечание: до 20 Покровные стекла могут быть получены из средней помет 8 щенков крысы.
6. Через четыре часа после покрытия нейронов, аспирации раствором для удаления остатков клеток и заменить 150-200 мкл нагретый свежий НБМ. Примечание: средства массовой информации может потребоваться ежедневное пополнение, чтобы избежать обезвоживания.
7. Возврат покровные в инкубатор, пока не потребуется для электрофизиологических записей. Примечание: диссоциированными спиральныекультурах нейронов ганглиев может использоваться для электрофизиологических экспериментов четыре часа после диссоциации и в течение двух дней после этого. Время в пробирке должны быть приняты во внимание в ходе анализа результатов. Пополните НБМ каждые 24-48 часа.

2. Подготовка к записи патч зажим

1. Готовят растворы
   1. Внутриклеточной (микропипетки) Решение: 115 мм K-глюконат, 7 мм KCl, 10 мМ HEPES, 0,05 мМ EGTA, 2 мМ Na ₂ АТФ, 2 мМ Mg-АТФ, 0,5 мМ Na ₂ GTP (доведения рН до 7,3 с помощью КОН; приспособиться к 295 мосмоль / кг сахарозы). Передайте раствора через стерильный фильтр (0,2 мкм) и разделить на 200 мкл аликвоты не сохраняется при температуре -20 ° C до дня записи.
   2. Внеклеточный (ванна) раствор: 137 мМ NaCl, 5 мМ KCl, 2 мМ CaCl _2, 1 мМ MgCl _2, 10 мМ HEPES, 10 мМ глюкозы (доведения рН до 7,4 с помощью NaOH; приспосабливаться к 300-310 мосмоль / кг сахарозы) . Это решение состоит в день записи.
2. Подготовьте записи микропипетки с сопротивлением 2-6 МОм. Мы используем СО _{2-лазера} съемника (P-2000; Саттер инструменты) и боросиликатного стекла (1,0 мм наружный диаметр; 0,58 мм внутренний диаметр, 75 мм длина).
3. Подготовьте лазера. Этот протокол предназначен для использования с волокном лазерный, например, 1870 нм Инфракрасный Стимулятор нерва от OptoTech P / L. Оптическое волокно используется для подачи света в наших экспериментах 200/220 мкм ядро ​​/ оболочка диаметром кварцевого волокна с числовой апертурой 0,22 и FC-PC разъемов на обоих концах (AFW Технологии MM1-FC2-200/220-5-C -0,22). Патч-корды были сокращены в два раза для получения двух волокна косички (т.е. коннектором на одном конце и расщепляется в другой). Эффекты диаметр сердцевины волокна и числовой апертурой на изменения температуры лазерной индуцированной были подробно рассмотрены Томпсон и др.. ²⁵
   1. Раскол кончик свет волокно доставки с использованием стандартных методови убедиться, что полученный совет высокого качества от наблюдения с помощью оптического микроскопа (т.е. кончик должна быть перпендикулярна к оси волокна и появляются плоские при визуальном осмотре). Подключите светло-волокна доставки к волоконно-связанной выходе лазерной стимуляции с использованием соответствующей через разъем (например Thorlabs ADAFC2).
   2. Измерьте выходной мощности лазера от расщепленный кончик волокна света доставки с использованием соответствующего документа (например, когерентное FieldMate с LM-3 головки детектора). Рекомендуется проверить мощность лазера каждый раз, когда свет волокна доставки расщепляется или значительную регулировка производится с лазером (например, перевозки из одной лаборатории в другую).
   3. Вставьте световод доставки в патроне волокна или аналогичное устройство и прикрепите патрон в соответствующие микроподвижки. Важно иметь возможность точно определить угол θ, что оптическое волокно образует с покровным. Это англе может быть измерено с фотографией экспериментальной установки и использования программного обеспечения для обработки изображений (например ImageJ), чтобы получить угол. Угол θ (или диапазон возможных углов) в основном ограничивается пространственным ограничений экспериментальной установки, - в частности микроскопом. Типичные значения θ в наших экспериментах (на основе прямого микроскопа) около 36 °, однако оптимальным углом могут существенно отличаться для альтернативных установок (например, те, которые используют инвертированный микроскоп).
   4. Выполняйте соединения между лазером и патч зажим системы сбора данных (например, Digidata 1440A, Molecular Devices), как показано на рисунке 2. Цифровой выход из патч зажим системы сбора данных должен быть подключен к лазерному через внешний генератор функций, что делает возможным определение параметров лазерного импульса независимо от системы сбора данных. Другой стороны, этот выход может быть подключен непосредственно клазерный привод (требуется длительность импульса и частоты повторения быть установлены с помощью программного обеспечения для получения данных). В любом случае сигнал используется для запуска лазер должен быть подключен к входу системы сбора данных, чтобы гарантировать, что сроки и продолжительность лазерных импульсов могут быть записаны одновременно с электрофизиологических сигналов.

