בידוד של נוירונים חושיים של<em&gt; Aplysia californica</em&gt; להקלטות מהדק תיקון של זרמי glutamatergic

Summary

אנו מתארים את הנתיחה של מערכת העצבים של ים הארנבת הימית Aplysia אחרי הרדמה, הבידוד של תאי עצב לתרבות לטווח קצר, ברקמות ובהקלטות של זרמי יון תא בודדים באמצעות טכניקת מהדק התיקון.

Abstract

יש חלזון הרכיכה הימי Aplysia californica היסטוריה מכובדת כמודל של תפקוד מערכת עצבים, עם משמעות מיוחדת במחקרים של למידה וזיכרון. ההכנות האופייניות למחקרים מסוג זה הן אלה שבי חושיים ונותרו ללא פגע motoneurons בבעלי חיים גזורים מינימאלי, או תרבות משותפת עצבית טכני משוכללת של חושי וmotoneurons פרט. פחות נפוץ היא ההכנה העצבית המבודדת שבו אשכולות קטנים של תאי עצב להלכה הומוגניות הם ניתקו לתוך תאים בודדים בתרבות בטווח קצרה. תאים מבודדים כאלה שימושיים לאפיון biophysical של זרמי יונים באמצעות טכניקות מהדק תיקון, ואפנון ממוקד של conductances אלה. פרוטוקול להכנת תרבויות כאלה מתואר. הפרוטוקול מנצל את עצב סנסורי glutamatergic בקלות לזיהוי של גרעיני צדר וbuccal, ומתאר את הניתוק שלהם ותחזוקה המינימאליתתרבות n במשך כמה ימים ללא סרום.

Introduction

רכיכת opistobranch הימית, Aplysia, כבר מודל הנוירוביולוגי שימושי במשך עשורים רבים. הוא ידוע בעיקר כמודל של התרגלות והתניה קלסית ^{7, 8.} מחקרים על למידה וזיכרון במודל זה זכה בפרס נובל לפיזיולוגיה ורפואה בשנת 2000 לאריק ר 'קנדל, בפרס הוא משותף עם Arvid Carlsson ופול גרינגרד ^10. מחקרים שכלל הקלטות חשמל מהכנות מופחתות, שבו אלמנטים של מערכת העצבים של חסר חוליות זה הם גזורים מבעלי החיים עם עצבים ושרירים עזבו מצורף, סייעו להבהיר את התפקידים של נוירונים בודדים בAplysia. זיהוי של מנגנונים מולקולריים מדויקים המהווים למידה בAplysia עם זאת, לעתים קרובות מועסק טכניקה אחרת, לטווח ארוך שיתוף תרבויות של נוירון חושי וmotoneuron, השיגה אחד אחד מבעלי החיים תורמים בודדים ואפשרו ליצירת סינפסה בצלחת תרבות ²¹ .

אנחנו ואחרים ^{1, 3, 6, 14, 15, 16,} ניצלו את הקלות שבי זיהה יכולים להיות ממוקדים נוירונים במודל זה, כמו גם הסיבולת שלהם בניסויים לטווח ארוך כדי להפוך את תרבויות טווח קצרות ניתקות של צבירי נוירונים להלכה הומוגניות שבו אנחנו לומדים זרמים יוניים תחת מהדק מתח בתצורת תיקון המהדק. נוירונים רבים Aplysia לעמוד לסיבובים חוזרים ונשנים של תיקון הידוק כדי לאפשר זמן למניפולציות ניסיוני לטווח ארוך. הטכניקה שימושית לתאי עצב, כגון תאי neurosecretory השקית של גנגליון הבטן, ואת עצב סנסורי של גרעיני צדר וbuccal דיסוציאציה שאנו מתארים כאן, אבל לא לתאי עצב גדולים מאוד> קוטר 60 מיקרומטר, כגון L7 או R2 של גנגליון הבטן. אנחנו לא מעסיקים Aplysia סרום בתרבויות שלנו, בניגוד לשיתוף התרבויות חושי motoneuron המתוארת במקום אחר. רוב הנוירונים שהושגו באמצעות הליך זה יהיו ללא תהליכים עבור tאז הוא ראשון 48 שעות בתרבות, בהנחיית שלמה הקלטת מתח תא, אלא יצמח ולפרט אקסונים ותהליכים אחרים למשך כ 14 ימים לפני שמת ממחסור בחומרים מזין ו / או גורמי גדילה.

טכניקה זו מייצרת תרבויות העיקריות של 50-100 נוירונים לכל צלחת מאזורים שתועדו פיסיולוגיים של גרעיני buccal וצדר. פרוטוקול זה שימושי לחוקרים לומדים היבטים של פיזיולוגיה של תא בודד בניסויים הדורשים ניסיון רב משכפל לכל בעלי חיים. הוא מייצר זוג תואם של תרבויות בשל ההפרדה האנטומי של תאי המטרה לhemiganglia ימין ועל שמאל, ומאפשר שתועלת ממחקרי הטיפול מתאים ותרבויות בקרה.

פרוטוקול מטרות מצרר buccal S (BSC) הנוירונים של גנגליון buccal ופלאורלי ventrocaudal (PVC) הנוירונים של גנגליון פלאורלי. תאים אלה הם גודל מתאים לכל הקלטות מתח תא וRobus התצוגהתגובות glutamatergic t. המתודולוגיה דנה מתאימה לרוב הגרעינים במערכת העצבים Aplysia.

Protocol

1. הכנת תא

1. ביום 1, לשקול ולהרדים בעלי חיים.
   1. שוקל 30 ק"ג חיה G-1. הרדימי במחזורי 5-10 בעלי חיים של 1:1 מי ים: MgCl איזוטוני. 6 שעות ₂ 0 במשך שעה 1 עם אוורור כגון משאבת אוויר אקווריום חשמלית עם airstone המצורף.
2. כדאי להכין ציוד לנתיחה.
   1. להרכיב מגש חיתוך נקי עם סיכות ישרות מנירוסטה, כגון סיכות בד. להרכיב כמה צלחות פטרי המכילות מי ים מלאכותי (ASW; ראה לוחות 1 ו -3) + פניצילין / סטרפטומיצין (P / S).
   2. יש מיקרוסקופ חשמל נמוך מוכן. יש מכשירי חיתוך נקיים מוכנים, כגון האף מצולעים ומלקחי כירורגיות בסדר, ובסדר ומספריים כירורגיות גדולים. לרסס את המכשירים עם 70% אלכוהול isopropol לפני השימוש ולאפשר לו להתייבש.
3. בעלי החיים עמדו על מגש לנתיחה.
   1. עמדת חיה צד למטה הגחון במגש לנתיחה. בעלי חיים פיןדרך קצוות של קיר גוף וגבולות parapodial, אך להימנע מזנב וראש, כדי לחשוף את פני השטח הגבי וחריץ איברי המין
   2. יש לשטוף את המשטח הגבי במים ברז קרים והאיטי בריצה. החל זרם אור של 70% אלכוהול isopropol מבקבוק לחיץ לאורך חריץ איברי המין ועל החלק העליון של הראש.
4. הפוך את החתך הראשוני.
   1. באמצעות מיקרוסקופ כוח נמוך (ראה טבלה 2) ובא לידי ביטוי באור כדי לראות את הנקודה שבה חריץ המין נובע ממרווח הקליפה הקדמי, מתיחות להחזיק עם מלקחיים מצולע האף קיפול של רקמה בצד השמאל של מקור זה, תוך חיתוך רדוד חור לאורך כל הדרך החלק, האזור השטוח של קיר גוף רק בצד ימין של חריץ איברי המין עם מספריים בזווית משובחים.
   2. Hemolymph יש לשים לב לשפוך מהחור, לעתים נושא עימה גנגליון בטן והבטן.
5. להרחיב את החתך.
   1. השתמש במספריים גדולים כדי להרחיב את החתך דואר anteriorly לנקודה בין rhinophores, תוך משיכת כלפי מעלה עם הלהב התחתון, כדי למנוע גניבת ציוד המעיים. האיברים הפנימיים יקויימו לשפוך מתוך החתך.
6. הסר את הגרעינים.
   1. למקם את המגש ולמקד את המיקרוסקופ באזור הראש.