3. Патч зажим Записи по расследованию INS

1. Заполните соответствующий контейнер перфузии система с внеклеточным раствором и регулировать расход обеспечить перфузию ванну со скоростью 1-2 мл / мин. Мы используем самотечные системы (аспиратор бутылки, запорный клапан, а PE трубки) с встроенным в линию нагреватель для быстрого нагревания раствора, и перистальтический насос для удаления отработанного раствора путем отсасывания.
2. Поместите покровное с культивируемых клеток в записи камеры (ванна) из прямой микроскоп. Использование больших увеличениях воды погружения цели (Е. Г. 40X) и фазово-контрастная (например, дифференциального интерференционного контраста или Dodt отличие градиент), визуально определить спиральный ганглий нейронов в культуре. Типичный нейрон спирального ганглия по фазе яркие, круглые и примерно 15 мкм в диаметре с видным ядра, как показано на рисунке 1а.
3. После того, как нейрон был расположен, переключиться на более низком увеличении цели (например, 10X) и найдите целевой нейронов в поле зрения.
4. Переместить подачи света оптического волокна в положении с использованием следующей процедуры (или эквивалент):
   1. Использование микроподвижки для перемещения выходного волокна, пока наконечник близка к целевой нейронов как в горизонтальной и вертикальной плоскостях. Вертикальное положение торца волокна может быть проверена путем перемещения объектива вверх и вниз (сканирование фокуса).
   2. Вернитесь к высокой цели увеличения и позиционирования зонда оптического волокна по своему прямому позицию рядом с TОн нейрона (см. Рисунок 2 вставки). При регулировке вертикального положения волокна, важно, чтобы нижний край волокон лежит на (т.е. только прикосновения) покровное, чтобы свести к минимуму неопределенность в расположении волокон. Оптимальное выравнивание в горизонтальной плоскости, будет зависеть от угла θ, что волокна делает с покровным и радиус волокна р. Для того, чтобы расположить волокна таким образом, что центр мишени нейрона лежит вдоль оси волокна, горизонтальное расстояние между верхним краем волокна и клетки-мишени должны быть
      Δ _{целевых} = R (COSEC θ - θ 2 греха),
      где отрицательное значение будет указывать, что оптическое волокно выступы клетки. При выравнивании волокно, расстояние Δ _{целевого} между верхним краем волокна и центром нейрона может быть приближенно достигнуто путем визуального осмотра. Однако Δ _{целевой} предназначен дляслужить в качестве приблизительного ориентира только. Позиционирование волокна таким образом, что фактическое расстояние Δ между верхним краем волокна и центром нейрона заметно отличается от Δ _{цели (как} на фиг.1), может дать представление о влиянии как радиальное смещение (т.е. от центра луч) и осевое смещение (т.е. вдоль оси волокна) пучка относительно мишени нейрона. Например, установка Δ ≈ 0 можно было бы ожидать увеличение местной температуры в непосредственной близости от клетки - т.е. с профилем пучка для типичных многомодовых волокон хорошо аппроксимируется верхней распределение шапка ^26, снижение локально поглощенной энергии (температуры) из-за смещения от центра луча минимальна по сравнению с увеличением поглощенной энергии от движущихся лица конец волокна ближе к клетке.
      В то время как следует позаботиться, чтобы расположить волокна, как точно и как По повторяемостьюssible использованием визуальных ориентиров, точное измерение расположения волокон относительно целевого нейрона (например, Δ) имеет большее значение, чем позиционирование его на заданном расстоянии от отеля. Δ может быть определена (по оценкам неопределенности максимум ± 3 мкм) путем анализа изображений, как описано в пункте 3.8.2 протокола. В некоторых экспериментах ^5,8, источников белого света были связаны через волокна с целью выявить нужную ячейку. Этот подход был оказались неэффективными в вертикальном настройки микроскопа, а интенсивность света, рассеянного от целевой области была относительно низкой в ​​этих мелких углов (θ).
   3. Когда волокно находится в положении, переместить его по известным количеством чтобы просто позиционирование микропипетки. Волокно может быть возвращен в исходное положение, когда нейронной записи достигнута.