   2. בעזרת מלקחיים נקיים ומספריים עדינים, הסר את גרעיני הראש על ידי ניתוק בנקודה אחת את העצבים היוצרים את גרעיני הראש לתוך טבעת סביב הוושט כדי להסיר צדר-דוושה ומוחות גרעיני כקבוצה.
   3. הסר את גנגליון buccal ששומר על צד הגחון של הוושט.
   4. הסר את גנגליון הבטן על ידי חיתוך 4 connectives העצב גדול שהנושא מגנגליון זה.
7. לבודד את הגרעינים של עניין.
   1. חתוך גרעיני ראש בנפרד, ומשאיר באורך של connectives מחובר זה לזה גנגליון של עניין ששווה לפחות הקוטר של גנגליון, זה יהיה לעכב אנזים יתר מערכת העיכולשל התאים של עניין בשלב הבא.
   2. לשים את כל גנגליון היעד באמצעות 2 שטיפות של ASW + P / S, נע בין שטיפות עם מלקחיים נקיים.
   3. אם מיקוד תאי PVC, השאר את hemiganglion צדר הזכות צמודה לhemiganglion הדוושה הימנית, ובאופן דומה לעזוב את hemiganglion צדר השמאלי מחובר לhemiganglion הדוושה השמאלית.
   4. השלך הגרעינים לא רצויים ושאר בעלי החיים על פי נוהג מקובל במחקר.
8. Enzymatically לעכל את הגרעינים.
   1. עבור כל גנגליון, להכין 1 מ"ל של תמיסת אנזים בהיקף של 3.75 מ"ג dispase, hyaluronidase 1 מ"ג ו0.3 גרם collagenase הסוג XI לכל מ"ל של ASW + P / S בצינור פוליפרופילן חרוטי 15 מ"ל.
   2. המקום נשטף הגרעינים בפתרון אנזים ולצרף את הכובע בחוזקה. מניחים את הצינור על צידו על שייקר סיבובי (ראה טבלה 2) במהירות איטית לשעה 13-5 בלילה כ 23 מעלות צלזיוס (טמפרטורת חדר).
9. הכןמנות התרבות.
   1. לפני microdissection (יום 2), להכין מנות התרבות במכסת מנוע בתרבית רקמת פולי-D-ליזין (PDL) מצופים. הוסף ~ 0.5 מ"ל PDL (0.2 מ"ג / מ"ל ​​של מים סטריליים) למרכז צלחת 35 מ"מ ל~ 25 דקות.
   2. יש לשטוף את PDL 3x עם מים סטריליים. לאפשר לו להתייבש. UV-לעקר את הצלחות.
10. יום 2 בודד תאי עצב.
    1. מלא מרכז 35 מנות מ"מ שהיו PDL מצופה וUV מעוקר עם כ 0.5 מ"ל של ASW + P / S כדי ליצור אי של מדיה בתוך הצלחת אחרת היבשה. ניתן לעשות זאת על הספסל, מחוץ למכסת מנוע בתרבית הרקמה. צלחת אחת צריכה להיות מוכנה לכל אשכול של תאים שמקורם hemiganglion.
    2. יש צלחת לנתיחה בקוטר 100 מ"מ מוכן שנעשתה על ידי sylgard ציפוי וריפוי משטח 5 מ"מ עמוק נתיחה, לבוש עם סיכות לנתיחה קנס של כמה מידות כדי לשמש כסיכות ובדיקות (ראה טבלה 3). יש לשטוף את המנה הזו עם 70% אלכוהול isopropol, ולאחר מכן עם ASW + P / S, ולבסוף Fill עם ASW + P / S.
11. הכן microdissection של הגרעינים מעוכל.
    1. יוצקים את התמיסה המכילה אנזים צדר-הדוושה וbuccal הגרעינים מתעכלים לתוך הצלחת לנתיחה.
    2. מניחים את הצלחת על הבמה של מיקרוסקופ כנגד משטח שחור תחת אור מוחזר.
    3. שימוש ברקמת החיבור המצורפת, להצמיד כל צד הגבי hemiganglion צדר-דוושה למעלה. הרקמות תהיה רכות ולא סובלניים של מתיחה.
12. Microdissect נוירונים PVC.
    1. באמצעות 2 זוגות של מלקחיים עדינים נקיים, ומחזיק את סיכת נתיחת קנס בזוג אחד של מלקחיים כמו בדיקה, לבודד את תאי PVC מhemiganglion פלאורלי. אנזים עיכול יהיה הוסר או שבורה מנדן רקמת חיבור המכסה את אשכול PVC, אך התאים ידבק אחד לשני.
    2. השתמש הבדיקה לנתק את התאים הללו מחיבור דוושת פלאורלי ^18, אז תן אשכול סתיו התא לחלק התחתון של הנתיחהמנה.
13. העבר את הנוירונים לצלחת התרבות.
    1. העבר את אשכול התא לצלחת תרבות 35 מ"מ שהוכנה על ידי בעדינות מתחנף האשכול לתוך קצה מעט אש מלוטשת חד פעמית זכוכית פיפטה פסטר, ולאחר מכן מחלק אותו לאט לתוך האי התקשורת בצלחת התרבות, להיות זהיר, כדי למנוע החדרת בועות אוויר לתוך פיפטה. חזור על בידוד של אשכול PVC של hemiganglion האחרים והמקום לתוך צלחת תרבות נפרדת.
14. Microdissect ולהעביר נוירונים BSC.
    1. להצמיד את צד הגחון גנגליון buccal למעלה, בזהירות כדי לא לפגוע בתאים של עניין. חזור על שלב 1.12 עם 2 צבירי תאי BSC של גנגליון buccal ^10.
    2. בידוד של נוירונים PVC וBSC יהיה לייצר 4 מנות התרבות המכילות צבירי נוירונים המכילות: 2 מנות אשכולות BSC ו -2 מנות המכילים צבירי PVC. מחק את שאר הגרעינים ומניחים בצד הצלחת לנתיחה 100 מ"מ.
15. Dissociate את צבירי התאים.
    1. מניחים צלחת תרבות המכילה תאים על הבמה של מיקרוסקופ כוח הנמוך ולהסיר את הכיסוי.
    2. לנתק את אשכול PVC בעדינות על ידי מצליף את תחתית צלחת התרבות בסמוך לאשכול התא עם סיכת נתיחת קנס שנערכה במלקחיים. מצליף הוא לחפור את הקצה של הסיכה לתוך הפלסטיק של תחתית הצלחת כאילו מנסה לחפור את כתם מפלסטיק. כאשר חיכוך עם הפלסטיק משחרר את נקודת הסיכה, גל כלי הקשה מופק באמצעות המדיום שמפרק הגוש הסמוך של תאים.
    3. תנועות 05-10 מאי תהיה צורך כמעט לנתק את התאים לחלוטין, אבל עדיף להשאיר את האשכולות קטנים של תאים ולא לקפיציים יותר מדי פן ייהרסו את התאים על ידי צרופה מכאני.
    4. החלפת מכסים ולחזור עם מנות התרבות אחרות.
16. אחסן תרביות תאים.
    1. מניחים את מנות התרבות המכילות איי תקשורת במרכזים שלהם עם תאים ניתק לתוךמיכל גדול המאפשר זרימת אוויר, כגון צלחת 25 מ"מ x 150 סיבוב פטרי פלסטיק, ומניח את המנה הזו בסט חממה עד 17 ° C.
    2. להתקין בתא צלחת פתוחה של מים כמקור ללחות. לעזוב ללא הפרעה בין לילה. התאים ידבק בציפוי פולי-D-ליזין במרכז הצלחת.
17. מנות תרבות מבול.
    1. ביום 3, בעדינות להציף את המנות עם 2.5 מ"ל של ASW + P / S. לבחון וספירת התאים באמצעות מיקרוסקופ תרבית תאים הפוך. חנות ב17 ° C החממה.