5. Заполните микропипетки с внутриклеточными решение и надежно свои места на головыTage из усилителя (например Multiclamp 700B, Molecular Devices). Использование трубки прикреплены к боковым микроэлектрода держатель, применяют небольшое количество положительное давление, чтобы предотвратить засорение микропипетки.
6. Использование микроманипулятор, переместите микропипетки в положение чуть выше целевого нейрона.
7. Протокол для записи всего ячейки:
   1. Нанесите 10 мс, +10 мВ Меандр (например, испытание на герметичность) в фиксации потенциала режима усилителя и отрегулируйте микропипетка потенциал (пипетки зачете) базовый сигнал 0 нА. Печать тест должен также использоваться, чтобы определить сопротивление микроэлектрода находится в пределах желаемого диапазона (например, 2 - 6 МОм).
   2. Во время контроля сопротивления, использование точных регулировок микроманипулятор осторожно расположить пипетки на поверхность мишени нейрона. Когда микропипетки находится в контакте с нейрона, сопротивление будет увеличиваться (от ~ 0,5 до 1 МОм). Яmmediately после увеличения сопротивления, удалите избыточное давление жидкости и нанесите небольшое отрицательное давление. После сопротивления прошла 10 - 20 МОм, исправить мембранный потенциал к холдингу уровне (например, около -60 мВ).
   3. Сопротивление электрода должна продолжать увеличиваться, пока не превышает 1 ГОм, показывая, что эффективное уплотнение (называется 'gigaseal') была образована между клеточной мембраной и микропипетки. На данный момент, удалить все давление жидкости из пипетки.
   4. После gigaseal была сформирована, использовать короткие импульсы тока (от 25 до 100 мкс; +1 V) или короткие импульсы отрицательного давления жидкости для разрыва клеточных мембран и достичь всю конфигурацию ячейки.
   5. Запишите мембранные емкости, последовательное сопротивление и входное сопротивление, определенная по экспоненциальной кривой установлены на текущее время импульса тест печать. Свернуть переходные емкости, регулируя CpFast и CpSlow управления на усилителе, то Switcч усилителя в режиме цельной клетке, и компенсировать емкость и сопротивление до плоской текущего наблюдается в печать тест. Применить серии компенсация сопротивления (~ 70% коррекции, 70% прогноз), регулируя емкость и сопротивление контроля для поддержания плоской характеристикой печать тест.
   6. Переключить на текущий зажим в режиме усилителя. Обратите внимание на мембранный потенциал покоя (при отсутствии ввода тока). Установка удерживающего тока для стабилизации мембранного потенциала на заданном уровне (например, -60 мВ). Нейтрализовать пипетку емкостью и регулировать баланс моста, чтобы сбалансировать падение напряжения.
   7. Проверьте стрельбы свойств нейронов, стимулируя с деполяризующими тока (+10 до +200 Па +10 шагов годовых; 300 мсек).
8. 1. Переместить назад оптические волокна в позиции рядом с нейроном. Используя программу обработки изображений, соединенный с ПЗС-камерой, захват изображений из положения волокна по отношению к целевой нейрон, сосредоточив внимание на плоскость нейрона на начальном этапе, а затем по верхнему краю оптического волокна (см. рисунок 1).
   2. В последующем анализе полученных изображений (например, 1b и 1с Цифры) можно точно определить Δ (положение верхнего края оптического волокна к относительной центр мишени нейрона). После Δ известно, такие параметры, как расстояние от торца волокна к целевой нейрона (вдоль оси волокна) г и радиальное смещение нейрона от центра т δ луч может быть рассчитана с помощью простых тригонометрических соотношений:
      Z = R греха 2θ + Δ COS θ
      δ R = ((R COS 2θ - грех θ Δ) ² + Ау ^{2) 1/2,}
      где Ау является расстоянием между осью волокна и центром нейрона, если смотреть сверху (например, таковыеэлектронной рис. 1).
      Анализ должен учитывать отклонение положения от клетки к клетке, а точное знание этих параметров местоположения может потребоваться для устранения возможных различий между стимуляцией процессов ^25.