2. Electrophysiology

השיטה היא תיקון סטנדרטי הידוק שתואר בטקסטים רבים (למשל סאקמן ונהר, 1995) ^16. פרוטוקול זה יעבוד על תאי ≤ קיבול 100 PF, או תאים <קוטר 60 מיקרומטר בימים 3 ו 4 לפרוטוקול. תאים ללא תהליכים הם אופטימליים להקלטה. Considerat המיוחד הבאיונים להחיל:

1. ניתן לאכלס תאים גדולים יותר עם הגדרת התצורה במגבר 200B Axopatch מוגדר β = 0.1. הפעלה של זרמים גדולים מאוד עלולה לגרום לתאים כדי להימלט מהדק מתח. פתרונות ASW תחליף לתוכן מלח (לדוגמה: חלק של NaCl להחליף עם כלוריד N-methy-D-glucamine בלתי חדיר) עשויים לשמש כדי להפחית את כל משרעת נוכחית תא.
2. pipettes תיקון ורוסיליקט מלא סיבים משך על חולץ פיפטה וbackfilled אמצע הדרך עם פתרון תאי (ICS) בהיקף של 450 מ"מ KCl ומלחים אחרים (ראה טבלת מס '1) הם מתאים, וצריך להיות התנגדות של כ 0.5-1 MOhms. אם בידוד של זרמים יוניים ספציפיים הוא רצוי, למשל, Na ⁺ זרמים יכולים להיות מוחלפות בהיעדר זרמי K, K ⁺ בפתרון זה עם יונים אחרים כגון מדעי המחשב ^+. Cl ^- החלפה של מעגלים משולבים עם אניון impermeant גם אם מוצדק ICS טבעי יותר הוא רצוי^9.
3. התאים הם חזקים עם> 1 הקלטות ארוכות-HR אפשריים בטמפרטורת חדר. הקלטה היא אופטימלית בימים 3 ו -4 לפרוטוקול, המקביל ל 24-48 שעות בתרבות. לאחר 48 שעות יש קושי להרכיב חותמות gigaOhm, אולי בגלל הפירוט של glycocalyx על פני התא, ובעיות שנגרמו על ידי מהדק חלל תולדת תהליך. התאים שימושיים, עם זאת, ללימודים שאינם תיקון מהדק, כגון רעלים, שיכולים להתבצע ב< 14 ד.
4. ASW ופתרונות אחרים כדי להימכר מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, כמו גם פתרון תאי, צריכים להיות מסוננים באמצעות מזרק רכוב 0.2 מיקרומטר Acrodisk מסנן (לוח 3) לחסל את החלקיקים קטנים שמפריעים להיווצרות חותם gigaOhm.
5. הפחתת רגישות מתרחשת בעת שימוש באגוניסטים כגון D-Aspartate (D-ASP), ולכן ~ 1-2 דקות בין יישומים של אגוניסטים מומלץ. לעומת זאת, potentiation הוא נצפה לעתים קרובות עם appli חזר מהירקטיון של אגוניסטים כגון L-גלוטמט (L-Glu).
6. אגוניסט זרמים הופעלו כגון L-Glu ניתן ללמוד על ידי יישום אגוניסטים עם פיפטה Picospritzer. פיפטה זה משך את אותו הדבר כמו פיפטה את התיקון והוא מכיל אגוניסט בASW. כאשר קצה פיפטה זו ממוקם מתחת לצינור היציאה של מכשיר הפתרון האכיל את כוח הכבידה, ובזווית של ° 45 מצינור יצוא (איור 2F), אגוניסט יהיה שטף במהירות מתא, והפחתת הרגישות תהיה ממוזער. פיפטה אגוניסט צריכה ליצור זווית של 90 מעלות או יותר יחסית לפיפטה את התיקון.

תוצאות

את מיקומם של תאי העצב התחושתיים בתוך הגרעינים שממוקדים בפרוטוקול זה, הנוירונים BSC ו-PVC מוצגים באיור 1. הנוירונים BSC נמצאים ב2 אשכולות סגלגלים סימטריים בצד הגחוני של גנגליון buccal, את פני השטח שפונה מגוש buccal בגנגליון שלם (איור 1 א). הנוירונים PVC יצירת צבירי...