4. Эксперименты INS

1. Во время записи электрофизиологических данных в любом токовых клещей или напряжения зажим конфигурации, запустите стимуляции лазером на нужные параметры (например, мощность, длительность импульса, частота и т.д.). С нашей лазер, оптическая мощность регулируется с помощью прямого ввода в лазерный привод и указывается вручную перед каждой записью. Длительность импульса и частоты повторения может управляться либо внешний генератор сигнала или программное обеспечение сбора данных (как описано в пункте 2.3.4). Убедитесь, что данные записываются с обеих канал патч зажим и лазерный канал курок.

Лазерных импульсов с длинамиот около 500 мкс до 15 мс и энергией ~ 0,25-5 мДж обычно дает измеряемый электрический ответов. Установка частоты повторения лазерных импульсов равной 1 Гц или менее может быть полезно для начальных экспериментов, так как это сводит к минимуму воздействие этого параметра. Типичные результаты, показывающие изменение записанного сигнала представлены в следующем разделе.

Результаты

Спиральные нейронов ганглиев реагировать на лазерного излучения с повторяемых сигналов в обоих фиксации потенциала и тока зажим конфигурации записи. 3а показаны типичные изменения тока через клеточную мембрану в ответ на 2,5 мсек, 0,8 мДж лазерного импульса (средний отклик от 6 ?...

Обсуждение

Использование протоколов изложенных в настоящем документе, можно извлечь и культуре нейронов спирального ганглия и исследовать лазерной вызвало электрическую активность, выполняя целый экспериментов клетки патч зажим. При использовании в пробирке, технику патч зажим обеспечив...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Name of Reagent/Material	Company	Catalog Number	Comments
			Cell culture materials and equipment
Glass coverslips	Lomb Scientific	CSC 10 1 GP
4-ring cell culture dish	VWR International	82050-542
Poly-L-ornithine solution	Sigma-Aldrich	P4957
Laminin	Invitrogen	23017-015
Curved forceps	WPI	14101	Dumont #5 tweezers (45° angle tip)
CO2 Incubator	ThermoScientific	Heracell 150i
			Table 1. Cell culture materials and equipment.
			Neurobasal media
Neurobasal A	Gibco	10888-022
N-2 supplement	Invitrogen	17502-048
B27 serum-free supplement	Invitrogen	17504-044
Penicillin-Streptomycin	Invitrogen	15140-148
L-Glutamine	Invitrogen	25030-149
Intracellular solution
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Potassium D-gluconate	Sigma-Aldrich	G4500
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889
Na2ATP	Sigma-Aldrich	A2383
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187
NaGTP	Sigma-Aldrich	G8877
Potassium hydroxide	LabServ	BSPPL738.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
			Extracellular solution
Sodium chloride	Sigma-Aldrich	310166
Potassium chloride	Sigma-Aldrich	P4504
HEPES	Sigma-Aldrich	H4034
Calcium chloride	Sigma-Aldrich	383147
Magnesium chloride	Sigma-Aldrich	M8266
D-Glucose	Sigma-Aldrich	G8270
Sodium hydroxide	LabServ	BSPSL740.500
Sucrose	Sigma-Aldrich	S8501
			Table 2. Solutions for cell culture and patch clamp. a) Neurobasal media. b) Intracellular solution. c) Extracellular solution.
Upright microscope	Zeiss	AxioExaminerD1	Equipped with Dodt contrast
Water-immersion objective	Zeiss	W Plan-APOCHROMAT 40x/0.75
Platform and X-Y stage	ThorLabs	Burleigh Gibraltar
Recording chamber	Warner Instruments	RC-26G
Vibration isolation table	TMC	Micro-g 63-532
CCD Camera	Diagnostic Instruments	RT1200
Camera software	Diagnostic Instruments	SPOT Basic
In-line solution heater	Warner	SH-27B
Temperature controller	Warner	TC-324B
Patch clamp amplifier	Molecular Devices	Multiclamp 700B
Patch clamp data acquisition system	Molecular Devices	Digidata 1440A
Micromanipulator	Sutter Instruments	MPC-325
Micropipette glass	Sutter Instruments	GBF100-58-15	Borosilicate glass with filament
Micropipette Puller	Sutter Instruments	P2000
Recording Software	AxoGraph		Lab pack and electrophysiology tools
Aspirator bottle	Sigma-Aldrich	CLS12201L	1 L Pyrex aspirator bottle, with outlet for tubing
PE Tubing	Harvard	PolyE #340
Masterflex peristaltic pump	Cole-Parmer	HV-07554-85
			Table 3.Patch clamp equipment.
1,870 nm laser diode	Optotech
200/220 μm diameter multimode optical fiber patch cord (FC/PC)	AFW Technologies	MM1-FC2-200/220-5-C-0.22	Light delivery optical fiber, silica core and cladding, 0.22 NA
Optical fiber through connector (FC/PC)	Thorlabs	ADAFC2
Optical fiber cleaver	EREM	FO1
Optical fiber stripping tool (0.25 - 0.6 mm)	Siemens		For removing optical fiber jacket
Optical fiber stripping tool (0.6 - 1.0 mm)	Siemens		For removing outer coating of patch cord
Signal generator			Any signal generator that can output the necessary pulse shapes and is capable of being externally triggered
Optical fiber positioner			Custom made positioner. Could substitute with standard micropositioner used for patch clamp experiments
Optical fiber chuck	Newport	FPH-DJ
Laser power meter and detector head	Coherent	FieldMate (power meter) with LM-3 (detector head)
			Table 4. Laser equipment.