Discussion

טכניקות דיסוציאציה מתוארות כאן יניבו תרבויות נוירון חושיות המכילות 50-100 נוירונים בודדים וביניהם מספר קטן של תאי גליה ובלתי מזוהים אחרים. השלבים הקריטיים ביותר בפרוטוקול הם זמן הגרעינים יישארו בפתרון אנזים, והמצליף, ניתוק מצבירי התאים מתעכלים להתפרק האשכול לתוך תאי?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Artificial seawater ASW	Sigma-Aldrich	assorted	(mM): 417 NaCl, 10 KCl, 10 CaCl2 (2 H2O), 5MgCl2 (6H2O), 15 HEPES-NaOH, pH 7.6
Intracellular solution	Sigma	assorted	(mM): 450 KCl, 2.9 CaCl2 (2 H2O), 2.5 MgCl2 (6 H2O), 5 Na2ATP, 10 EGTA, and 40 HEPES-KOH, pH 7.4
Poly-D-lysine	Sigma	P6407
penicillin/streptomycin added to ASW at 1:100	Lonzo Walkersville, Inc.	17-603E	5,000 Units/ml penicillin plus 5,000 mg/ml streptomycin
Neutral dispase II	Roche Diagnostics	10165859001
hyaluronidase	Sigma-Aldrich	H4272
collagenase type XI	Sigma-Aldrich	C9407
L-Glutamate (L-Glu)	Sigma-Aldrich	49601-100G
D-Aspartate (D-Asp)	Sigma-Aldrich	11200-10G
N-methyl-D-aspartate (NMDA)	Biomol	100002-268
L-Asp	Sigma	A6683-25G
alpha-amino-3-hydroxyl-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid (AMPA)	Sigma	A6816-5MG
L-Glu R antagonists	various	various
agar
kynurenate	Sigma-Aldrich	61250
APV	Sigma-Aldrich	A5282
DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (NMDAR antagonist)
2-propanol	VWRSP	BDH1133
Chloriding solution	Sigma	assorted	25 g FeCl3 + 25 ml concentrated HCl + 50 ml H2O
Sylgard silicone 2-part polymer	World Precision Instruments (WPI)	SYL184	Provides pin-out surface for small dissection dishes
0-40x zoom magnification microscope for dissections	Wild
Techniquip 150 Watts Fiber Optic Illuminator	Microoptics of Florida	TQ FOI-150
RotoMix 50800 orbital mixer
Nikon Diaphot inverted phase-contrast microscope with 4x, 20x (optional) & 40x objectives	SR Research Ltd.	Eyelink II
Tektronix digital oscilloscope	SR Research Ltd.
pClamp 10 data acquisition and analysis software	Molecular Devices
PC with Windows XP or higher operating system	PC Solutions		Thinkserver with solid state hard drives (80GB) and low noise monitors
Flaming/Brown P87 micropipette puller	Sutter Instruments, Novato, CA
Axon Instruments Axopatch 200B clamp amplifier with a capacitance compensation range of 1-1000 pF; preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Axon instruments electrode holder assembly for Axopatch 200B preamplifier	Molecular Devices, Sunnyvale, CA	CV203BU
Digidata 1200 A/D converter	Molecular Devices, Sunnyvale, CA
Picospritzer, powered by N2 adjustable for pressure and duration	Parker Hannifin, Cleveland, OH
TMC Micro-G Vibration isolation table	Ametek
Faraday cage			custom manufacture
Burleigh Piezoelectric Clamshell Micromanipulators	Burleigh Instruments; Thorlabs		presently PCS-5000; -6000 series + mounts
Narishige M-152 manual manipulators (for perfusion system and picospritzer)	Narishige USA
Filament pipette glass,1.5 mm OD, 0.84 mm ID -	WPI	1B150-3
3 inch length
Ag/AgCl half cell	WPI	EP4
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon* Centrifuge Tubes	VWRSP	21008-918
Angled Scissors	Fine Science Tools	15006-09
Dumostar Fine forceps	Fine Science Tools	11295-00
35 mm falcon tissue culture dishes	VWRSP	25382-064
falcon 150 x 25 mm tissue culture dishes; 1013	VWRSP	1013	also can be made into small dissection dishes with sylgard
sylgard	WPI	SYL184
animal dissection tray	various
15 ml centrifuge tubes, 35-2097 BD Falcon	VWRSP	21008-918	For 6-bore gravity-fed perfusion system
Aluminum clips with screw hole ends	hardware store		For perfusion system
23 gauge needles (manually file off points)	VWRSP		For perfusion system
Polyethylene tubing 0.022"ID x 0.042"OD; 427411	Becton-Dickinson		For perfusion system
H-7 pipette stand/holder for microcap perfusion array	Narishige USA		For perfusion system
one-way valves			For perfusion system
Drummond Microcaps 1 μl	VWRSP		For perfusion system
18 gauge needles for suction (filed off points)
Polyethylene tubing	Cole Parmer	4.27436E+11
fine dissection pins	Fine Science Tools	26002-20
capillary tubes	Kimble 71900-100		fire-polished and U-shaped in a Bunsen burner flame and filled with 3% agar in ECS
modeling clay	craft store
dish holder for microscope stage with isolated ground bath			Custom manufacture
pasteur pipettes	VWRSP	14672-412
pipette bulbs	VWRSP	53283-911
acrodisk syringe filters	VWRSP	28144-040
thick-walled 1.5 mm diameter borosilicate filament glass	WPI	1B150F-3
High purity nitrogen cylinder and bifurcating regulator
Tables 1-3. Lists of Reagents, Materials, and Equipment.